基因OsABAR1及其在提高水稻干旱和盐胁迫耐性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业科学领域，具体而言，本发明涉及通过提高水稻OsABARI基因的 表达来提高水稻干旱胁迫耐性和盐胁迫耐性。
【背景技术】
[0002] 水稻是全球最主要的粮食作物，全球有50%的人口以稻米为主食。水稻生产对保 障全球粮食安全，减少贫困人口和农村就业发挥着重要的作用。长期以来，水稻是我国播种 面积最大、总广量最多、单广最商的粮食品种，是我国65 %左右人口的主食，在粮食生广和 消费中处于主导地位。干旱和盐害是水稻生产上最严重的非生物逆境危害因子。水稻生产 直接受到水资源分布的影响，我国大部分地区耕地是干旱和半干旱地区，因此水资源的缺 乏和水稻需水量大的矛盾严重影响水稻种植面积的推广。此外，我国的盐碱土地面积达到 了一亿公顷，受盐侵害的稻田约占栽培面积的五分之一，并且土壤盐渍化有日益扩大和加 剧的趋势，造成的产量损失已难以估算。随着水稻抗逆机制研究的不断深入，利用基因工程 培育耐盐和耐旱的水稻新品系改良是解决这一农业问题的最有效途径之一。
[0003] 目前用于抗旱基因工程的基因主要包括以下几类。第一，参与渗透保护物质（如 脯氨酸、甘露醇、甜菜碱、海藻糖等）合成的基因。这样能够使植物在水分胁迫下能合成更 多的渗透调节物质如，以提高植物的渗透调节能力，从而增强植物的抗旱性。如在水稻中 过量表达脯氨酸生物合成途径上的关键酶基因（P5CS,deltal-pyrroline-5-carboxylate synthase)提高了转基因植株的抗旱性（Zhu等，1998，PlantSci，199:41 - 48);第二，编码 晚期胚胎富含蛋白（LEA)的基因。如在水稻中组成型地过量表达大麦的HVA1基因，导致转 基因植株耐旱性增强（Xu等，1996,PlantPhysiol，110:249 - 257);第三，调控基因。这类 基因包括与ABA生物代谢相关的基因（如NCED和ABA0X)及ABA信号传导途径相关的基因 (如编码bZIP类、Myb类、zinc-finger类转录因子的基因）。最近多个bZIP类转录因子被证 明影响干旱胁迫耐性，如 0sbZIP23, 0sbZIP72 和TRAB1 等（Xiang等，2008,PlantPhysiol, 148:1938-1952;Lu等，Planta，2009, 229:605 - 615;Hobo等，1999,ProcNatlAcadSci USA，96:15348 - 15353)。
[0004] 目前在水稻中已报道的与盐胁迫反应有关的转录因子，部分转录因子已经用于 耐盐基因工程改良中，主要包括以下几类：第一，DREB1/CBF调控子：水稻基因组包括至 少 10 个DREB1 (Dehydration-responsiveelementbindingprotein1)型基因，过量表 达OsDREBlA和OsDREBlF的转基因水稻植株的对高盐、干旱和冻害的抗性均增强，同时转 基因水稻植株几类积累了较高含量的渗透调节物质，如脯氨酸和各种可溶性糖（Itoet al.，2006;Wangetal.，2008)。第二，AREB调控子，ABA是植物非生物胁迫反应中的一个 关键信号分子。AREB基因编码bZIP-型转录因子，目前有几个bZIP型转录因子在盐胁迫反 应中的功能已有报道。0sABF2基因的T-DNA插入突变体（0sabf2)对高盐、干旱和氧化胁迫 的敏感性增强（Hossainetal.，2010)。过量表达0sABI5的转基因水稻对盐胁迫较为敏 感（Zouetal.，2008)。0sbZIP23基因的过表达转基因水稻的耐旱和耐盐性提高，而该基 因的功能缺失突变体对盐和干旱的抗性降低。
【发明内容】
[0005] 本发明从水稻日本晴中分离克隆到一个编码GRAM结构域的基因，该基因的表达 明显受到ABA的诱导，目前功能未知，申请人将其命名为OsABARl(ABA-responsivegene 1)。本发明发现OsABARl基因表达水平提高的转基因阳性水稻植株盐胁迫耐性和干旱胁迫 耐性均显著提高。在盐胁迫（200mMNaCl)条件下，对照材料的存活率为13%，而转基因水 稻幼苗的存活率为60?70%，均明显高于对照；在干旱（20%PEG4000)条件下，对照材料 的存活率为27%，而转基因水稻幼苗的存活率为60?90%。这为培育耐盐和耐干旱的多 抗、高抗作物品种提供了新的途径基因资源和新途径，具有一定的经济意义。
[0006] 本发明申请人在一个干旱和盐胁迫耐性提高的水稻突变体中，利用基因表达图 谱鉴定到一个序列号为AK061581、编码GRAM结构域的OsABARl基因。水稻OsABARl基因 0RF区序列为702个碱基，编码233个氨基酸和一个终止密码子。本发明是通过PCR方法， 扩增出水稻OsABARl基因的全长编码区（cDNA，包含702个碱基），正向连接在植物表达 载体pCAMBIA1390-35s上，构建成cDNA植物过表达载体pCAMBIA1390-35s-ABARl-cDNA; 或者利用PCR引物扩增出OsABARl基因0RF区对应的基因组DNA序列（gDNA，包含933 个碱基），正向连接在植物表达载体pCAMBIA1390-35s上，构建成gDNA植物过表达载体 pCAMBIA1390-35s-ABARl-gDNA。再利用农杆菌介导的遗传转化方法将两种植物过表达载体 分别转化至水稻品种日本晴中，提高OsABARl基因的表达，得到水稻OsABARl基因表达提高 的转基因水稻植株。在转基因的T3代植株中发现，阳性水稻植株的盐和干旱胁迫耐性明显 高于对照植株。
[0007] 本发明用于构建过量表达OsABAl基因的cDNA和gDNA植物表达载体、增强 OsABARl基因表达的cDNA序列和gDNA分别如SEQIDN0 :1和SEQIDN0 :2所示，氨基酸 序列如SEQIDN0 :3所示。
[0008] 本发明还涉及含有基因OsABARl的植物表达载体pCAMBIA1390-35s-ABARl-cDNA 或者pCAMBIA1390-35s-ABARl-gDNA。该表达载体的构建方法为：首先通过PCR方法扩增 水稻OsABARl基因的全长编码区cDNA(或者0RF区对应的基因组DNA序列gDNA)，然后 在PCR产物末端加A，再连接到PMD18-T载体；然后将克隆在pMD18-T载体上的OsABARl 基因cDNA片段（或者gDNA片段）利用BamHI和Spel酶切，插入pCAMBIA1390-35s植物 表达载体的BamHI和Spel之间，获得植物表达载体pCAMBIA1390-35s-ABARl-cDNA(或者 pCAMBIA1390-35s-ABARl-gDNA)。
[0009] 其中，植物表达载体pCAMBIA1390-35s是将克隆在pMD18-T载体上的椰菜花叶病 毒启动子35s利用Hindlll和BamHI双酶切，插入pCAMBIA1390植物表达载体上Hindlll 和BamHI之间，改造得到的植物表达载体。
[0010] 本发明利用水稻品种日本晴的OsABARl基因的cDNA片段和gDNA作为应用基因， 将该基因正向转入水稻中，提高OsABARl基因的表达水平，转基因阳性水稻植株表现出抗 盐性和抗旱性提高。
[0011] 本发明的优点在于：
[0012] (1)本发明提供了一种同时增强水稻干旱和盐胁迫的基因0ABAR1。申请人在水稻 中过量表达OsABARl基因后，发现转基因水稻干旱和盐胁迫耐性明显提高。
[0013] (2)本发明首次分离克隆了水稻OsABARl基因，并首次在水稻中过量表达了 OsABARl基因。为培育多抗、高抗水稻品种提供了新思路，也为其它作物利用异源基因技术 提高抗逆性提供了理论依据。
[0014] (3)本发明中所涉及的提高OsABARl基因的表达方法，除了用组成型启动子35S 夕卜，还可以用其它组成型启动子或者器官特异性启动子。因此通过提高OsABARl基因的表 达培育耐盐和耐干旱作物新品种具有较为广泛的应用空间。
[0015] (4)本发明中应用的基因可以为水稻等禾谷类作物以及其它作物抗旱、抗盐等抗 性研究提供了支持