促进兰州百合生长和耐干旱胁迫的2株内生真菌的制作方法
【专利摘要】本发明公开了促进兰州百合生长和耐干旱胁迫的2株内生真菌。干旱胁迫是阻碍兰州百合高效生产的重要原因，两株真菌对于解决兰州百合干旱胁迫的耐受性问题具有重要意义。它们可以在兰州百合根部定殖，用于兰州百合的育苗或栽培中，能够有效的促进兰州百合的生长和抵御干旱胁迫。77042013.05.3077032013.05.30
【专利说明】促进兰州百合生长和耐干旱胁迫的2株内生真菌
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程【技术领域】，具体地说涉及2株促进兰州百合生长和耐干旱胁 迫的内生真菌菌株。这两株真菌用于兰州百合的育苗或栽培中，能有效的促进百合生长和 抵御干旱胁迫。
【背景技术】
[0002] 兰州百合（Lilium davidii var. unicolor)是川百合的变种，在甘肃兰州及附近 地区栽培已有一百多年历史。兰州百合鳞茎肥厚洁白，质地绵软，甘美香甜，是百合中的珍 品；同时兰州百合还含有秋水仙碱、百合甙等多种药用成分以及维生素、矿质元素、氨基酸 等，中医上具有补中益气、理脾健胃、宁心安神、润肺止咳、清热利尿、解无名肿毒及止血等 功效，并且对肺癌和白血病有一定的抑制作用，药食兼用，在国内外享有很高的声誉。兰州 百合生长在海拔1800-2600m半干旱地区，生长周期长，一般3-5年才可收获。近些年来，由 于大气CO 2浓度的持续增加导致全球气候变暖，而气温的升高使土壤含水量降低从而引起 干旱的发生。干旱胁迫对全球农作物产量造成了严重损失，在百合种植区，干旱造成百合减 产，品质也严重降低，干旱胁迫成为阻碍兰州百合高效生产的重要原因。
[0003] 水分匮缺是干旱和半干旱地区影响植物生长的最普遍的因素，所以需要提高植 物捕捉和利用水分和养料的效率。利用植物内生真菌接种植物可以促进生长在干旱和 半干旱地区的植物对干旱胁迫的抗性（Marulanda et al.，2007)。在干旱胁迫时，内生 真菌不仅可以通过刺激植物产生避旱（形态改变)，耐旱（生理和生化适应）以及复水恢复 (Malinowski&Belesky, 2000)等机制应对干旱胁迫，而且它们能长期定殖于植物根部，还能 通过改善土壤结构并提高植物矿质营养吸收等方式来促进植物生长。植物内生真菌所具 有的增强植物对胁迫的抗性的能力为减轻全球气候变化对农业生产和当地的植物群落的 影响提供了一个新的策略。
[0004] 在我们对百合属植物种质资源挖掘和评价的研究中，我们在兰州百合及野生百合 属植物北京百花山山丹的根中观察到不同内生真菌的存在，并分离出多种内生真菌。利用 共生培养技术建立起兰州百合-内生真菌共生体系，筛选出两株促进兰州百合生长发育和 耐干旱胁迫的优良菌株，在兰州百合生产中具有良好的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供能够促进兰州百合生长和抗干旱胁迫的2种内生真菌，为 解决全球气候变化导致的水分匮缺对兰州百合生产的影响提供一个新的策略。
[0006] 本发明提供的2株内生真菌经鉴定分别为：LZl :Acremonium nepalense LZ1，保 藏编号为 CGMCC No. 7703 ;BH5 :Helotiales sp. BH5,保藏编号为 CGMCC No. 7704。这两株真 菌于2013年5月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。保藏单位 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物所。2株真菌的保藏和存活证明见 附件。
[0007] 2株真菌的培养特性分别为：
[0008] LZl :在PDA培养基上生长较快，25° C生长12天菌落直径可达到5cm。菌落平展， 表面白色，部分菌落从中心向边缘形成扇形的灰黑色区域，边缘淡粉色，后期整个菌落变成 深褐色。菌丝透明，厚垣孢子间生于菌丝中或顶生于短枝上。瓶梗多直接从菌丝长出，锥形， 光滑，顶端较细，长30?55 μ m ;有时也形成分生孢子梗，多较短，偶尔有分枝。分生孢子顶 生，不成链状，椭圆形，无色，光滑，大部分含有两个大油滴，3. 5?5. 0 μ mX 2. 0?2. 5 μ m。 基于以上培养特征和显微形态特征结果，依据《真菌鉴定手册》和《真菌的形态和分类》，可 知内生真菌LZl与尼泊尔枝顶孢（Acremonium nepalense)最为相似。所测得的18S rDNA 序列在Genebank核酸序列数据库中进行同源搜索，找出该菌株与数据库中同源性最高的 模式菌株。结合形态鉴定，确认菌株LZl为尼泊尔枝顶孢（Acremonium nepalense)，将该菌 株命名为尼泊尔枝顶孢LZl。
[0009] BH5 :在PDA培养基上生长极其缓慢，25° C生长21天菌落直径只有I. 9cm左右。 菌落灰黑色，中心形成突起，边缘白色，后期整个菌落变成黑褐色。气生菌丝较发达，绒毛 状，覆盖在菌落表面。在常规培养基上不产生孢子。
[0010] 本发明所述的2株内生真菌的内转录间隔区核糖体DNA的序列如序列表所示。
[0011] 本发明还涉及所述的2株内生真菌用于促进植物、特别是兰州百合的生长和/或 抵御干旱胁迫的用途。本发明还涉及在植物、特别是兰州百合的育苗和/或栽培中使用所 述真菌，用于促进生长和/或抵御干旱胁迫的用途。
[0012] 本发明的显著优点：本发明的内生真菌可以促进兰州百合的生长，并且在干旱胁 迫时，2株内生真菌可以增加兰州百合对干旱的耐受性，促进复水后百合幼苗的快速恢复和 生长，提高干旱胁迫条件下兰州百合的存活率。内生真菌来自兰州百合和百合科植物山丹 的根中，对人畜无毒无害，不造成环境污染，有助于解决兰州百合生产中面临的水分匮缺问 题，具有重要的经济意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1 :共培养35d后，LZl接种组与CK对照组的兰州百合组培苗的生长状况。
[0014] 图2 :共培养35d后，BH5接种组与CK对照组的兰州百合组培苗的生长状况。
[0015] 图3 :共培养35d后，基质相对含水量达到40%-50%中度干旱胁迫，LZl接种组与 CK对照组的兰州百合幼苗状况。
[0016] 图4 :共培养35d后，基质相对含水量达到40%-50%中度干旱胁迫，BH5接种组与 CK对照组兰州百合幼苗状况。
[0017] 图5IA :干旱胁迫处理23d后，LZl共培养组和CK对照组的百合幼苗状况。
[0018] 图5IB :干旱胁迫处理23d后，BH5共培养组和CK对照组的百合幼苗状况。
[0019] 图6IIA :重新浇水12d后，LZl共培养组和CK对照组的百合幼苗恢复状况。
[0020] 图6IIB :重新浇水12d后，BH5共培养组和CK对照组的百合幼苗恢复状况。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1
[0022] 内生真菌的分离和纯化：
[0023] 将采自兰州的兰州百合和北京百花山的山丹鳞茎基根自来水冲洗干净后用蒸馏 水冲洗，晾干后进行表面消毒：70%酒精处理40s，无菌水冲洗，然后用0. 1 %升汞液处理 7min，无菌水冲洗3-4次。在无菌条件下，取IOOuL最后一次冲洗所产生的无菌水涂布在 PDA培养基上，25° C培养24-72小时，观察有无菌落产生，依此验证此消毒方法是否杀死了 供试材料表面的微生物。
[0024] 在无菌状态下将基生根切成0. 2cm长的根段，置于PDA培养基内，25° C条件下静 止培养。组织块中出现菌丝后，挑取菌丝转接入新PDA培养基中纯化培养，反复几次即得到 内生真菌纯化菌株，将其接种于PDA培养基斜面试管中，保存于4° C冰箱中。所得的2株 内生真菌为LZl和BH5,已于2013年5月在中科院微生物所菌种保藏中心保藏。
[0025] 实施例2
[0026] LZl对兰州百合组培苗的促生长作用
[0027] 玻璃培养皿直径12cm，内盛80mL MS+20g/L蔗糖+琼脂7%，每皿接种2棵兰州百 合组培苗；在PDA培养基上活化的LZl菌株，用0. 5_的打孔器打取菌片，将一个菌片接种 在与苗相距Icm处，对照接一片相同大小的PDA培养基。在昼/夜=25° C/18° C，光照周 期14/10h，照度2000Lx条件下培养。共培养35d后，接种组的兰州百合组培苗的生长状况 显著优于对照组（图1)，与真菌LZl共培养的幼苗植株高度和幼苗干重分别比对照组增加 了 35. 8%和57. 1%，叶片数目和根分支数分别比对照增加95. 5%和52. 9%。
[0028] 实施例3
[0029] 干旱胁迫条件下LZl对兰州百合幼苗的促生长作用
[0030] 在250mL三角瓶的基部平铺一层粉碎至0· 5_lcm大小的杨树(杨柳科Salicaceae) 树叶，然后放入50g蛭石，12Γ C灭菌lh。每瓶加入25mL的MS+20g/L蔗糖营养液，无菌状 态下在树叶上放置在PDA液体培养基上培养的菌种0. 4mL，兰州百合组培苗接种在树叶上， 用蛭石把根埋好，不接菌的对照组接相同体积的PDA液体培养基。每瓶接种2棵幼苗，以带 透气孔的封口膜封口，在28° C，照度2000LX条件下连续光照培养。实验开始基质相对含 水量达到约90%，然后放置在培养室通过基质中水分的散失使其自然干旱，每日上午9:00 时称重，计算基质实际相对含水量。共培养35d后，基质相对含水量达到40%-50%中度干旱 胁迫，对照组兰州百合幼苗叶片全部枯萎，而LZl接种组仅有部分叶片枯萎（图3A，B)。LZl 接种组百合幼苗小鳞茎是对照的1. 875倍，幼苗干重比对照增加140%。共培养35d后，将 LZl接种组及对照组百合幼苗移栽入盛有栽培基质(草炭土 ：蛭石=3:1)的花盆中，正常浇 水诱导12d之后，断水进行模拟干旱处理，模拟干旱处理23d后重新浇水，记录与LZl共培 养组和对照组幼苗对干旱胁迫的反应。结果显示：干旱胁迫处理23d后，LZl共培养组和对 照组百合幼苗都显示严重的萎蔫症状，且对照组部分幼苗地上部分枯萎（图5IA)。但是重 新浇水12d后，LZl共培养组百合幼苗能快速恢复，并且存活率为100%，而对照组恢复缓慢， 并且恢复率只有70-80%(图6IIA)。表明LZl能显著提高干旱胁迫后百合幼苗的生长和恢 复能力。
[0031] 实施例4
[0032] BH5对兰州百合组培苗的促生长作用
[0033] 玻璃培养皿直径12cm，内盛80mL MS+20g/L蔗糖+琼脂7%，每皿接种2棵兰州百 合组培苗；在PDA培养基上活化的BH5菌株，用0. 8mm的打孔器打取菌片，将一个菌片接种 在与苗相距2cm处，对照接一片相同大小的PDA培养基。在昼/夜=25° C/18° C，光照周 期14/10h，照度2000Lx条件下培养。共培养35d后，接种组的兰州百合组培苗的生长状况 显著优于对照组（图2)，与真菌BH5共培养的幼苗干重比对照组增加了 25. 1%，叶片数目和 根分支数分别比对照增加37. 9%和33. 3%。
[0034] 实施例5
[0035] 干旱胁迫条件下BH5对兰州百合幼苗的促生长作用
[0036] 在250mL三角瓶的基部平铺一层粉碎至0· 5_lcm大小的杨树(杨柳科Salicaceae) 树叶，然后放入50g蛭石，12Γ C灭菌lh。每瓶加入25mL的MS+20g/L蔗糖营养液，无菌 状态下在树叶上放置在PDA液体培养基上培养的BH5菌种0. 4mL，兰州百合组培苗接种在 树叶上，用蛭石把根埋好，不接菌的对照组接相同体积的PDA液体培养基。每瓶接种2棵幼 苗，以带透气孔的封口膜封口，在28° C，照度2000Lx条件下连续光照培养。实验开始基质 相对含水量达到约90%，然后放置在培养室通过基质中水分的散失使其自然干旱，每日上午 9:00时称重，计算基质实际相对含水量.共培养35d后，基质相对含水量达到40%-50%中度 干旱胁迫，对照组兰州百合幼苗叶片全部枯萎，而BH5接种组仅有部分叶片枯萎（图4A，B)。 BH5接种组百合幼苗小鳞茎是对照的1. 625倍，幼苗干重比对照增加60%。共培养35d后， 将BH5接种组及对照组百合幼苗移栽入盛有栽培基质(草炭土 ：蛭石=3:1)的花盆中，正 常浇水诱导12d之后，断水进行模拟干旱处理，模拟干旱处理23d后重新浇水，记录与BH5 共培养组和对照组幼苗对干旱胁迫的反应。结果显示：干旱胁迫处理23d后，BH5共培养组 和对照组百合幼苗都显示严重的萎蔫症状（图5IB)，且对照组部分幼苗地上部分枯萎。但 是重新浇水12d后，BH5共培养组百合幼苗能快速恢复，并且存活率为100%，而对照组恢复 率只有70-80%(图6IIB)。表明BH5能显著提高干旱胁迫后百合幼苗的生长和恢复能力。
【权利要求】
1-保藏编号为[61\〇^1^0.7703 的尼泊尔枝顶抱（4(^61]1011；[11111116。3161186 81：四；[111^1) 或保藏编号为CGMCC No. 7704的柔膜菌目真菌（Helotiales sp. BH5)。
2. 根据权利要求1所述的真菌用于促进植物生长和/或抵御干旱胁迫的用途。
3. 根据权利要求2所述的用途，其中在植物的育苗和/或栽培中使用所述真菌。
4. 根据权利要求2或3所述的用途，其中所述植物是兰州百合。
【文档编号】C12N1/14GK104277979SQ201310284777
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月8日 优先权日:2013年7月8日
【发明者】武利勤, 尚宏忠, 白锦荣, 顾海科, 王青, 刘桂君 申请人:北京市辐射中心