一种早期旱胁迫诱导高羊茅滞绿基因sgr基因的筛选试剂盒及方法
【专利摘要】本发明公开了一种高羊茅滞绿基因SGR基因的筛选试剂盒及方法。本发明以PEG6000旱胁迫处理(0h、6h、12h、18h和24h)的高羊茅为实验材料，利用Illumina/Solexa测序平台的RNA-seq技术建立高羊茅转录组数据库，以已登记的来源于18个物种的51个SGR序列为探针，应用本地Blast(Local Blast)筛选在早期旱胁迫下的高羊茅SGR基因。本发明方法可以快速、全面的筛选在早期旱胁迫下的高羊茅SGR候选基因，对选育延长草坪草绿色期的分子育种具有重要指导意义。
【专利说明】-种早期旱胁迫诱导高羊茅滞绿基因SGR基因的筛选试剂 盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种高羊茅SGR候选基因的筛选试剂盒及方 法。
【背景技术】
[0002] 滞绿（staygreen)是指植物在衰老过程中叶绿素不降解或降解不明显的现象， 其最显著的特征是植株生育末期叶片保持绿色的时间较长，甚至完全不黄化。SGR基因在 高等绿色植物中相继被克隆出来。早期研究主要是通过经典定位法，即遗传分析后，通过 定位的染色体区域测序进行基因鉴定，再通过突变体互补验证。这些新发现的SGR基因主 要由核基因编码并受衰老特异诱导表达，大多数来源于C型滞绿突变体，C型滞绿突变体 的叶绿素降解功能因为遗传变异而异常，其叶绿素含量可以长期维持不变，但是，在生理 功能退化方面与野生型无异，如拟南芥的突变体nye-1，水稻的突变体sgr和nyc3,辣椒 (Capsicumannuum)的突变体cl，豌豆（Pisumsativum)的突变体JI2775,番爺（Solanum lycopersicon)的突变体gf，柑橘（Citrussinensis)的突变体nan，漢藜苜猜（Medicago truncatula)的突变体sgr等。
[0003] 已知的SGR蛋白结构中不包含任何已知的结构域，因此尚无法判断SGR可能的作 用途径。不过可以明确的是，与水溶性叶绿素结合蛋白相比，SGR无法结合叶绿素，因此， SGR不是参与叶绿素代谢过程的酶。Park等通过研究水稻的sgr (stay green)突变体发现 了OsSGR基因，并且发现该突变体中Psll捕光-叶绿素（LHCII-Chi)复合体有积累效应， 推测SGR基因作用于LHCII，是调控LHCII复合体稳定性的关键因子。在植物发生衰老时， 位于叶绿体的SGR结合并形成SGR-LHCII复合体从而将LHCII-Chl复合体结构拆分，其他 参与到叶绿体代谢途径中的分解蛋白酶便能够找到并结合到相应的亚基上进行下一步的 降解活动。因此，就目前的研究推测，LHCII-Chl复合体的解离是叶绿素降解途径的前提， 而SGR可能是参与LHCII-Chi拆卸的候选蛋白质。
[0004] 高羊茅（Festucaarundinacea)是禾本科羊茅属多年生草本植物，是我国目前使 用量增长最快的草种，在我国广泛栽培，是南方地区绿期最长的冷季型草坪。冷剂型草坪 草在夏季的"休眠"现象是生产利用中的主要限制因素。人们在草坪草种选择时更倾向于 绿期长的草种。SGR突变体虽然不能延长植物的光合作用，但表型变化可以满足人们对绿 色期延长的追求，所以延长绿色期是所有草坪草选育的主要目标之一。目前仅有研究报道 1 个高羊茅滞绿基因SGR候选基因senescence-induciblechloroplastnon-yellowing proteinl(GenBank:ADV57294. 1)，高羊茅SGR的分子基础和调节机制相关信息匮乏。
[0005] 随着高通量测序技术的迅猛发展，转录组分析方法已经从微阵列技术，SAGE及 MPSS技术的低通量模式改变成RNA-seq的高通量模式。RNA-Seq(RNA序列分析技术即全转 录组测序），具有明显的优势，仅需要较少的RNA样品，就可对某个物种或者特定细胞类型 的整体转录活动进行检测，更精确的揭不序列变化、基因表达的完整注释、基因在样品间的 差异表达分析和检测可变剪接等，使整个转录组以高通量和定量的方式加以调查。这些独 特的优势，使得RNA-Seq技术成为目前深入研究生物体转录组复杂性的强大工具，也被认 为是一种发现新基因的有效手段之一。
[0006] 数字基因表达谱（DigitalGeneExpressionProfiling,DGE)是利用高通量测序， 系统、快速地检测某一物种特定组织在特定状态下的基因表达情况的技术。DGE已被广泛应 用于基础科学研究领域。已有研究报道利用DGE对黄肉猕猴桃果实着色过程中相关差异基 因、脂多糖活化巨噬细胞的基因表达、茎瘤芥根和茎组织转录组比较和小尾寒羊高繁性状 相关基因的筛选和解析研究。
[0007]本地Blast(LocalBasicLocalAlignmentSearchTool)是在本地化的蛋白质或 DNA数据库中进行相似性序列比较的工具，已经被用于某一物种特定组织中某一个或家族 的基因筛选。已有研究报道利用拟南芥WRKY转录因子家族基因序列为探针，对苹果全基 因组序列执行本地Blast搜索，结合生物信息学方法来筛选苹果WRKY转录因子家族基因； 以拟南芥和水稻ANK家族基因序列执行本地Blast搜索'金冠'苹果全基因组序列，结合结 构域搜索工具⑶(conserveddonmain)、perl程序等生物信息学方法，解析苹果锚蛋白基因 ANK家族基因。
【发明内容】
[0008] 本发明旨在针对目如_羊矛SGR分子机制相关"[目息的匮乏，提供一种_羊矛SGR 基因的筛选试剂盒及方法。
[0009] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0010] 所述高羊茅SGR候选基因的筛选试剂盒，所述试剂盒包括表1所述的探针（共51 条）：
【权利要求】
1. 一种早期旱胁迫诱导高羊茅滞绿基因 SGR基因的筛选试剂盒，其特征在于，所述试 剂盒包括具有如下登录号的探针：
2. 如权利要求1所述探针在制备早期旱胁迫诱导高羊茅滞绿基因 SGR候选基因的筛选 试剂中的应用。
3. -种早期旱胁迫诱导高羊茅滞绿基因 SGR候选基因的筛选方法，其特征在于，所述 方法包括如下步骤： (1) 以质量百分比浓度为20 % PEG6000旱胁迫处理50d龄高羊茅根系Oh，6h，12h，18h 和24h ;其中，Oh为对照组，6h、12h、18h和24h为处理组； (2) 用Trizol法分别提取经步骤（1)旱胁迫处理后的高羊茅叶片的RNA，各处 理和对照组的混合RNA作为总转录组测序的样本来源；采用高通量测序技术平台 IllUminahiSeqTM2000进行转录组深度测序，得到若干读段原始数据，将所得的读段原始数 据进行过滤，过滤原则为：①去除包含接头的读段过滤时使用的接头序列SEQ ID NO. 1和 SEQ ID NO. 2 ;②去除含有未知碱基比例10%以上的读段；③去除低质量且碱基大于50%的 读段，所示低质量是指质量值小于5的读段；④去除平均质量值小于15的读段，得到可用读 段，然后对可用读段进行de novo拼接后组装得到高羊茅混合转录组库，高羊茅混合转录组 库中独立基因的平均长度为691bp，N50长度为1279bp ; (3) 采用权利要求1所述的探针对高羊茅混合转录组库进行Local Blast分析，设置 Local Blast分析的输出结果e-value阈值为le_5,筛选出优势表达的SGR基因； (4) 将步骤（1)所述的4个处理组分别与对照组进行数字基因表达谱分析；独立基因 表达量统计分析使用RPKM法，计算得到体现基因表达量的差异基因数据库，其计算公式 为：
设RPKM为独立基因的表达量，C为唯一比对到独立基因的读段数，N为唯一比对到所有 独立基因的总读段数，L为独立基因的碱基数；RPKM法能消除基因长度和测序量差异对计 算基因表达的影响，计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因表达差异； (5) 以步骤（4)获得的各处理的差异基因数据库分析步骤（3)获得的SGR独立基因，进 一步筛选旱胁迫下特异表达的SGR基因。
【文档编号】C12Q1/68GK104328165SQ201410254832
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年6月10日 优先权日:2014年6月10日
【发明者】张志飞, 王增裕, 赵志丽, 刘明稀, 文昭竹 申请人:湖南农业大学