一种控制玉米雄性生育力的ZmMs7基因序列及其编码蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种控制玉米雄性生育力的基因序列及其蛋白编码序列，属于基因工 程领域。
【背景技术】
[0002] 植物雄性不育（malesterility,MS)是一种高等植物中普遍存在的生物学现象， 指在雌雄同株植物中，雄蕊发育异常，不能产生有功能的花粉，但雌蕊发育正常并能受精结 实，并且这种雄性不育性状可在后代中遗传。植物的雄性不育按照其遗传方式可分为细胞 核雄性不育、细胞质雄性不育及核质互作不育。其中，细胞核雄性不育表现为核遗传，因而 其不育性表现稳定，在生产实践中具有巨大应用价值。通过植物生物技术可以创制一种保 持和繁殖玉米雄性不育系的技术体系，从而实现玉米不育化杂交育种和制种。在杂交玉米 制种过程中，利用玉米雄性不育系可以节省大量人工去雄成本并保证种子纯度。
[0003] 本发明提供了一种控制玉米雄性生育力的基因序列及其编码的蛋白质序列，该基 因的功能缺失会造成玉米的雄花败育，由此可以生产新的雄性不育材料，在农业生产上有 十分重要的应用价值。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种新的控制玉米雄性生育力基因及其编码的蛋白序列，所述 基因是一种玉米雄穗特异性表达基因，所述基因功能的缺失会特异性导致玉米的雄花不 育。
[0005] 本发明第一个发明目的是：提供一种控制玉米雄性生育力的基因，其特征在于，是 选自如下1)或2)或3)或4)或5)所示的DNA分子： 1) SEQIDNO. 1所示的DNA分子(克隆自玉米自交系B73的基因组DNA); 2) SEQIDN0. 2所示的DNA分子(克隆自玉米自交系B73的cDNA); 3) 在SEQIDNO. 1基础之上经过一至数个碱基替换和\或一至数个碱基的插入和 \或缺失以及大片段的核苷酸序列插入\缺失\移位\倒位所形成能够影响玉米生育能力 的DNA分子； 4) 在0.1XSSPE(或0.1XSSC)、(X1%SDS(w/v)的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜， 能够与SEQIDN0. 2的DNA分子杂交且编码植物花粉发育相关蛋白的DNA分子； 5) 与SEQIDN0. 2的DNA分子具有85%以上的同源性且编码植物花粉发育相关蛋白 的DNA分子。
[0006] 本发明第二个发明目的是：提供上述基因编码的植物花粉发育相关蛋白。在一个 实施方案中，所述基因编码如下1)或2)所述的蛋白质： 1)SEQIDN0. 3所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 2) 将SEQIDN0. 3经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有 植物雄性育性相关活性的蛋白质。
[0007] 本发明第三个发明目的是：提供在花器官中调节所述基因序列转录表达的启动 子。在一个实施方案中，所述启动子序列如SEQIDN0. 4所示DNA序列，该序列具有在花 器官中特异启动如SEQIDN0. 1、2所述基因序列转录的功能。
[0008] 本发明第四个发明目的是：提供含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细 胞系或重组菌。
[0009] 本发明第五个发明目的是：提供上述基因在用于转基因改良作物的用途； 在一个实施方案中，所述基因用于诱导作物植株雄性不育，以便导入外源基因以获得 优质的转基因作物； 在一个具体实施方案中，所述改良包括产量提高、品质提高、抗病虫害、抗逆、抗倒伏等 生长性状的改良； 在另一具体实施方案中，所述作物是自花授粉或异花授粉作物； 在一个更加具体的实施方案中，所述作物是玉米、小麦、水稻。
[0010]与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明涉及的基因是在玉米雄穗 中特异表达基因，该基因在控制玉米花粉发育中有重要作用，该基因功能的缺失会特异性 导致玉米的雄性不育，可通过抑制该基因的特异表达获得新的玉米雄性不育系，在农业生 产上具有十分重要的应用潜力。
[0011] 术语定义 术语"调控玉米雄性生育力的基因"指一段具有编码蛋白能力的核苷酸序列，该序列特 异编码具有调控玉米花粉发育功能的蛋白活性多肽，如SEQIDN0. 2的第1-2013位核苷 酸序列及其简并序列。
[0012] 术语"简并序列"是指，位于SEQIDN0. 2的编码框第1-2013位核苷酸序列中， 有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子 的简并性，所以与SEQIDN0. 2的第1-2013位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列 也能编码出SEQIDN0. 2所编码的氨基酸序列。
[0013] 所述"调控玉米雄性生育力的基因"，还包括在中度严格条件下，更佳的在高度严 格条件下可以与SEQIDN0. 2的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。其中，中等严格条件可以 是0. 1XSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1%SDS(w/v)的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜的条件。
[0014] 所述"调控玉米雄性生育力的基因"，还包括与SEQIDN0. 2中从第1-2013位核 苷酸序列的同源性至少70%，较佳地具有至少80%、82%、85%、86%、88%、89%同源性，更佳地具 有至少90%、91%、92%、93%、94%同源性，最佳地具有至少95%、96%、97%、98%、99%同源性的核 苷酸序列。
[0015] 所述"调控玉米雄性生育力的基因"，还包括能编码具有与天然的调控玉米花粉发 育基因ZMfe堪因相同功能蛋白的、SEQIDN0. 2开放阅读框序列的变异形式。这些变异 形式包括(但并不限于）个或几个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'或3'端添 加几个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核 苷酸。
[0016] 所述"调控玉米雄性生育力的基因"，还包括能够翻译一类具备调控玉米花粉发育 功能的氨基酸序列，如SEQIDN0. 3的氨基酸序列。该类氨基酸序列还包括具有与天然调 控玉米花粉发育蛋白相同功能的SEQIDN0. 3的变异形式。这些变异形式包括(但并不限 于）个或几个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或几 个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内）氨基酸。在本领域中，用性 能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能；在C末端和/或N末端添 加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
[0017] 另外，所述的"调控玉米花粉发育基因"的核苷酸全长序列或其片段通常可以用 PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本实施例公开的有关 核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员 己知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要 进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得 了有关的序列，可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，然后细胞 转化等常规方法从增殖的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变 引入实施例蛋白序列中。除了用重组法产生之外，实施例蛋白的片段还可用固相技术，通过 直接合成多肽而加以生产。在体外合成蛋白质可以用人工或自动进行，可以分别化学合成 实施例蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的蛋白质分子。
【附图说明】
[0018] 图1为野生型和玉米突变体献?舶小花在抽雄期的形态观察示意图：图A， 正常可育植株（WT)的小花和不育突变体（as7-份形7)的小花形态比较；图B，可育株（WT)和 突变体（^?7-份形7)的花药经1%1(1-12染色结果比较。
[0019] 图2为野生型和玉米突变体??7-份形难]细胞学观察示意图：图A，正常可育植株 (WT)早期大液泡小孢子期花药的小孢子细胞结构；图B，不育突变体（as7-份形7)早期大液 泡小孢子期花药的小孢子细胞结构；白色三角型标示为萌发孔，黑色阴影箭头标示为细胞 壁，白色箭头标示处为细胞核，黑色标尺代表30μm。
[0020] 图3为因的遗传和物理位置不意图以及基因结构不意图：图A， 基因的遗传和物理位置示意图；图B，ZMfe堪因在野生型B73和玉米突变体人 份形冲的基因结构（WT:野生型B73 ;灰色矩形内的序列为份形7与野生B73的 ZMfe堪因对应序列的比较结果；灰色直线和矩形均代表突变发生后受到影响的序列结 构；TGA和TAA均为终止密码子，表示蛋白的翻译终止于此)，其中：序列表的SEQIDNO. 1 所示DNA分子由2435个核苷酸组成并具有如图3.B中ZMfe7所示基因结构，图示的+ 1 至+ 2435对应SEQIDNO. 1的1至2435bp碱基。+ 1至+ 321位为第一个外显子，+ 322至+ 636位为第一个内含子，+ 637至+ 918位为第二个外显子，+ 919至+ 1025为第 二个内含子，+1026至+ 2435为第三个外显子。+1至+ 321 (321bp)、+ 637至+918 (282bp)