专利名称：丙肝病毒特异性核酶M1GS-hcv/C20的构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种丙肝病毒特异性核 酶M1GS-hcv/c20及其构建方法和应用。
技术背景目前，基于核酶P (RNase P)的反义技术在抗病毒研究领域受 到广泛重视，国内外一些学者采用这类技术对包括人类巨细胞病毒、 单纯疱疹病毒、艾滋病毒、流感病毒等在内的多种病毒进行过研究， 均发现其具有高效、特异性抑制病毒特定基因表达的作用，从而表明 该技术在抗病毒领域的巨大潜力。核酶P是广泛存在于各种生物细胞 (包括真核细胞、原核细胞及古细菌)内的一种天然大分子核酶，该 核酶在细胞内具有分布广、含量丰富、活性高而稳定等特点，其主要 生物学功能是负责前体tRNA (ptRNA) 5'前导序列的特异性切除， 以促进tRNA的成熟。对于任何序列已知的耙mRNA，理论上可设计一 段相应的引导序列(Guide sequence, GS)与之结合并使之形成类似 于ptRNA分子的结构，从而被核酶P识别并切割。与其他类型的核酶相比，RNase P主要识别底物特定的二级结构。 因此，即便靶基因一级结构的序列产生一定变异，但只要不引起其中 某些特定二级结构基序的变化，仍可被RNase P识别并切割，这对于 一些易变异病毒的抗病毒研究无疑具有重要意义。丙型肝炎病毒(H印atitisC virus, HCV)属黄病毒科，基因组为正单链RNA，全长约9600nt。是一种慢性化率极高的肝炎病毒，变 异性极高，在其自然感染的过程中可持续突变，产生不同的型或亚型， 以致于在同一 HCV感染者体内可同时存在具有多种序列组成不同但 却有很高同源性(同源性》95%)的HCV变异株病毒群体，称为HCV准 种(Quasispecies)。丙型肝炎病毒常引起肝硬化及肝癌，对人类健康 造成重大危害。目前对该病毒尚未有特异有效的防治方法，常规的干 扰素疗法疗效不甚理想且易反复，探索新的防治方法具有重要意义。 因此，采用RNase P技术对HCV进行抗病毒研究并构建HCV特异 性的人工核酶对于丙型肝炎病毒的抗病毒研究无疑具有重要意义。 发明内容本发明的目的是填补现有技术的空白，提供一种丙肝病毒特异性 核酶M1GS-hcv/c20的构建方法。本发明的另一个目的是提供通过所述构建方法构建得到的丙肝 病毒特异性核酶的应用。本发明的目的通过以下技术方案来予以实现提供一种丙肝病毒特异性核酶MlGS-hcv/c20的构建方法，选取 丙型肝炎病毒HCV基因组5， UTR中21 36nt之间的序列作为靶位点 设计引导序列，将引导序列与大肠埃希菌核酶P共价相联构建得到。所述引导序列为5， -TTCATGGTGGAGTGTC-3，。根据任何序列已知的靶mRNA，可设计一段相应的引导序列(Guide sequence, GS)与之结合并使之形成类似于ptRNA分子的结构，从而 被核酶P识别并切割的理论，本发明在大肠埃希菌(E.coli)核酶P的基础上，针对HCV基因组5' UTR设计一段GS序列，进一步将两者 共价相联，成功构建了一种HCV特异性的人工核酶HGS-HCV/C20， 并在此基础上对该人工核酶的体外切割活性进行了测定。所述丙肝病毒特异性核酶M1GS-hcv/c20的构建方法包括以下步骤步骤(1)设计引导序列；依据GS的设计原则，选取HCV基因组5， UTR中21 36nt之间 的序列作为靶位点来设计GS，该区序列为5， - GACACTCCACCATGAA -3，。该靶点称为C20，针对C20靶点所设计的GS序列为 5， -TTCATGGTGGAGTGTC-3，。本发明选择背景相对比较清楚、来源于大肠埃希菌的認ase P作 为工具，针对HCV基因组序列较为保守区的5' UTR，成功将具有引 导作用的GS序列与具有催化活性的RNase P亚基"HVIl RNA共价结合在一起，构建了一种人工核酶""M1GS-HCV/C20。在设计GS时，靶位的选择极为关键。所选择的靶位既要符合被 RNase P切割所需的序列特征，同时也要考虑是否存在空间上的障碍。 由于HCV 5' UTR具有极其复杂的二级结构，因此后一要素显得尤为 重要。本发明在设计之前首先利用计算机软件(RNAstructure 4.5) 对底物RNA的二级结构进行模拟，如附图2所示，发现在第21位G 之前的区域二级结构稳定而复杂，而这之后存在一段较长的单链区 域，因此选择21 36nt之间的单链区序列作为侯选靶位，以便所设 计的GS能与之有效结合。本发明依此而设计的核酶对底物显示出明显的耙向切割活性。步骤(2)以含M1 RNA基因的pFL117质粒为模板，通过引物进行PCR扩增，获得M1GS- HCV/C20的基因片段所述基因片段的获得是以含MlRNA基因的pFL117质粒为模板，通过引物P1、 P2进行PCR扩增获得M1GS-HCV/C20的基因片段。由于引物Pl针对的是pF117质粒中的T7启动子序列，引物P2针对是pF117质粒中Ml RNA基因下游约88bp处的一段序列，并含有针对C20靶位的GS序列，因此该M1GS核酶基因的结构如附图1所示。其中，引物P1: 5， — GATGGTACCTAATACGACTCACTATA —3，；P2: 5， -GTMGCTTGGTTTCATGGTGGAGTGTCTGTGGAATTGTGAGC-3，；由上海英竣公司合成。步骤(3)以限制酶KpnI和HindlII对所述基因片段及pUC19质 粒载体进行双酶切，并通过T4DNA连接酶将两者连接，构建得到含 MIGS-HCV/C20基因的重组质粒。本发明提供了所述方法构建得到的丙肝病毒特异性核酶 M1GS-hcv/c20的应用，所述丙肝病毒特异性核酶MlGS-hcv/c20对靶 RNA产生定点、特异性切割作用在制备抗病毒药物方面的应用。本发明的有益效果是，通过选择丙肝病毒21 36nt之间的单链区 序列作为侯选靶位，成功设计引导序列与之有效结合，依此而设计的 核酶对底物显示出明显的靶向切割活性，所述核酶的成功构建为后续 的实验为提供准确可依的实验材料，从而为新型抗HCV药物及反义基 因治疗的研究奠定基础。
图l本发明构建的丙肝病毒特异性核酶M1GS-hcv/c20结构示意图 图2计算机软件(RNAstructure 4. 5)模拟的底物RNA的二级结构3 M1GS-HCV/C20质粒的1X琼脂糖凝胶电泳4核酶转录产物5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图(含7mol/L脲素，银染)图5 a-"P标记的底物RNA的8X变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图(含7 mol/L的脲素，同位素成像扫描)图6核酶M1GS-hcv/C20对底物RNA的体外切割(8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图，含7mol/L的脲素，同位素成像扫描)具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来进一步详细说明本发明。 实施例l丙肝病毒特异性核酶M1GS-hcv/c20的构建及切割活性测定 1材料1. 1酶及试剂限制性核酸内切酶(Kpn I、 Hind III、 Xba 1)、 T7 RNA聚合酶、DNA酶I (RNase free)购自Fermentas (MBI)公司；Ex Taq 酶、绿豆芽核酸酶、T4 DNA连接酶、RNA酶抑制剂购自TaKaRa宝生物(大 连)技术有限公司；a-"P标记的UTP购自北京福瑞公司。 1.2质粒和及核苷酸片段含M1 RNA基因的pFL117质粒由美国加州 大学伯克莱分校的刘奋勇教授(Fenyong L iu， University of California, Berkeley)惠赠；pUC19、 pGEM3z质粒购自TaKaRa宝生 物(大连)技术有限公司；含HCV基因组5， UTR的pGEM-HC质粒是由广东药学院实验室根据上海第二军医大学微生物实验室提供的质粒pGEM9zf(-)基础上按常规方法构建得到，质粒pGEM-HC序列如SEQ ID N0:2所示。引物Pl : 5， - GATGGTACCTMTACGACTCACTATA -3， 和P2 : 5， -GTMGCTTGGTTTCATGGTGGAGTGTCTGTGGMTTGTGAGC-3，，由上海英 竣公司合成。 2实验步骤2. 1 M1GS-HCV/C20质粒的构建 (1) GS的设计依据GS的设计原则，选取HCV基因组5' UTR中21 36之间的序列 作为靶位点来设计GS，该区序列为5' - GACACTCCACCATGM-3，。该 靶点称为C20 ，针对C20靶点所设计的GS序列为 5' -TTCATGGTGGAGTGTC-3 ，。(2) M1GS核酶基因的克隆以含M1 RNA基因的pFL117质粒为模 板，通过引物P1、 P2进行PCR扩增，PCR扩增条件为94T:热启动5min; 94。C变性30sec、 58。C复性45sec、 72。C延伸lmin，共30次循环，即可 获得M1GS-HCV/c20的基因片段。由于引物Pl针对的是pF117质粒中的 T7启动子序列，引物P2针对是pF117质粒中Ml RNA基因下游约88bp处 的一段序列，并含有针对C20靶位的GS序列，因此M1GS核酶基因的结 构示意图见附图l所示。(3)进一步以限制酶KpnI和Hind III对该MIGS核酶基因片段及 pUC19质粒载体进行双酶切，并通过T4 DNA连接酶将两者连接，即可构建含M1GS-HCV/C20基因的重组质粒。双酶切及连接的反应体系可参 照有关试剂的使用说明。2.2丙肝病毒特异性核酶MlGS-hcv/c20的切割活性测定(1) 核酶RNA的制备先利用限制酶Hind 11I对M1GS-HCV/c20质粒 进行单酶切，再以绿豆芽核酸酶对切割产物的末端进行平滑，所获得 的线性质粒DNA可作为体外转录的模版。在T7 RNA聚合酶的催化作用 下进行体外转录，转录方案可参照TAKARA公司的使用说明书。转录后 的产物用DNase I消化30min、苯酚氯仿抽提l次、乙醇沉淀2次，纯化 产物保存于80%乙醇中备用。(2) 底物RNA的制备以限制酶Xbal将pGEM-HC质粒线性化，然后 进一步以T7 RNA聚合酶催化转录。与上述M1GS核酶体外转录所不同的 是，反应体系(20ul)中加入1000cpm的a-"P标记的UTP，从而制备a-"P 标记的底物RNA。同位素标记转录产物的纯化与上述核酶RNA的纯化方 法相同。(3) 体外切割反应 参照己有相关技术报道进行实验。步骤简述如下将a，P标记的底物RNA经8(TC热变性5 min后，立即冰浴lmin;然后加入等摩尔的 M1GS核酶。与此同时，设立不加核酶的对照组。反应体系的体积为 10ul，反应缓冲液B的pH为7. 5，含50 mmol/L Tris - HC1， 100咖ol/L NH4Cl及100咖ol/LMgCl2。 37。C水浴30 min后，加入等体积含9mol/L 尿素、0.05%溴酚蓝及0.05%二甲苯蓝的终止液终止反应，然后通过8% 的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(含7mol/L尿素)对切割产物进行分离，并以Typhoon-9200对分离的条带进行同位素成像扫描。 (4)实验结果(4) .1 M1GS-HCV/C20质粒的鉴定对所构建的M1GS-HCV/c20质粒以Kpnl和HindlII进行双酶切鉴 定，显示在约500bp左右处出现一条切割产物条带，见附图3所示第3 泳道，与MlGS设计的预期长度501bp相符合。附图3中，l为Wide RangeDNA Marker; 2为MIGS-HCV/C20质粒空白对照；3为MlGS-HCV/C2o质粒 以KpnI与HindI工I双酶切后的产物；4为M1GS核酶基因的PCR扩增产物。进一歩通过PCR鉴定，在相应大小的位置出现了一条非常明显的 特异性扩增条带，见附图3所示第4泳道。结果表明，所构建的M1GS 核酶基因己成功被克隆至pUC19载体上。该核酶基因的序列如图6所 示。(4) .2核酶RNA的鉴定M1GS-HCV/C20质粒以Hind III线性化，再以绿豆芽核酸酶将其 3'末端进行平滑，获得转录模版；在T7RNA聚合酶的催化作用下进 行体外转录。理论上，转录产物由M1RNA (377nt)、桥序列(88nt)、 GS序列(16nt)以及3' CCA末端(4nt)四个部分组成，其大小应 为485nt， M1GS-HCV/C20质粒序列表如SEQ ID N0:1所示。附图4 中泳道4显示，转录产物只形成一条带，其位置符合理论预期，说明 该转录的特异性高，转录产物纯度也较为理想。附图4中，1为RNA Marker; 2和3为空白对照；4为M1GS核酶转录产物。(4) .3底物RNA的鉴pGEM-HC是由广东药学院实验室根据上海第二军医大学微生物实 验室提供的质粒pGEM9zf(-)基础上根据常规方法构建得到，质粒 pGEM-HC序列如SEQ ID N0:2所示。含有包括HCV基因组5， UTR、 C 基因片段、NS5b片段及3' UTR在内的一个重组质粒，插入片段全长 1098bp，位于T7启动子的下游。本发明中，纯化的底物RNA经尿素 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，以Typhoon9200进行同位素扫描，结果 如附图5所示。泳道1为同位素标记的RNA marker,泳道2为a-32P 标记的底物RNA，可见一条明显的条带，其泳道位置与预期1098nt 大小一致。另外，该泳道中未见其他杂带，说明转录产物纯度亦较好。 (4) .4体外切割活性的检测将a-32P标记的底物RNA与M1GS-HCV/C20核酶RNA以摩尔比相混 合，在37'C下条件下进行体外切割反应。结果显示不加核酶的对 照组只在1098nt处形成一条带，见附图6泳道2，显然这条带应该 为底物RNA;而在泳道3，可以看出除了存在底物RNA条带以外，还出现了另外两条带，说明所构建的M1GS-HCV/C20核酶对底物产生了 切割。由于本发明构建的核酶针对的靶位是HCV基因组5' UTR21 36nt之间的一段序列，因此预期的切割产物大小应该是5'端产物 约20nt， 3'端产物约1078nt，从两条新出现带的泳动位置观察，符 合预期大小，从而表明所产生的切割属于一种定点的、特异性切割。 附图6中，1为RNA标准分子量marker; 2为对照组，仅加a-32P标 记的底物；3为实验组，a-32P标记的底物+MlGS-HCV/C20核酶。SEQUENCE LIS丁I恥<110〉广东药学院<120〉丙肝病毒特异性核RM1GS-hcv/c20的构建方法和应用<130><160> 2"70> Patentln version 3.2<210〉 1<211> 485〈212> DW\ <213〉人工序列<柳> 1gaagctgaccagacagtcgccgcttcgtcg tcgtcctctt cgggggagacgggcgg鄉g60g鄉aaagtccgggctccat鄉gcagggt gccaggtaac gcctgggggggaaacccacg120accagtgcaacagagagcaaaccgccgatg gcccgcgc幼gcgggatcag180taagagcgcaccgcgcggct ggtaacagtc cgtggcacggtaaactccac240ccggagcaaggccaaataggggttcataag gtacggcccg tactgaacccgggt:鄉ctg300cttgagccagctggcctaga tgaatgactg tccacgacagaacccggctt360atcggtcagtttcacctgaagcttgacctg caggcatgca agcttggcgtaatcatggtc420atagctgtttcctgtgtgaaattgttatcc gctcacaatt ccacagacactccaccatga480aacca化5<210〉 2<211> 1098〈212> DMA 〈213>人工序列<柳〉2gccagccccc tgatgggggc gacactccac catgaatcac tcccctgtga ggaactactg tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtgcag cctccaggac cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattgccag gacgaccggg tcctttcttg gatcaacccg ctcaatgcct ggagatttgg gcgtgccccc gcgagactgc tagccgagta gtgttgggtc gcgaaaggcc ttgtggtact gcctgatagg gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcac catgagcacg aatcctaaac ctcaaagaaa aaccaaacgt aacaccaacc gccgcccaca ggacgtcaag ttcccgggcg gtggtcagat cgt"tggtgga gtttacctgt tgccgcgcag gggccccagg ttgggtgtgc gcgcgactag gaaggcttcc gagcggtcgc aacctcgtgg aaggcgacaa cctatcccaa aggctcgccg acccgagggc agggcctggg ctcagcccgg gtaccaccct tgcgaacctg gagacatcgg gccagaagtg tccgcgctaa —gctactgtcc caggggggga gggccgccac "ttgtggcaga tacctcttta actgggcagt aaggacciaag cttaaactca ctccaatccc ggccgcgtcc cagctggact tgtctggctg gttcgtcgct ggttacagcg ggggagacat atatcacagc ctgtctcgtg cccgaccccg ctggtttccg ttgtgcctac tcctactttc tgtaggggta ggcatttacc tgctccccaa ccgatgaacg gggagctaac cactccaggc cttaagccat ttcctgtttt tttttttttt tttttttttt ttttcttttt ttmtctt.t cctttccttc tttttttcct ttctttttcc C"ttc"tttaa1; 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权利要求
1、一种丙肝病毒特异性核酶M1GS-hcv/c20的构建方法，其特征在于是选取丙型肝炎病毒HCV基因组5’UTR中21～36nt之间的序列作为靶位点设计引导序列，将引导序列与大肠埃希菌核酶P共价相联构建得到。
2、 根据权利要求1所述丙肝病毒特异性核酶M1GS-hcv/C20的构 建方法，其特征在于所述靶位点为C20。
3、 根据权利要求1所述丙肝病毒特异性核酶MlGS-hcv/c20的构 建方法，其特征在于所述引导序列为5， -TTCATGGTGGAGTGTC-3'。
4、 根据权利要求1所述丙肝病毒特异性核酶M1GS-hcv/c20的构 建方法，其特征在于包括以下步骤(1) 设计引导序列；(2) 以含MlRNA基因的pFL117质粒为模板，通过引物进行PCR扩增，获得M1GS- HCV/C20的基因片段；(3) 以限制酶Kpnl和Hind工II对所述基因片段及pUC19质粒 载体进行双酶切，并通过T4 DNA连接酶将两者连接，构建得到含 M1GS-HCV/C20基因的重组质粒。
5、 一种权利要求l所述方法构建得到的丙肝病毒特异性核酶 M1GS-hcv/c20的应用，其特征在于所述丙肝病毒特异性核酶 M1GS-hcv/c20对靶RNA产生定点、特异性切割作用在制备抗病毒药物 方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种丙肝病毒特异性核酶M1GS-hcv/C20的构建方法，是选取丙型肝炎病毒HCV基因组5’UTR中21～36nt之间的序列作为靶位点设计引导序列，将引导序列与大肠埃希菌核酶P共价相联构建得到。通过选择丙肝病毒21～36nt之间的单链区序列作为候选靶位，成功设计引导序列与之有效结合，依此而设计的核酶对底物显示出明显的靶向切割活性，所述核酶的成功构建为后续的实验为提供准确可依的实验材料，从而为新型抗HCV药物及反义基因治疗的研究奠定基础。
文档编号C12N15/63GK101250510SQ20081002687
公开日2008年8月27日 申请日期2008年3月19日 优先权日2008年3月19日
发明者张文军, 李红枝, 陈伟强 申请人:广东药学院