一种调控和提高脱氧核酶催化活性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种调控和提高脱氧核酶催化活性的方法，特别涉及一种调控和提 高具有G-四聚体结构的脱氧核酶（DNAzyme)-氯化血红素（hemin)复合物催化H 202氧化 2, 2' -联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS2+)反应的催化活性的方法， 属于生物分析技术领域。
【背景技术】
[0002] G-四聚体（G-quadruplex)是指由含有多个连续鸟嘌呤碱基G的DNA或RNA形成 的一种特殊的核酸二级结构。它首先由四个G碱基通过Hoogsteen氢键的配对方式首尾连 接构成了一个由4个G形成的平面，然后不同平面之间通过31-31堆积作用而形成多层结 构，即为G-四聚体。
[0003] 具有G-四聚体结构的核酸因其高度有序的碱基空间排列结构，具备多种特殊性 质和广泛的潜在应用前景。其中，用来调控和稳定线状染色体末端的端粒即是由6个碱基 重复序列（TTAGGG)的单链DNA及一些蛋白组合而成。G-四聚体核酸结构及活性的研宄对 于开发出潜在的新型抗肿瘤药物有重大意义。另外最近在非编码区和多种核酸适配体中也 发现了 G-四聚体结构。此外，部分具有G-四聚体结构的脱氧核酸具有特别的催化功能，被 称为脱氧核酶（DNAzyme)。脱氧核酶相比传统蛋白质酶具有易于化学合成和修饰、热稳定性 好、不易水解等优点，因此在生物模拟酶的研宄中占有极其重要的地位。
[0004] 其中有一类DNAzyme在K+、Na+、NH4+等阳离子存在的条件下形成G-四聚体结构，此 时氯化血红素嵌入G-四聚体结构的空穴之中，显著提高氯化血红素（hemin)催化H 202氧化 2, 2'-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS2+)或鲁米诺的反应。由于该 反应的产物在紫外可见范围内有特征吸收或化学发光，近年来，该类具有过氧化氢酶活性 的DNAzyme-hemin复合物被广泛用于一系列高灵敏度、高特异性的化学及生物传感器，用 于实现DNA分子（端粒酶活性，单碱基突变）、蛋白（凝血酶）、离子（钾离子、汞离子）等 多种分析物的检测分析。
[0005] 在G-四聚体DNA中，多层结构的形成可以由一条完整的DNA链弯曲结合而成，也 可以由多条裂分的多G序列共同组合而成。因此，G-四聚体可分为单链、双链和四链等几 种形式。此外，根据多G序列弯曲形成G-四聚体结构时各棱上DNA折叠方向的不同，G-四 聚体DNA的结构又可被定义为平行、反平行和混合等模式。不同结构的DNAzyme的过氧化 氢酶的活性各异，通常具有平行结构的DNAzyme的活性高于具有反平行结构的DNAzyme。
[0006] 目前，具有过氧化氢酶活性的脱氧核酶最初由体外筛选技术（SELEX)获得。由 于该技术本身的局限性，所获得的脱氧核酶的催化活性有限。近些年来国内外研宄人员 采用多种不同方法来提高脱氧核酶的催化活性，主要包括下列方法：（1)嫁接法：在原始 的脱氧核酶上嫁接上一部分双链结构（J. Am. Chem. Soc. 2009, 131，10320 - 10333 ;PLoS ONE，2009, 4, e5126.); (2)碱基变异：将原始脱氧核酶中的环（loop)的碱基进行变化 (Anal. Chem. 2013, 85, 5430-5435) ; (3)化学修饰：将原始脱氧核酶的碱基进行化学修饰 (Chem. Commun.,2012,48, 8347 - 8349)〇
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提出一种调控和提高具有G_四聚体结构的脱氧核酶 (DNAzyme)-氯化血红素（hemin)复合物催化H 202氧化2, 2' -联氮-二（3-乙基-苯并 噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS2+)反应的催化活性的方法。其特征在于首先通过对已知 核酶AB (5' -AGGGACGGGATGTGGAGGGT-3'）的核酸序列进行拆分，选择出高活性核酸片段 A(5' -AGGGACGGGA-3'），然后具有不同长度胸腺嘧啶（T)碱基的DNA链分别连接两个高催化 活性片段A，形成一系列新的重组脱氧核酶AT nA。通过对这些重组的脱氧核酶进行结构分 析和催化活性的测试，发现调控T碱基的数量可以调控脱氧核酶的结构和提高催化双氧水 (H 202)氧化ABTS2+的活性。
[0008] 本发明基于对已知脱氧核酶进行拆分和重组，通过调节连接两个高催化活性片段 的连接链的长度来调控核酶结构和催化活性的方法，具有如下的技术效果：1、应用本发明 可以设计出比已知脱氧核酶催化活性更高的新型脱氧核酶；2、应用本发明可以通过简单调 节连接多T链的长度调控脱氧核酶的催化活性，设计出一系列催化活性渐变的脱氧核酶。 3、应用本发明可以通过简单调节连接多T链的长度调控核酶的结构，实现从反平行结构到 平行结构的渐变。
【附图说明】
[0009] 图1A-图1￡是四种脱氧核酶与氯化血红素（hemin)催化活性的直接比较。脱 氧核酶AB-hemin、拆分序列A-hemin、拆分序列B-hemin、重组序列AT 8A_hemin及hemin自 身催化双氧水氧化ABTS反应4min时的紫外可见光谱图（A);四种脱氧核酶与氯化血红素 (hemin)复合物分别催化双氧水氧化ABTS 2+反应30min时的显色效果比较图（S)。四种脱 氧核酶与氯化血红素（hemin)催化过氧化物反应的动力学数据比较（C)。测量产物的最大 紫外可见吸收波长（418nm)处在0-8min的吸光度并绘制动力学曲线。在图1A和图1￡中， 至上而下分别是4!^\、413、4、13、1161]1；[11，其中13和1161]1；[11的曲线是重叠在一起的。
[0010] 图24-图22是测定三种脱氧核酶4!'!^(4)48(2)和六(￡)-1^1^11复合物的解离常 数K d的原始数据与数据处理图（插图），图2 2为解离常数。
[0011] 图3A-图3S是12种含不同数量T的连接链的系列重组核酶ATnA(n = 1-12)与氯 化血红素复合物催化过氧化物反应的活性的动力学数据比较图（A)和相对催化活性的比 较图（S)。测量产物（自由基正离子ABTS'+的最大紫外可见吸收波长（418nm)处在0-8min 的吸光度并绘制动力学曲线。相对活性以AB的催化活性为1进行计算。
[0012] 图勉_图4S是四种脱氧核酶AB，ATiAaiy^PAiyUA)和10种重组脱氧核酶ATnA(n =3-12) (S)的圆二色谱图。
[0013] 图5是本发明设计的重组脱氧核酶ATnA(n = 1-12)的二级结构与连接链长度的 关系图。
【具体实施方式】
[0014] 表1 :本发明中使用的核酸序列。
[0015]
【主权项】
1. 一种调控和提高核酶催化活性的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：第一步 骤：通过对已知核酶的核酸序列进行拆分，选择出高活性核酸片段，第二步骤：具有不同长 度胸腺嘧啶（T)碱基的DNA链分别连接两个高催化活性片段，形成一系列新的重组核酶。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第一步骤为将已知的核酶序列AB切割为 序列A与B两个核酸片段，分别测试这两个片段序列对于H 2O2氧化ABTS反应的催化活性； 第二步骤为选择A、B片段中活性较高的B部分作为重复单元，以含不同数量T的连接链连 接两个B，得到系列重组核酶。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于还包括如下步骤：测试系列重组核酶 的催化活性，通过圆二色谱表征其形成G-四聚体DNA的结构。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于还包括如下步骤：分析设计合成的系列核 酶的结构及其催化活性的关系，总结出高催化活性核酶的结构特征与设计方法。
5. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，第一步骤如下：将核酶溶解在反应 缓冲液 I 中（4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES) (25mM)，KNO3 (20mM)，NaNO3 (200mM)，Triton X-100(0.025% (w/v))，DMS0(l% (v/v))，pH 5.3)中，其终浓度为 0.125yM?将上述溶液 先于95°C水浴加热6分钟，然后缓慢冷却2小时至室温（约25°C )，将氯化血红素（hemin) (终浓度为0. 2 y M)加入上述热处理后的溶液中，于室温孵育1小时，形成脱氧核酶-hemin 复合物，加入反应物ABTS2+ (终浓度0. 5mM)和H2O2 (终浓度ImM)于上述溶液中，记录反应进 行4分钟时绿色产物ABTS'+的紫外吸收光谱，产物在418nm处的最大吸光光度值用来定量 分析脱氧核酶的催化活性。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括绘制0-8min的动力学曲线。
7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述核酶序列AB为5' -AGGGACGGGATGTGGAGGG T-3,。
8. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述连接链含11个T碱基。
9. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述重组核酶为平行结构的G-四聚 体DNA-hemin形成的复合物核酶。
10. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述重组核酶为AT 8A-hemin组成的 复合物核酶。
【专利摘要】本发明涉及一种调控和提高G-四聚体脱氧核酶(DNAzyme)-氯化血红素(hemin)复合物催化双氧水(H2O2)氧化2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)反应的方法。在本方法中，通过对已知DNAzyme的序列进行拆分，选择出高活性的核酸片段，然后通过与一定长度的多胸腺嘧啶(T)核酸序列将两条高活性的片段进行重组连接，通过调节多T核酸序列的长度即可调控并且有效提高重组DNAzyme的催化活性。
【IPC分类】C12N15-113, C12N15-10
【公开号】CN104845969
【申请号】CN201510233983
【发明人】娄新徽, 韩宇, 张颖, 肖艺, 徐奭
【申请人】首都师范大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年5月8日