一种组蛋白脱乙酰化酶及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体设及一种组蛋白脱己酷化酶及其编码基因和 应用。
【背景技术】
[0002] 植物在生长发育过程中常常会受到干旱、高盐、极端温度等多种不利环境条件的 影响，该些不利因素在很大程度上限制着农作物的产量和分布，成了许多地区农业发展的 障碍。尽快培育出抗逆的作物品种并应用于生产已经成为农业科学技术研究攻关的重要方 向。
[0003] 基因工程技术通过改变一个或几个基因的活性来提高植物的抗逆性，它是在基因 水平上进行的，具有精确性和稳定性，提高了育种的效率，极大地加快了育种进度。随着分 子生物学与基因工程技术的日趋成熟和迅猛发展，通过基因工程手段改良作物的抗性已经 受到越来越广泛的关注和重视。
[0004] 水稻是我国的主要粮食作物之一，提高水稻的抗逆性对保障我国粮食产量稳定具 有重要意义。干旱和高盐是水稻种植中最为常见的逆境，培育抗逆水稻一直是水稻品种改 良的主要目标之一。利用基因工程该一分子育种技术，将抗逆基因转入当前广泛应用的优 良水稻品种中，从而提高其抗逆性，是水稻抗逆育种的有效途径之一。
[0005] 在真核生物细胞核中，基因组DNA由组蛋白W及其它一些蛋白共同组成了核蛋白 复合物，也就是常说的染色质。染色质的结构是高度动态的，并且能够被与其相关的一些蛋 白所调控。目前已知水稻中含有18个组蛋白脱己酷化酶成员，可分为3大亚家族；RPD3/ HDA1亚家族14个成员、SIR2亚家族2个成员和皿2亚家族2个成员（化，etal. 2007)。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种可用于提高植物耐盐和抗旱的组蛋白脱己酷化 酶0SHDA704及其编码基因0SHDA704。
[0007] 所述的组蛋白脱己酷化酶化HDA704,其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[000引所述的编码上述组蛋白脱己酷化酶化HDA704的组蛋白脱己酷化酶基因 化HDA704,其特征在于，其序列如SEQIDNO. 1的第93位到1964位碱基所示。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种含有所述的组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704的 重组表达载体。
[0010] 所述的表达载体为任意一种可用于农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微 弹攻击的载体，如pCAMBIA系列载体、pBI系列载体、pBin系列载体或Gateway?系列载体。
[0011] 本发明的第=个目的是提供组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704在增强植物耐盐和 抗旱中的应用。
[0012] 所述的应用优选为在培育耐盐和抗旱植物品种中的应用。
[0013] 优选，所述的应用是将所述的组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704导入植物细胞、组 织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，使所述的组蛋白脱己酷化酶基 因化HDA704在植物中表达，得到耐盐和抗旱的转基因植物。进一步优选，所述组蛋白脱己 酷化酶基因化HDA704是通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官的。
[0014] 所述的植物为水稻。
[0015] 本发明克隆得到的属于水稻组蛋白脱己酷化酶家族RPD3/HDA1亚家族的 化HDA704基因，其作为正调控因子参与了水稻对高盐和干旱胁迫的应答过程，通过转基因 及功能鉴定证实超量表达化HDA704基因能提高水稻对高盐和干旱的抗性，化HDA704基因 在培育抗逆植物尤其是水稻新品种方面具有非常重要的理论及应用价值。
【附图说明】
[0016] 图1是50yMABA、300mM化C1和20%口66处理化、比、化和化后〇3皿4704基因 的表达模式。
[0017] 图2是pCUbiO1301植物双元表达载体图。
[0018] 图3是用化HDA704的全长开放阅读框引物对化HDA704超表达转基因植株基因组 DNAPCR的电泳图。
[0019]图4是野生型植株WT和超表达转基因株系0X1、0X4、0X6、0X14和0X26中0SHDA704 的表达水平检测，HDA7040X1、HDA7040X4、HDA7040X6、HDA7040X14 和HDA7040X26 分别代表 超表达转基因株系0X1、0X4、0X6、0X14和0X26。
[0020] 图5是野生型种子WT和化HDA704超表达种子在MS培养基上（control)、添加有 终浓度为5uMABA、150mM化C1和15%阳G的MS培养基上的种子萌发趋势。
[0021] 图6是苗龄两周野生型植株WT和化HDA704超表达0X14和0X26植株在标准营养 液（control)、含150mM化C1和20%阳G营养液处理下的表型。
[0022] 图7是苗龄两周野生型植株WT和化HDA704超表达0X14和0X26植株在含150mM 化Cl和20%PEG营养液处理3天恢复7天的存活率统计，其中HDA7040X14和HDA7040X26 分别代表超表达转基因株系0X14和0X26。
[0023] 图8是苗龄两周野生型植株WT和化HDA704超表达0X1和0X14植株，离体叶片 的相对失水率测定，其中HDA7040X14和HDA7040X26分别代表超表达转基因株系0X14和 0X26。
【具体实施方式】
[0024] W下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0025] 下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进行。如J.萨姆布鲁克等 《分子克隆实验指南》、F.奥斯伯等《精编分子生物学实验指南》中所述条件，或按照所用产 品生产厂商的使用说明。
[0026] 实施例中所用水稻中花11 〇3ryzaSativaL.)种子购于广东省农科院；TriZol Reagent购自Invitrogen公司，其货号为；15596026 ;逆转录酶M-MLV购自Promega公司， 其货号为；M1701;pGEMT载体购自Promega公司，其货号为；A1360 ;标准营养液为国际水 稻所标准营养液；LB、YM、AAM培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分 子克隆实验指南》。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径得 到。
[0027] 实施例1 ;化HDA704基因的克隆
[002引取水稻中花11的幼苗叶片部位，用TriZolReagent提取叶片总RNA，采用琼脂 糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的纯度及量，取1yg的总RNA做起始逆转录反 应，所采用的逆转录酶为M-MLV，逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。W逆转 录产物为模板，采用引物；F;GATCGCCCTCCAGATTGCGT，R;ACATCAGGATCATTCGACAG进行常规 PCR扩增，PCR反应条件为；94°C4min;94°C30sec，55°C30sec，72°C90sec，30 个循环； 72°C10min。采用琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，连接于pGEMT载体上，连接反应；PCR产 物 7yl，pGEMT载体lyl，3UT41igaselyiaOXbufferlyl，共lOyl体积，16°C连 接化。取5yl连接产物，转到大肠杆菌D册a中，加800mlLB，复苏比，涂于含lOOmg/ L氨节抗生素（Amp)的LB平板上（已经涂布X-gal/IPTG)，37°C过夜。挑取白色克隆，在 LB+Amp(l00mg/L)液体培养基中扩增培养，送交测序。其核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示， 开放阅读框从第93位到1964位碱基，长1872bp，将此开放阅读框命名为组蛋白脱己酷化酶 基因化HDA704,其编码623个氨基酸，其序列如SEQIDNO. 2所示，将该蛋白命名为组蛋白 脱己酷化酶化HDA704。
[0029] 实施例2 ;组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704在逆境胁迫下的表达模式分析
[0030] 1.胁迫处理；将水稻中花11种子浸泡催芽后，在发芽盒内用标准营养液水培 生长，在25°C，1化光照/她黑暗光周期条件下的光照培养室中培养两周，光照强度为 lOOOOlux。进行如下的胁迫处理：外源ABA胁迫；50uMABA处理化，比，化和化；高盐胁 迫；300mM化C1处理化，比，化和化；模拟干旱处理；20%PEG处理化，比，化和化。将处 理的植株用液氮速冻后于-80°C低温保存。
[0031] 2.RNA提取；用Trizolreagent进行试验材料的总RNA提取，整个操作过程严格 按照Trizolreagent的RNA提取流程说明进行。
[0032] 3.逆转录：采用M-MLV逆转录酶逆转录mRNA成cDNA第一链，方法按照试剂说明 书进行。
[003引 4.实时定量RT-PCR;根据组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704的核巧酸序列，设计W下引物对；qHDA704-F;TTGCTCCAGACATCACCATC;qHDA704-R;GACGCCATCCTAGAATATCCAG。将 所得cDNA稀释5倍后作为模板，进行实时定量RT-PCR反应。反应体系及程序参照SYBR? PremixExhq?H(TaKaRa)说明书，在AB口500Real-timePCR仪上进行反应。每个反 应设置3个重复，所得数据使用ABI7500Real-timePCRsystem软件进行处理。
[0034] 5.结果分析：水稻中花11植株中的组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704的表达量， 在50uMABA处理后在比先下降后逐渐上升；300mM化C1处理后在比有稍微的下降，3h 和化后明显的上升；20%PEG处理后成明显上升的趋势；结果如图1所示。结果表明水稻 中组蛋白脱己酷化酶基因化皿A704受盐和干旱的诱导后表达量明显上升，参与水稻抗盐、 抗旱胁迫应答调节过程。
[0035] 实施例3 ;转组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704水稻的获得和鉴定
[0036] 1.目的基因组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704的超表达载体的构建
[0037] 根据组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704全长设计引物，W水稻中花11的cDNA为模 板，高保真扩增获得组蛋白脱己酷化酶基因化HDA704全长，同时在两条引物的5'端加上 BamHI酶切位点，扩增引物为HDA7040X-F：CGGGATCCATGGCGTCTGATATGAGGTC(下划线部分 为BamHI酶切位点）；HDA7040X-R:CGGGATCCTTAGGGCCCTGCTTCATCAT(下划线部分为BamH I酶切位点）。扩增产物经BamHI酶切纯化后，回收目的DM片段（1888bp);用BamHI酶 切表达载体pCUbi01301 (含有化iquitinl启动子），T