乙酰转移酶及其用于产生类胡萝卜素的用图
【专利说明】乙醜转移酶及其用于产生类胡萝I、素的用途
[oow] 发明背景
[0002] 本发明设及新型乙酷转移酶、编码它的核酸序列、包含运些序列的表达构建体和 载体、用其转化的微生物和用于微生物法产生类胡萝l·素（如玉米黄质、邮青素、叶黄素或 β-隐黄素）的方法。
[0003] 类胡萝h素是颜色在黄色至红色范围内的有机色素，其由一些生物包括光合生物 (例如，植物、藻类、蓝藻）和一些真菌天然产生。
[0004] 类胡萝h素如叶黄素、玉米黄质或邮青素是在人和牲畜饮食中作为色素物质和维 生素A衍生物的前体的非常重要的添加剂。此外，类胡萝h素具有促进健康的作用如增强 免疫应答，而且由于其抗氧化剂特性的原因具有预防癌症的作用，运使其用作感兴趣的保 健品（nutraceutical)。因此用于制备类胡萝h素的经济方法和具有增加的类胡萝l·素含 量的食品至关重要。用于制备类胡萝l·素的特别经济的方法是生物技术方法，其利用来自 产生类胡萝l·素的生物的类胡萝l·素生物合成的生物合成基因和蛋白。 阳00引发明概述
[0006] 本发明设及分别包含氨基酸序列沈QIDN0:5、SEQIDN0:6、SEQIDN0:7、SEQID N0:8或SEQIDNO: 14的蛋白或多肤，或源自运些序列通过氨基酸的取代、插入或缺失并与 序列沈QIDNO: 5、SEQIDNO:6、SEQIDNO: 7、SEQIDNO:8 或沈QIDNO: 14 在氨基酸水 平具有至少50%同源性的序列。
[0007] 发明人令人惊讶地发现将根据本发明的编码乙酷转移酶的基因并入能够产生特 定的包含至少一个径基的类胡萝l·素（例如，玉米黄质或邮青素）的宿主细胞可改变宿主 细胞中的类胡萝l·素概貌，从而产生乙酷化形式的类胡萝l·素，与未用编码根据本发明的 蛋白或多肤的基因转化的菌株相比，其允许细胞中类胡萝l·素化合物（乙酷化加非乙酷化 形式）的积累增加/增强。
[0008] 本发明还设及编码本发明多肤的分离多核巧酸、核酸构建体、重组表达载体和包 含所述多核巧酸的重组宿主细胞，并设及产生所述多肤的方法。
[0009] 本发明还提供改进的系统，特别是用于生物产生类胡萝h素的转化微生物，其中 表达至少一种具有乙酷转移酶活性的异源多肤。
[0010] 在一个优选的实例中，本发明提供产生一种或多种类胡萝l·素的含油真菌（包 括，例如，酵母）。本发明还提供构建运种酵母和真菌的方法，使用运种酵母和真菌W产生类 胡萝l·素的方法，和制备含类胡萝l·素的组合物（如食品或饲料添加剂，或营养补充剂）的 方法、在运种含油酵母或真菌中产生的类胡萝l·素的使用。特别是，本发明提供用于生成包 含编码本发明多肤的多核巧酸的酵母和真菌的系统和方法。
[0011] 序列表概要
[0012] SEQIDN0:1是编码来自酿酒酵母（S.cerevisiae)的乙酷转移酶ATF1的未优化 DNA序列。
[0013] SEQIDN0:2是编码来自贝酵母仅bayanus)的乙酷转移酶ATF1的未优化DNA序 列。
[0014] 沈QIDN0:3是编码来自S.ndkatae的乙酷转移酶ATFl的未优化DM序列。
[0015] 沈QIDN0:4是编码来自S.ku化iavzevii的乙酷转移酶ATFl的未优化DNA序列。
[0016] 沈QIDNO:5是从沈QIDNO: 1推导的氨基酸序列。
[0017] 沈QIDNO:6是从沈QIDNO:2推导的氨基酸序列。
[0018] 沈QIDNO:7是从沈QIDNO:3推导的氨基酸序列。
[0019] 沈QIDNO:8是从沈QIDNO:4推导的氨基酸序列。
[0020] SEQIDN0:9是编码来自酿酒酵母的乙酷转移酶ATFl的优化用于在解脂耶氏酵母 (Yarrowialipoidica)中表达的DNA序列。
[002USEQIDN0:10是编码来自贝酵母乙酷转移酶ATF1的优化用于在解脂耶氏酵母中 表达的DNA序列。
[0022] SEQIDNO: 11是编码来自S.ndkatae乙酷转移酶ATF1的优化用于在解脂耶氏酵 母中表达的DNA序列。
[0023] 沈QIDNO: 12是编码来自S.ku化iavzevii乙酷转移酶ATF1的优化用于在解脂耶 氏酵母中表达的DNA序列。
[0024] 沈QIDNO: 13是编码来自S.arboricolus乙酷转移酶ATF1的未优化DNA序列。 阳0巧]沈QIDNO: 14是从沈QIDNO: 13推导的氨基酸序列。
[0026]SEQIDNO: 15是编码来自S.arboricolus乙酷转移酶ATF1的优化用于在解脂耶 氏酵母中表达的DNA序列。 W27] 沈QIDN0:16是编码来自贝酵母乙酷转移酶ATF1的使用P.denitrificans PD1222密码子表优化用于在Paracoccuszeaxanthinifaciens中表达的DNA序列。 W2引 沈QIDN0:17编码来自酿酒酵母乙酷转移酶ATF1的使用P.denitrificans PD1222密码子表优化用于在Paracoccuszeaxanthinifaciens中表达的DNA序列。
[0029] SEQID側:18是编码来自酿酒酵母乙酷转移酶4了。1的移除内部炯61位点的未优 化DNA序列。
[0030] 定女
[0031] 分离的多肤：术语"分离的多肤"意指相对于天然发现的多肤由人工进行修饰的多 肤。在一个方面中，所述多肤为至少1 %纯，例如，至少5%纯、至少10%纯、至少20%纯、至 少40 %纯、至少60 %纯、至少80 %纯，和至少90 %纯，如通过SDS-PAGE确定的。
[0032] 基本上纯的多肤：术语"基本上纯的多肤"意指制备物，其包含按重量计至多 10%、至多8%、至多6%、至多5%、至多4%、至多3%、至多2%、至多1 %和至多0. 5%的 与所述制备物天然或重组结合的其他多肤材料。优选地，所述多肤按制备物中存在的全部 多肤材料的重量计为至少92%纯，例如，至少94%纯、至少95%纯、至少96%纯、至少97% 纯、至少98%纯、至少99%纯、至少99. 5%纯，和100%纯。本发明的多肤优选为基本上纯 的形式。运可例如通过由已知的重组方法或由经典的纯化方法制备多肤来实现。
[0033] 序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核巧酸序列之间的相关性通过参数"序 列同一'性"描述。
[0034] 就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性的程度使用如在EMBOSS包 (EMBOSS:TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite,Rice等,Trends Genet. 2000, 16:276-277)的Needle程序，优选3. 0. 0或W后的版本中执行的 化edleman-Wunsch算法（Needleman和Wunsch, 1970，J.Mol.Biol.48:443-453)来确定。使 用的任项参数为缺口开放罚分10、缺口延伸罚分0. 5和邸L0SUM62度L0SUM62的EMBOSS版 本）取代矩阵。使用标记"最长同一性"的化edle输出（使用-nobrief选项获得）作为 百分比同一性并计算如下：
[0035] (相同的残基xl00)/(比对长度-比对中缺口的总数）
[0036] 就本发明而言，两个脱氧核糖核酸序列之间的序列同一性的程度使用如在EMBOSS 包（EMB0SS:TheliuropeanMole州larBiologyOpenSoftwareSuite,I?ice等，2000,见上 文）的化edle程序，优选3. 0. 0或W后的版本中执行的化edleman-Wunsch算法（Needleman 和Wunsch，1970,见上文）来确定。使用的任选参数为缺口开放罚分10、缺口延伸罚分0.5 和邸NA即化(NCBINUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩阵。使用标记"最长同一性"的化edle 输出（使用-nobrief选项获得）作为百分比同一性并计算如下：
[0037] (相同的脱氧核糖核酸xl00)/(比对长度-比对中缺口的总数）
[0038] 片段：术语"片段"意指在成熟多肤的氨基和/或簇基末端缺失一个或多个（几 个）氨基酸的多肤，其中所述片段具有乙酷转移酶活性。
[0039] 等位变体：术语"等位变体"意指占据相同染色体基因座的基因的两种或多种可替 换形式中的任何。等位变异通过突变自然出现，且可导致种群内的多态性。基因突变可为 沉默的（在编码的多肤中无变化）或可编码具有改变的氨基酸序列的多肤。多肤的等位变 体是由基因的等位变体编码的多肤。
[0040] 分离的多核巧酸：术语"分离的多核巧酸"意指相对于天然发现的多核巧酸由人 工进行修饰的多核巧酸。在一个方面中，所述分离的多核巧酸为至少1%纯，例如，至少5% 纯、至少10%纯、至少20 %纯、至少40%纯、至少60%纯、至少80%纯、至少90 %纯和至少 95%纯，如通过琼脂糖凝胶电泳确定的。所述多核巧酸可W是基因组、cDNA、RNA、半合成、合 成来源的，或其任何组合。
[0041] 基本上纯的多核巧酸：术语"基本上纯的多核巧酸"意指无其他外来或不想要的核 巧酸且其处于适用于基因工程多肤产生系统中的形式的多核巧酸制备物。因此，基本上纯 的多核巧酸包含按重量计至多10%、至多8%、至多6%、至多5%、至多4%、至多3%、至多 2%、至多1%和至多0. 5%的与其天然或重组结合的其他多核巧酸材料。然而，基本上纯的 多核巧酸可包括天然存在的5'和3'非翻译区，如启动子和终止子。优选地，所述多核巧酸 为按重量计至少90%纯，例如，至少92%纯、至少94%纯、至少95%纯、至少96%纯、至少 97%纯、至少98%纯、至少99%纯，和至少99. 5%纯。本发明的多核巧酸优选为基本上纯的 形式。
[0042] 编码序列：术语"编码序列"意指直接指定多肤的氨基酸序列的多核巧酸。编码序 列的边界通常由开放阅读框确定，其通常WATG起始密码子或可替换的起始密码子如CTG 和TTG开始并W终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可为DNA、cDNA、合成的或重 组的多核巧酸。
[0043] cDNA:术语"cDNA"意指可由自真核细胞获得的成熟、剪接的mRNA分子通过反转录 制备的DNA分子。cDNA缺乏可存在于相应基因组DNA中的内含子序列。原始的初级RNA转 录物是mRNA前体，其通过一系列步骤，包括剪接进行加工，然后作为成熟的剪接的mRNA出 现。
[0044] 核酸构建体：术语"核酸构建体"意指单链或双链核酸分子，其分离自天然存在的 基因，或经修饰W自然界中本不存在的方式包含核酸的区段，或其可为合成的。当核酸构建 体包含表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语"表达盒"同义。
[0045] 调控序列：术语"调控序列"意指用于表达编码本发明多肤的多核巧酸所需的全部 组件。每个调控序列对于编码所述多肤的多核巧酸可为天然或外来的，或调控序列彼此间 可为天然或外来的。所述调控序列包括但不限于前导序列、多聚腺巧酸化序列、前肤序列、 启动子、信号肤序列和转录终止子。最少的情况，所述调控序列包括启动子，和转录和翻译 终止信号。出于引入促进调控序列与编码多肤的多核巧酸编码区连接的特定限制位点的目 的，所述调控序列可与接头一起提供。
[0046] 可操作连接：术语"可操作连接"意指构型，其中将调控序列置于相对于多核巧酸 的编码序列适当位置使得调控序列指导编码序列的表达。
[0047] 表达：术语"表达"包括设及多肤产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修 饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
[0048] 表达载体：术语"表达载体"意指线性或环状DNA分子，其包含编码多肤的多核巧 酸并与提供其表达的额外核巧酸可操作连接。
[0049] 宿主细胞：术语"宿主细胞"意指对用包含本发明多核巧酸的核酸构建体或表达载 体的转化、转染、转导、接合等易感的任何细胞类型。术语"宿主细胞"涵盖亲代细胞的任何 后代，其由于在复制过程中发生突变而与亲代细胞不同。
[0050] 变体：术语"变体"意指具有乙酷转移酶活性的多肤，其在一个或多个（几个）位 置包含改变（即一个或多个（几个）氨基酸残基的取代、插入和/或缺失）的。取代意指 用不同氨基酸替代占据位置的氨基酸，缺失意指去除占据位置的氨基酸的，而插入意指在 占据位置的氨基酸邻近添加1-3个氨基酸。
[00川发明详述
[0052] 下文的乙酷转移酶意指根据本发明的蛋白或酶，其将乙酷基团转移至类胡萝h素 或包含至少一个径基的类胡萝l·素衍生物（例如至玉米黄质或邮青素），其包含氨基酸序 列沈9 10側:5、569 10側:6、569 10側:7、569