专利名称：基于四氧化三铁磁性纳米粒子模拟酶检测双氧水或葡萄糖的方法
技术领域：
本发明涉及基于四氧化三铁磁性纳米粒子模拟酶检测双氧水或葡 萄糖的方法，属于分析化学技术领域。
背景技术：
天然酶在温和条件下具有高的底物特异性和高的催化效率。但是 天然酶易变性、容易被蛋白酶降解且制备和纯化费时费力。因此，人 们在努力地寻找天然酶的各类替代品(即模拟酶)。目前发现的模拟
酶有人工的核酶和脱氧核酶、细胞色素P450模拟酶、丝氨酸蛋白
激酶模拟酶、双加氧模拟酶、过磷酸二酯氧模拟酶、链接酶模拟酶、
核酸酶模拟酶和过氧化物模拟酶，等等。其中，过氧化物模拟酶包括: 高铁血红素、正铁血红素、血红蛋白、环糊精和卟啉，等等。这类过 氧化物模拟酶己被用于双氧水和抗坏血酸的检测。
近期的研究表明，纳米材料的高效催化能力主要来自于其大的比 表面积。人们对像四氧化三铁这样的磁性纳米材料进行了深入地研 究，并将其广泛应用在磁共振成像、药物输运、生物样品分离以及生 物催化等领域。通常认为，磁性纳米材料是化学和生物惰性的，因而 实际应用中需要在磁性纳米材料表面进一步修饰金属催化剂、酶或者 抗体等来提供额外的功能。但是，阎锡蕴研究小组的最近研究结果改
变了磁性材料是化学和生物惰性的观点。他们发现四氧化三铁磁性纳 米粒子具有类似过氧化物酶的催化活性，并提出了四氧化三铁磁性纳
米粒子模拟酶的概念(Gao, L. Z.; Zhuang, J.; Nie， L.; Zhang, J. B.; Zhang, Y; Gu， N.; Wang, T. H.; Feng, J.; Yang, D. L.; Perrett, S.; Yan, X" Intrinsic peroxidase-like activity of ferromagnetic nanoparticles. iVw. iVa"otec/mo/ogK 2007， 2， (9), 577-583)。
本发明基于类似思想，利用我们制备的四氧化三铁纳米粒子模拟 酶，提供了一种比色检测双氧水或葡萄糖的方法。
发明内容
基于四氧化三铁磁性纳米粒子模拟酶的概念，本发明目的之一是 提供基于四氧化三铁磁性纳米粒子模拟酶比色检测双氧水的方法。该 方法可用于双氧水的比色检测，从5X10^到1X10"mol/L浓度范围 内对双氧水检测呈现好的线性响应。
本发明的目的之二是提供一种用四氧化三铁纳米粒子模拟酶并 结合葡萄糖氧化酶来比色检测葡萄糖的方法。该方法可完成葡萄糖的 灵敏、特异检测。该方法对于葡萄糖比色检测的线性响应范围为5X IO-5到1X10-3 mol/L。
本发明所涉及化学反应的过程，如式(1)和(2):
葡萄糖氣化, f，、 試气+葡萄糖 双氧水+葡萄糖酸 、Z^
四氧化三铁纳米粒子模拟酶的制备步骤如下
(1) 将体积比为5: l的浓度为1M氯化铁水溶液和浓度为2 M
的氯化亚铁盐酸溶液混合，通氮气除氧10分钟；
(2) 在搅拌的同时将上述混合溶液滴加到浓度为0.7M的氨水溶 液，该氨水溶液除氧且氮气保护，所述的混合溶液中的1M氯化铁水 溶液与浓度为0.7M的氨水溶液的体积比为1: 10，室温反应30分钟， 得到的黑色四氧化三铁沉淀；
(3) 将反应得到的黑色四氧化三铁沉淀离心，用水洗涤，重新
分散于水中，得到四氧化三铁纳米粒子模拟酶贮备液。室温ie存备用。
利用四氧化三铁纳米粒子模拟酶比色测定双氧水的步骤如下
(1) 将浓度为60mM的2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺 酸)二铵盐、四氧化三铁纳米粒子模拟酶贮备液和待测定的11202样 品加入到的浓度为0.2 M的pH^4.0的醋酸缓冲溶液中，所述的浓度 为60 mM的2，2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐四 氧化三铁纳米粒子模拟酶贮备液&02样品浓度为0.2 M的pH=4.0
的醋酸缓冲溶液的体积比为24 : 10 : 24 : 185;
(2) 将(1)中所得混合液在45。C水浴中反应10分钟；
(3) 用外加磁场除去反应溶液中的四氧化三铁纳米粒子；
(4) 将去除四氧化三铁纳米粒子的反应液加入到水中，混合均匀，
测定吸收光谱；所述的去除四氧化三铁纳米粒子的反应液水的体积
比为1: 9。
利用本发明的比色方法对双氧水检测的表征如图1和图2所示。
从图1数据可以看出，我们的方法对于双氧水有很好的比色响应。
从图2数据可以看出，该方法对于双氧水的检出限为3X10—6 mol/L，线性范围是5 X 10'6到1 X l(T4 mol/L。
基于四氧化三铁纳米粒子模拟酶并结合葡萄糖氧化酶比色测定 葡萄糖的步骤如下
(1)将20 mg/mL葡萄糖氧化酶和待测的葡萄糖磷酸缓冲溶液 混合，丁」7。C反应30分钟，得到葡萄糖反应液；所述的20mg/mL 葡萄糖氧化酶待测的葡萄糖磷酸缓冲溶液的体积比为1: 10;所述 的待测的葡萄糖磷酸缓冲溶液浓度范围为1X10—5mol/L至IJ 1X1(X2 molZL，此溶液配制在10mM pH=7.0的磷酸缓冲溶液中；
(2)将浓度为60mM2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) 二铵盐、四氧化三铁纳米粒子模拟酶贮备液和浓度为0.2 M的 pH=4.0的醋酸缓冲溶液加入到上述步骤(1)的葡萄糖反应液中；
所述的浓度为60 mM 2，2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二 铵盐四氧化三铁纳米粒子模拟酶贮备液浓度为0.2 M的pH=4.0 的醋酸缓冲溶液葡萄糖反应液的体积比12: 5: 400: 110;
(3) 将(2)中的混合液于45 。C在水浴反应10分钟，用外加 磁场除去反应溶液中的四氧化三铁纳米粒子，得到最终反应液；
(4) 取步骤(3)中的最终反应液，进行吸收光谱测定。
利用本发明的比色方法对于葡萄糖检测的表征如图3和图4所示。
从图3数据可以看出，该方法可以完成葡萄糖的灵敏、特异的比
色检测。
从图4数据可以看出，该方法对于葡萄糖的检出限为3X10—5 mol/L，线性范围为5X10-5到1X10—3mol/L。
本发明的有益效果本发明中所合成的四氧化三铁纳米粒子，具 有过氧化物酶的功能，是一种新的过氧化物酶的模拟酶，不仅可以用 于比色分析，而且原则上可以推广应用于电化学等其它分析中；本发 明所制备的基于四氧化三铁纳米粒子模拟酶，可用于过氧化氢的比色 检测，对过氧化氢检测有好的灵敏度；本发明所制备的四氧化三铁纳 米粒子模拟酶结合葡萄糖氧化酶，可用于葡萄糖的比色检测，对葡萄 糖检测有好的选择性和灵敏度。
图1为向185 (iL 0.2 M pH 4.0醋酸缓冲溶液中加入24 60 mM 2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐，考察在45。C时四 ￥1化三铁模拟酶对双氧水氧化ABTS反应的催化活性图。图中的比色 照片为反应完成后拍摄而得。从左到右依次为不含H202但含有 Fe304、含有10 mM 1^202但不含Fe304、含有10 mM 1^02且含有 Fe304。 '
图2为用四氧化三铁纳米粒子模拟酶检测双氧水时得到的双氧水 浓度-417纳米处吸收值响应曲线(A);双氧水测量的线性校正曲线
(B)。图中可以看出，该传感器对于双氧水的检出限为3 X 10—6 mol/L， 线性范围是5 X l(T6到1 X Id4 mol/L。
图3为用葡萄糖氧化酶和西氧化三铁纳米粒子模拟酶检测葡萄 糖时拍摄的比色照片图。从左到右依次为500 )lM葡萄糖、缓冲溶 液、5mM果糖、5mM乳糖和5mM麦芽糖。图中可以看出，该传 感器可以完成葡萄糖的灵敏、特异的比色检测。
图4为用葡萄糖氧化酶和四氧化三铁纳米粒子模拟酶检测葡萄糖 时得到的葡萄糖浓度-417纳米处吸收值响应曲线图(A);葡萄糖测 量的线性校正曲线图(B)。图中可以看出，该传感器对于葡萄糖的 检出限为3X10-5 mol/L，线性范围为5X10-5到1X10—3mol/L。
具体实施方式
实施例1 .
四氧化三铁纳米粒子模拟酶的制备步骤如下
(1) 将50 mL浓度为1M氯化铁水溶液和10 mL浓度为2 M的 氯化亚铁盐酸溶液(2M)混合，通氮气除氧10分钟；
(2) 在剧烈搅拌的同时将上述混合溶液滴加到500 mL的浓度为 0.7M的氨水溶液，该氨水溶液除氧且氮气保护，室温反应30分钟， 得到的黑色四氧化三铁沉淀；
(3) 将反应得到的黑色四氧化三铁沉淀离心，用水洗涤三次； 重新分散于水中，得到四氧化三铁纳米粒子模拟酶，室温贮存备用。 实施例2
利用四氧化三铁纳米粒子模拟酶来比色检测双氧水的步骤如下
(1) 将24piL的浓度为60mM的2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻 啤啉-6-磺酸)二铵盐、10 jiL四氧化三铁纳米粒子模拟酶贮备液和24
的浓度为100 mM的H202加入到185 pL的浓度为0.2 M的 pH=4.0的醋酸缓冲溶液中；
(2) 将(1)中所得混合液在45。C水浴中反应10分钟； G)用外加磁场除去反应溶液中的四氧化三铁纳米粒子模拟酶，
得到去除四氧化三铁纳米粒子模拟酶的反应液；
(4)将IOO (3)中所得反应液，加入到900 ^L水中，混合 均匀，测定吸收光谱。 实施例3
利用四氧化三铁纳米粒子模拟酶，并结合葡萄糖氧化酶来比色检 测葡萄糖的步骤如下
(1) 将20 (iL 20 mg/mL葡萄糖氧化酶和200 不同浓度的葡 萄糖溶液混合，T 37 °C反应30分钟；所述的葡萄糖溶液的浓度为5 X10.5、 IXIO.4、 5X1(T4、 1X1(T3、 5X10—3和lX10-2mol/L;
(2) 将24 |iL浓度为60 mM 2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐、10 .uL四氧化三铁纳米粒子模拟酶贮备液和800 浓 设为0.2 M的pH=4.0醋酸缓冲溶液加入到上述步骤(1)的220
的葡萄糖反应液中；
(3) 将上述步骤(2)中的混合液于45 。C水浴反应10分钟，
用外加磁场除去反应溶液中的四氧化三铁纳米粒子；
(4) 取900)iL (3)中的最终反应液，进行吸收光谱测定。
权利要求
1、基于四氧化三铁纳米粒子模拟酶检测双氧水的方法，其特征在于，步骤如下四氧化三铁纳米粒子模拟酶的制备步骤如下(1)将体积比为51的浓度为1M氯化铁水溶液和浓度为2M的氯化亚铁盐酸溶液混合，通氮气除氧10分钟；(2)在搅拌的同时将上述混合溶液滴加到浓度为0.7M的氨水溶液，该氨水溶液除氧且氮气保护，所述的混合溶液中的1M氯化铁水溶液与浓度为0.7M的氨水溶液的体积比为110，室温反应30分钟，得到的黑色四氧化三铁沉淀；(3)将反应得到的黑色四氧化三铁沉淀离心，用水洗涤，重新分散于水中，得到四氧化三铁纳米粒子模拟酶贮备液；利用四氧化三铁纳米粒子模拟酶比色测定双氧水的步骤如下(1)将浓度为60mM的2，2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐、四氧化三铁纳米粒子模拟酶贮备液和待测定的H2O2样品加入到的浓度为0.2M的pH＝4.0的醋酸缓冲溶液中，所述的浓度为60mM的2，2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐四氧化三铁纳米粒子模拟酶贮备液H2O2样品浓度为0.2M的pH＝4.0的醋酸缓冲溶液的体积比为241024185；(2)将(1)中所得混合液在45℃水浴中反应10分钟；(3)用外加磁场除去反应溶液中的四氧化三铁纳米粒子；(4)将去除四氧化三铁纳米粒子的反应液加入到水中，混合均匀，测定吸收光谱；所述的去除四氧化三铁纳米粒子的反应液水的体积比为19。
2、基于四氧化三铁纳米粒子模拟酶并结合葡萄糖氧化酶来比色检测葡萄糖的方法，其特征在于，步骤如下(1) 四氧化三铁纳米粒子模拟酶的制备① 将浓度为1M的氯化铁水溶液和浓度为2 M的氯化亚铁盐 酸溶液(2M)混合，通氮气除氧10分钟；所述的浓度为1M的氯化铁水溶液氯化亚铁盐酸溶液(2M)的体积比为5: 1;② 在剧烈搅拌的同时将上述混合溶液滴加到浓度为0.7M的氨 水溶液，该氨水溶液除氧且氮气保护，室温反应30分钟，得到的黑 色四氧化三铁沉淀；所述的浓度为1M的氯化铁水溶液氯化亚铁 盐酸溶液(2M) : 0.7M的氨水溶液的体积比为5: 1: 50;③ 将反应得到的黑色四氧化三铁沉淀离心、用水洗涤并重新分 散于水中，得到四氧化三铁纳米粒子模拟酶贮备液；(2) 基于四氧化三铁纳米粒子模拟酶并结合葡萄糖氧化酶来比色检测葡萄糖的步骤如下(1)将20 mg/mL葡萄糖氧化酶和待测的葡萄糖磷酸缓冲溶液 混合，于37。C反应30分钟，得到葡萄糖反应液；所述的20mg/mL 葡萄糖氧化酶待测的葡萄糖磷酸缓冲溶液的体积比为h 10;所述 的待测的葡萄糖磷酸缓冲溶液浓度范围为1X10—5mol/L至lj 1X10—2 mol/L，此溶液配制在10mM pH=7.0的磷酸缓冲溶液中；(2)将浓度为60 mM 2，2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐、四氧化三铁纳米粒子模拟酶贮备液和浓度为0.2 M的pH=4.0的醋酸缓冲溶液加入到上述步骤(1)的葡萄糖反应液中；所述的浓度为60 mM 2，2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二 铵盐四氧化三铁纳米粒子模拟酶贮备液浓度为0.2 M的pH=4.0的醋酸缓冲溶液葡萄糖反应液的体积比12: 5: 400: 110;(3) 将(2)中的混合液于45 。C在水浴反应10分钟，用外加 磁场除去反应溶液中的四氧化三铁纳米粒子，得到最终反应液；(4) 取步骤(3)中的最终反应液，进行吸收光谱测定。
全文摘要
本发明涉及基于四氧化三铁磁性纳米粒子模拟酶检测双氧水或葡萄糖的方法。通过共沉淀方法得到四氧化三铁磁性纳米粒子模拟酶。该四氧化三铁磁性纳米粒子模拟酶具有类似过氧化物酶的催化性能。进一步将四氧化三铁磁性纳米粒子模拟酶用于检测双氧水，该方法可以实现双氧水的比色检测。对于双氧水的检出限为3×10<sup>-6</sup>mol/L，线性范围是5×10<sup>-6</sup>到1×10<sup>-4</sup>mol/L。将四氧化三铁磁性纳米粒子模拟酶和葡萄糖氧化酶联合，实现了葡萄糖的比色检测。对于葡萄糖的检出限为3×10<sup>-5</sup>mol/L，线性范围为5×10<sup>-5</sup>到1×10<sup>-3</sup>mol/L。此种比色方法检测葡萄糖，选择性和灵敏度高，无需复杂仪器。
文档编号G01N21/31GK101387606SQ200810051040
公开日2009年3月18日 申请日期2008年8月1日 优先权日2008年8月1日
发明者汪尔康, 辉 魏 申请人:中国科学院长春应用化学研究所