能够响应长期冷胁迫的DNA片段POscold5的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种DNA 片段，其能够对长期冷胁迫进行响应，进而在水稻转基因调控体系中驱动目标基因在植株 中表达。
【背景技术】
[0002] 很多作物，尤其是水稻是对温度极为敏感的作物，世界水稻主产区普遍存在的问 题便是低温冷害的问题。芽期、苗期和孕穗开花期遭遇冷害，将导致水稻幼苗生长迟缓、分 蘖减少，最终造成水稻产量的大幅度降低。另外，温度也是影响水稻籽粒品质的一个重要的 环境因素。因此，迫切需要发掘水稻耐冷种质资源，培育出水稻耐冷品种。
[0003] 近年来，随着分子生物学的发展，在水稻耐寒性理论的研宄方面取得许多进展，包 括一些关键的耐冷相关基因或QTL相继被克隆。利用这些关键基因，可以有效提尚植物对 低温的耐受性。但目前的基因工程操作中，大部分是利用组成型启动子驱动这些关键基因 的表达，所获转基因植株虽然能够表现出较强的低温耐性，但组成型启动子往往会带来一 些不必要的表达，比如造成植株矮小，发育延滞和物质能量浪费，不利于潜在的实际应用推 广。因此，利用冷诱导启动子，特异的激活关键调控基因，将在植物抗冷基因改良中起到重 要作用。
[0004] 我国水稻资源丰富，从水稻中发掘、定位、克隆耐冷相关基因及其冷诱导启动子将 对水稻耐冷品种的选育具有重要的理论及实际意义，在农业领域将具有广阔的应用和市场 前景。因此，人们迫切希望找到更多的非组成型启动子，用于提高水稻的耐冷性。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，本发明的目的是提供一种DNA片段，其能够驱动外源基因在冷诱 导条件下特异性表达，获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用，进而提高植 物的耐寒性。其中，本文中所涉及的"植物"是指单子叶植物，例如水稻、小麦、玉米、大麦、 高梁或燕麦，优选为水稻。
[0006] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供一种DNA片段，所述DNA片段包含：
[0007] 1)序列表中SEQIDNO:1所示的DNA序列；或者
[0008] 2)在严格条件下与1)中所述的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；或 者
[0009] 3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有启动子功能的DNA 分子。
[0010] 2)和3)中的序列与SEQIDNo:1所示的DNA序列具有相同的功能，即驱动目标基 因在植物中表达。
[0011] 优选地，本发明所述DNA序列为SEQIDNo:1所示的序列。
[0012] 优选地，序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列可以用作植物冷诱导强表达启动 子。
[0013] 序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列可以提取自日本晴水稻（Oryza sativa L cv. Nipponbare)，本文中称为P0scold5或启动子P0scold5。具体而言，本申请的发明 人发现日本晴水稻（Oryza sativa L cv.Nipponbare)基因上游包括转录起始位点在内的 1259bp的DNA序列，具有驱动目标基因在寒冷条件下特异性表达的功能，并且分离克隆、并 鉴定了该DNA序列的功能。但是，需要说明的，后续人们根据本发明公开内容而人工合成的 相同序列也包含在本发明的范围内。
[0014] 另一方面，本发明还提供一种包含上述植物冷诱导强表达启动子的表达盒。
[0015] 另一方面，本发明还提供一组用于扩增权利要求1所述的DNA片段的全长或其 任意片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括第一引物和第二引物，所述第一引物的 DNA序列包含片段：AAGCTTGCAGAGGGCGGAACAAGTGAAC ;所述第二引物的DNA序列包含片段： GTCGACCATTGCTGAAGCTGCTGAACTC 〇
[0016] 又一方面，本发明还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体为在植物表达载 体PCAMBIA1391的多克隆位点插入所述DNA片段得到的重组质粒，在所述重组表达载体中， 所述植物冷诱导强表达启动子P0sc 〇ld5连接于载体中待表达的基因序列的上游；优选的， 所述待表达的基因为任何对作物的耐寒性具有改善功能的基因。通过本发明的启动子驱动 该耐寒基因在寒冷条件下表达，从而实现改善作物耐寒性状的功能。
[0017] 再一方面，本发明提供上述植物冷诱导强表达启动子在培育转基因植物中的应 用。所述应用包括将本发明提供的上述DNA片段连接于载体的待表达的基因序列上游（例 如，将所述启动子序列置于目标基因之前），从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体 转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。
[0018] 并且优选地，所述应用可以用于改良植物生长特性，所述植物为单子叶植物，例如 水稻、小麦、玉米、大麦、高梁或燕麦，优选为水稻。
[0019] 本发明中所提供的启动子的DNA序列为（与序列表中SEQ ID No: 1中相同）：
[0020] GCA GAGGGCGGAA CAA GTGAAC(GAACGAACGGCGCCCGAGCATTTTCGTCGGCGT TTCTGGAACGGCTTCTGTTTCTCTCCACTGTCGCAGCGGTGGAGATCTTTCGTCAACTGAGTTTGGAGCTGTCTGCT CTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCGTTCGCGTGCAGAGCTGGAGATCAAACTCAACTTTTTCTTTCGGTACAGCGA CTCTCCAGTCTCCTCGGTCGATCGTTTCTCCTGTTCCCTTCTGATGCGTGTGATCATAAACCTGGTATCATTTGATT GAGATTGATAATAACCTGCTGTAACTTAGCGAATTACCAGAGTTACTCCGTTTTGCTTGTACAGTTTCCGGTTTCTT TGCCATTTCGTTTACAGATAGCACTCATTATTATCTCAACAAAATATACACAATTTCATTTAGTAACTAAGGGCCTG TTGGGCTGCCCAGGCTGCGACTGCCGGCATGAACAGTGCCACATTCACTGTGCACAGCCGCGGCGCTTGCTGAATAG GCCCTAAATTATCGTGGAACTGTACGTCAGTGTAATAATTGTTTAATCACAACCTACAACTAAAGTTGTGTTTAGAT CCAAACTTCAATTCTTTTCCATCACATCACATGTCATACACACACAACTTTTCAGTCACATCATCTCCAATTTCAAC CAAAATTTAAACTTTGCGCTGAACTAAACACAGCCTAGTACTCCCTCCGTTATATTTCATATTATAAGTTATTTAAT TTTTTTCTTAATCAAATACTTACAACAAATTTTACCCTTGTTTTTTTTAAAACGATGCTCGATCGATCGAGAATTTC CATCACCGTTTTCATAATCATCAGTAACCACACCTACAACTGGTACAACACGGTGATATTTTCAACACGAAAAGTAG TTCTGTCAGTACCAGTTCCACGTCAAAGAAACCACGGCGATTTTCTACCGGTCGGAGAATTCCGTCCTTCCGGGACA AAATCCACGCCAACCACAAGCTCACCACAAAGAGAGATCAGAGATGCCATCGGAATATTCTCCGTTTCCATCTCGTT CTGCATTTTCGTGGGCTTTGATTATTATTCGTCGAAACTTCCCAAACTCGCGAATTTACCACGCGTGTCCCGTATGA TCCCTCTCCTCTCCATCGTACGTTATCAGCGACTATAAATACGGCCTCGACTCCGGACACCTTCTTCTTCCTGCTGT TCAGAGCAACGGTAGCTGACAGTGACGGAGTTCAGCAGCTTCAGCA ATG
[0021] 需要说明的是：上述启动子的DNA序列中，序列开头以斜体并加粗表示的序列 "GCAGAGGGCGGAACAAGTGAAC"为获得启动子过程中使用的正向引物的留存序列，共计22bp ; 序列末尾以斜体并加粗表示的序列"GAGTTCAGCAGCTTCAGCAATG"为获得启动子过程中使用 的反向引物的留存序列（该留存序列与反向引物的相应序列互补），共计22bp ;该DNA序列 中剩余的部分则为获自日本晴水稻中的DNA序列。需要强调的是，本文中所提到的启动子 既可以指上述整个DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要说明的 是，即便本领域技术人员在本发明的基础上，采用其他引物获得了类似序列，其也