小麦组蛋白去乙酰化酶基因TaHD2C及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种组蛋白去乙酰化酶基因及其应用，尤其涉及一种小麦组蛋白去乙 酰化酶基因TaHD2C及其应用，属植物基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 高等植物生命周期由营养生长和生殖生长两个阶段组成，其转换过程称为花期 转换（或称开花诱导）。该过程受植物自身遗传和外界环境等因素影响。拟南芥开花诱 导主要受四种途径的控制：即光周期途径、春化途径、赤霉素途径和自主途径（Andreset al. , 2012) 〇
[0003] 植物的生长与季节相关，表现在受日照长短（光周期）的调控（Langet al.，1952)。这种植物对黑白昼夜交替变化节律的响应称为光周期现象。与光周期相关的 关键基因主要有：GIGANTEA(GI)，FLAVINKELCHFBOX1(FKF1)，C0NSTANS(C0)，FLOWERING LOCUST(FT)等（Putterill.etal.，1995;Fowleretal.，1999)〇
[0004] 赤霉素（Gibrellin，GA)是植物激素的一种，可在生长发育的不同阶段（如：种子 萌发、植株伸长、叶形、叶绿素含量和花期转换等过程）调控植物的生长发育。GA主要通过 活性GA和GA的负调控因子DELLA蛋白两个信号分支途径来影响花的发育。其中，活性GA 分支途径：可在花发育的早期诱导S0C1表达进而促进LFY的表达。GA亦可促进miR159及 其靶基因MYB33的表达（Achardetal.，2004)，后者可调控LFY的表达。DELLA蛋白分支途 径：GA促进DELLA蛋白的降解从而解除对上述基因的抑制，促进开花；DELLA蛋白中的RGA， RGL1和RGL2在花发育过程中起主要作用。
[0005] 组蛋白去乙酰化酶（HDACs)是一种古老的酶家族成员，在动植物、原始细菌和 真菌中均有发现。植物中的HDACs划分为RPD3/HDA1、HD2和SIR2三个家族（Pandeyet al.，2002)。其中，HD2(HD-tuinsfamily)家族为植物所特有，已报道的HDACs有小麦组蛋 白去乙酰化酶2(HDAC2)，其基因命名为TaHDAC2,DQ656602. 1。但在申请人利用盐胁迫基 因芯片深入研究中时发现，采用嵌套PCR技术扩增得到的cDNA，经Blast比对分析，其与已 知TaHDAC2有一个碱基对的差异，且蛋白序列出现差异，检索该cDNA功能以及小麦组蛋白 去乙酰化酶基因功能的相关文献，未见其具有调控植物开花期转换或产量变化等功能的报 道。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种小麦组蛋白去乙酰化酶基因 TaHD2C及其应用。
[0007] 本发明所述的小麦组蛋白去乙酰化酶基因TaHD2C，其特征在于：所述基因cDNA的 核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示；所述基因cDNA编码的氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。
[0008] 本发明所述小麦组蛋白去乙酰化酶基因TaHD2C在调控植物过表达系花期转换中 的应用。
[0009] 本发明所述小麦组蛋白去乙酰化酶基因TaHD2C在通过花枝数目的调控实现影响 转基因植物产量中的应用。
[0010] 其中：所述植物优选是拟南芥或普通小麦。
[0011] 上述小麦组蛋白去乙酰化酶基因TaHD2C是申请人利用盐胁迫基因芯片研究发 现，并采用嵌套PCR技术进行两轮PCR扩增得到。该基因cDNA的核苷酸序列是一条全长为 1310bp的cDNA，其编码的氨基酸序列由311个氨基酸组成，经Blast比对分析，发现其与 一个已登出的小麦序列（TaHDAC2) (DQ656602. 1)有一个碱基对的差异，且蛋白序列出现差 异，故确定为新的基因，并将该基因命名为小麦组蛋白去乙酰化酶基因TaHD2C。
[0012] 具体包括，申请人根据小麦山融3号（SR3)全长数据库信息，分别设计引物，以SR3 根和叶的混合cDNA为模板，扩增全长序列，在拟南芥中进行功能验证。实验证明，所述小麦 组蛋白去乙酰化酶基因TaHD2C可使拟南芥过表达系开花延迟，且不受光周期影响；与野生 型相比，过表达系花期株型的花枝数目明显减少，产量降低。以此确定含有本发明所述基因 的转基因植株可以实现对花期转换及花期株型（即花枝数目减少）的调控，达到对产量的 调控的功能。
[0013] 综上，本发明的有益效果体现在：本发明克隆得到小麦组蛋白去乙酰化酶基因 TaHD2C，通过根瘤农杆菌介导的浸花法将该基因转入拟南芥。实验确认，TaHD2C基因过表 达后明显推迟了植物的开花时间，并通过调控拟南芥花期转换及花期株型发育来控制拟南 芥产量。该结果有望在缩短农作物育种年限及产量提升上提供帮助和支持，进一步为作物 品质改良和新品种的选育奠定理论基础。
【附图说明】
[0014] 图1 :长日照下，生长29d的拟南芥过表达系植株生长状态及叶片数目。
[0015] 其中0E1和0E2 :拟南芥过表达系1和2;WT:野生型拟南芥对照。
[0016] A:长日照下，生长29d的拟南芥过表达系植株，其中，WT已抽薹，过表达系未抽 薹；
[0017] B:长日照下，生长29d的过表达系叶片数目，过表达系叶片数明显多于野生型。
[0018] 图2 :短日照下，生长62d的拟南芥过表达系（0E1和0E2)及野生型亲本（WT)。
[0019] 其中0E1和0E2 :拟南芥过表达系1和2;WT:野生型拟南芥对照。显示WT已抽薹， 过表达系未抽薹。
[0020] A:野生型亲本及过表达系俯视图。B:野生型亲本及过表达系直视图。
[0021] 图3 :拟南芥过表达系光周期途径相关marker基因Real-timePCR表达图谱。
[0022] 其中0E1和0E2 :拟南芥过表达系1和2;WT:野生型拟南芥对照。
[0023] A:光周期途径相关基因FTmRNA转录水平下调极显著；AP1、LFY、S0C1基因表达量 下调与WT呈显著差异。B:转录水平，光周期途径相关基因C0、CIB1、FKF1和GI的转录水 平没有明显的上调或下调，PIF4的转录显著下调。C:转录水平，光周期途径相关基因CCA1、 LHY和T0C1在过表达系与野生型没有显著差异。
[0024] 图4 :拟南芥过表达系自主和春化途径相关marker基因Real-timePCR表达图谱。
[0025] 其中0E1和0E2 :拟南芥过表达系1和2;WT:野生型拟南芥对照。
[0026] A:春化途径相关FLC基因表达；B:花器官发育相关AP2_likeSNZ基因的表达；C: 春化途径相关基因VRN2,VIN3变化不明显；D:自主途径相关基因FPA、FY、FLD转录水平没 有明显变化，PRP39转录显著上调。
[0027] 图5:拟南芥过表达系赤霉素合成及转导途径相关marker基因表达。
[0028] 其中0E1和0E2:拟南芥过表达系1和2;WT:野生型拟南芥对照。
[0029]A:转录水平上，赤霉素合成与代谢相关的GA3oxl显著上调，GA20oxl显著下调，说 明GA合成水平的升高；B:赤霉素受体GIDla基因转录调控；C:赤霉素信号转导途径的负调 控因子RGL1、RGL3和RGA基因的转录显著下调，结果显示，DELLA蛋白在转录水平受到抑制。
【具体实施方式】
[0030] 以下实施例用于阐明本发明，不用来限制本发明的范围。实例中未注明的具体实 验方法，均可按照常规方法进行，或按产品制造生产厂商的使用说明操作。
[0031] 实施例1、小麦组蛋白去乙酰化酶基因TaHD2C的克隆
[0032] 1. 1小麦RNA提取
[0033] 1)将30_50mg小麦组织材料放入液氮预冷的研钵中，在液氮中充分研磨成粉末；
[0034] 2)将粉末状RNA提取样品小心快速的转移到液氮预冷的2ml离心管中，加入适量 的1. 5mlInvitrogen公司的TRIzol提取液，融化后，用加样枪反复吸吹，剧烈振荡混勾样 品，使样品充分裂解，室温放置5分钟；
[0035] 3) 12, 000g 4Γ离心5分钟；
[0036] 4)小心吸取上清液，移入新的2ml离心管中；
[0037] 5)加入0· 2ml氯仿（chloroform)，盖紧离心管盖，用力震荡，室温静置10min;
[0038] 6) 4°C，12, 000g离心 15min;
[0039] 7)从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层（无色的上清液、中间的白 色蛋白层及带有颜色的下层有机相）。吸取上清液转移至另一新的1.5ml离心管中，加入 500μ1的异丙醇（1:1体积），充分混匀，_20°C，沉淀30min或过夜；
[0040] 8) 4°C，12,OOOrpm离心 10min，小心弃去上清液；
[0041] 9)RNA沉淀用1ml的75%乙醇洗涤。4°C，8000rpm离心10min收集沉淀；
[0042] 10)重复用75 %乙醇洗涤一次RNA沉淀；
[0043] 11)去上清，RNA沉淀于无菌操作台上瞭干约10_15min，RNA略显透明，加入适当体 积（30-50μ1)的RNase-free水