miR1432在水稻干旱胁迫中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及miR1432在水稻干旱胁迫中的应用。
【背景技术】
[0002] Ca2+在植物细胞信号转导中居于中心位置，是胞内重要的信号分子，它在植物生长 发育以及逆境胁迫反应中发挥重要作用。植物在遭受不同的胁迫时，大都需要通过改变胞 内钙离子浓度来调动不同的生理过程以应对逆境。而胞内钙离子浓度[Ca2+Lyt的变化主要 依靠膜上钙离子转运系统来实现，该转运系统对于[Ca2+Lyt的平衡起到关键作用。最近，有 研究指出，在动物和番茄中某些miRNA可以靶向调控膜上钙离子转运基因，影响动、植物的 生长发育。但到目前为止，除了番茄外，其它植物中都未见相关的研究报道。
【发明内容】
[0003] 本发明的一个目的是提供miR1432或其编码基因或含有其编码基因的重组载体、 表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒的用途。
[0004] 本发明提供了miR1432或其编码基因或含有其编码基因的重组载体、表达盒、转 基因细胞系、重组菌或重组病毒在调控植物抗旱性中的应用；
[0005] 所述miR1432的核苷酸序列为序列表中序列1。
[0006] 本发明的另一个目的是提供miR1432或其编码基因或含有其编码基因的重组载 体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒的用途。
[0007] 本发明提供了miR1432或其编码基因或含有其编码基因的重组载体、表达盒、转 基因细胞系、重组菌或重组病毒在培育高抗旱性植物中的应用。
[0008] 上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
[0009] 或所述植物为单子叶植物，所述双子叶植物为水稻。
[0010] 抑制miR1432表达的物质在调控植物抗旱性中的应用也是本发明保护的范围。
[0011] 抑制miR1432表达的物质在提高植物抗旱性中的应用也是本发明保护的范围。
[0012] 上述应用中，所述抑制miR1432表达的物质为如下1)或2):
[0013] 1)核苷酸序列为序列3的DNA片段；
[0014] 2)含有1)的组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
[0015] 上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；
[0016] 或所述植物为单子叶植物，所述双子叶植物为水稻。
[0017] 本发明第三个目的是提供一种培育抗旱性提高的转基因植物的方法。
[0018] 本发明提供的方法，包括如下步骤：抑制目的植物中miR1432表达，得到转基因植 物；
[0019] 所述转基因植物的抗旱性高于所述目的植物。
[0020] 上述方法中，所述抑制目的植物中miR1432表达为将抑制miR1432表达的物质导 入目的植物。
[0021] 上述方法中，所述抑制miR1432表达的物质为如下1)或2):
[0022] 1)核苷酸序列为序列3的DNA片段；
[0023] 2)含有1)的组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒；
[0024] 所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物；
[0025] 或所述植物为单子叶植物，所述双子叶植物为水稻。
[0026] 本发明第四个目的是提供一种抑制miR1432表达的物质。
[0027] 本发明提供的抑制miR1432表达的物质，为如下1)或2):
[0028] 1)核苷酸序列为序列3的DNA片段；
[0029] 2)含有1)的组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
[0030] 本发明的实验证明，本发明通过干扰野生型水稻中的miR1432的表达，得到转基 因水稻，其与未干扰的野生型水稻相比，抗干旱胁迫。因此，miR1432可用于水稻高抗旱育 种，丰富现有的水稻育种材料的遗传多样性。
【附图说明】
[0031] 图1为miR1432靶基因鉴定。
[0032] 图2为0E-miR1432干旱胁迫表型分析。
[0033] 图3为0E-miR1432干旱胁迫表型分析。
[0034] 图4为0E-eTM1432干旱胁迫表型分析。
【具体实施方式】
[0035] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037] 实施例l、miR1432的功能验证
[0038] l、miR1432靶向调控基因的确定
[0039] 将通过PsRobot(http://omicslab.genetics,ac.cn/psRobot/)中microRNA革巴基 因预测工具，预测miR1432的靶基因，然后利用Ambion公司的RLM-RACE试剂盒（AM1700) 进行5'RACE，进一步验证miR1432的靶基因。
[0040] MiRNA通常需要通过其调控靶基因来参与生物学过程，为了研究miR1432的功 能，首先通过软件psRobot预测其靶基因，然后通过RLM-5'RACE实验验证，一类钙栗基因 (3 个ACA基因能被miR1432 靶向调控，它们是L0C_0s02g08010、L0C_0s04g51610 和L0C_ 0s08g40530。RLM-5'RACE得到的特异性片段测序显示miR1432介导的靶基因mRNA的切割 位置如图1所示。
[0041] 2、miR1432基因的获取
[0042] 根据水稻基因组序列设计miR1432的特异引物P1和P2,引物序列如下：
[0043] miR1432-Pl：ATCTAGAATGAGGGAGGATGTGCGTTC
[0044] miR1432-P2：TCTGCAGGAAACCGAAGAATCATCGAGG
[0045] 提取日本晴水稻（0·SativaL.spp.japonica，varnipponbare，以下也称为野 生型水稻；LossofFunctionofOsDCLIAffectsMicroRNAAccumulationandCauses DevelopmentalDefectsinRice,PlantPhysiology, 2005,V139 (1)296-305;公众可从中 国科学院遗传与发育生物学研究所获得）的RNA，反转录得到cDNA为模板，用miR1432-Pl和miR1432-P2进行PCR扩增，得到207bp的扩增产物，经过测序，该扩增产物具有序列表中 序列2,为miR1432基因，编码miR1432,其核苷酸序列为序列1。
[0046] 上述扩增反应体系如下表1 :
[0047] 表1为扩增反应体系
[0048]
[0049] 上述扩增反应程序如下表2 :
[0050] 表2为扩增反应程序
[0051]
[0052] 3、miR1432过表达载体的构建
[0053] 将上述2获得的PCR产物用XbaI和PstI限制性内切酶酶切，与经过同样酶切的 表达载体PCAMBIA2300 (购自CAMBIA，澳大利亚）连接，得到重组载体，命名为0E-miR1432， 表达miR1432,该重组载体为将序列2所示的DNA分子替换表达载体pCAMBIA2300的XbaI 和PstI酶切位点间的DNA片段。
[0054] 4、miR1432敲低表达载体的构建
[0055] 在水稻基因组上通过miR1432的targetmimic的分析，发现了 一个可以通过 targetmimicry方式负向调控miR1432的序列，设计扩增这段序列的特异引物：
[0056] eTM1432-Pl:ATCTAGAGGTAGGTGTGGCGCGGTATT
[0057] eTM1432-P2:TCTGCAGCGAGTGGTTCGGCAAGGGGA
[0058] 提取日本晴水稻（0·SativaL.spp.japonica，varnipponbare，以下也称为野 生型水稻；LossofFunctionofOsDCLIAffectsMicroRNAAccumulationandCauses DevelopmentalDefect