一种提高水稻抗干旱、盐害胁迫能力的内生烟曲霉及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一株内生烟曲霉及其应用，主要应用于水稻对干旱和盐害等非生物逆 境胁迫环境的耐受能力，实践证明该烟曲霉可W用于提高水稻对上述非生物胁迫因素的抗 性。
【背景技术】
[0002] 水稻（化yzasativa)原产亚洲热带，在中国广为栽种后，逐渐传播到世界各地。世 界上近一半人口，都W大米为食，故水稻的种植与生产对国计民生有重要影响。
[0003] 植物的内生菌是一类在植物生活史中的某一阶段生活于健康组织或器官内部的 微生物，近年来的研究表明，内生菌在协助寄主植物抵抗各种胁迫环境中扮演着十分重要 的角色，如病害、干旱、高盐等生物因素或非生物因素引起的氧化胁迫。由于自然界的内生 真菌的生物多样性极为丰富，提供了丰富多样的次生代谢产物及生物活性类物质，对工农 业生产、人类健康具有重要的价值，因而具有巨大的经济效益和社会效益。
[0004] 烟曲霉属于半知菌类真菌，本菌主要存在于谷物、污染的食品、±壤和霉腐物中， 或寄藏于种子上，能引起人、畜和禽类的肺曲霉病及其他疾病，可侵染棉铃和苹果等，引起 果实腐烂。本菌能产生烟曲棒麦角素（fumigaclavines)、烟曲霉震颤素（fumitremorgins)， 烟曲霉素（fumigillin)、烟曲霉毒素（fumitoxins)、痛抱青霉原（verruculogen)等多种次 生代谢产物，但关于烟曲霉对植物的促生作用，目前国内外还鲜有报道。 阳0化]本发明从疏花水柏枝（MyricariaIaxiflora)根中分离得到一株内生烟曲霉，它 能很好地提高水稻对干旱及盐害的抗性，可服务于水稻的种植与生产。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一是提供一种烟曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17菌株，该烟 曲霉能很好地提高水稻的抗性，可用于水稻抗干旱和盐害胁迫方面，为开发优质的水稻提 供了新方向。
[0007] 所述烟曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17 是从疏花水柏枝（Myricaria Laxiflora)的根中获得的内生真菌，于2015年5月11日保藏于中国典型培养物保藏中屯、， 保藏编号为：M2015286。保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
[0008] 本发明烟曲霉（AspergillusfumigaUis)SG17在PDA培养基上具有W下微生物学 特性：菌落开始为白色，经2-3日后转为蓝绿色，但边缘仍为白色，日久培养后变为深绿色、 烟绿色。初为绒状或絮状，随着时间的推移变为粉末状，边缘部分也出现颜色，背面无色或 带点黄褐色。仅上半部产圆筒形分生抱子，颜色为深浅不同的绿色，分生抱子梗光滑，顶囊 为烧瓶状。
[0009] 本发明目的是提供一种用于提高水稻对干旱和盐害胁迫抗性的菌剂和生物改良 剂，其活性成分为烟曲霉SG17。胁迫试验表明，烟曲霉SG17能提高水稻的广谱抗性。本领 域技术人员很容易想到将本发明菌株的发酵液或发酵液提取物作为提高水稻抗性的有效 成分用于水稻抵抗干旱和盐害胁迫。因而，本发明还包括含有所述菌株或者其发酵产物的 生物改良剂。
[0010] 本发明W烟曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17的DNA为模板，上游引物口Sl: 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCG-3 '，下游引物口S4 :5 ' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 '，进行菌 落PCR扩增，获得560bp的18SrDNA部分序列（SEQIDNO:1)。通过Blast与GenBank收 录的序列进行比对，发现SG17与烟曲霉的同源性为100%。
【附图说明】
[0011] 图1为本发明的烟曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17的菌落形态。
[0012] 图2为本发明的烟曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17的显微形态。
[0013] 图3为本发明的烟曲霉（Aspergillusfumiga化s)SG17菌体提高水稻抗干旱胁迫 作用效果。其中，A.胁迫前，B.干旱+SG17，C.干旱，化干旱+脯氨酸，E.空白。脯氨酸溶 液浓度为5Xl〇5m〇l/l空白为自来水。
[0014] 图4为本发明的烟曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17菌体提高水稻抗盐害胁迫 作用效果。其中，F.胁迫前，G.盐害+SG17，H.盐害，I.盐害+脯氨酸，J.空白，脯氨酸溶 液浓度为5X10 5m〇l/l空白为自来水。
【具体实施方式】
[0015] 实施例一：烟曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17的分离和保存
[0016] 2012年在=峡流域湖北宜昌境内姻脂巧采集疏花水柏枝根，表面消毒后接种于加 工作浓度为25yg/ml青霉素的PDA固体培养基分离真菌。
[0017] 表面消毒：取疏花水柏枝根用自来水冲洗5次，无菌滤纸擦干后，75 %酒精浸泡 Imin,无菌水冲洗3次，再用3 %次氯酸钢浸泡60S，然后用无菌水冲洗5次，无菌滤纸洗干 根表面水分。
[0018] 培养：用无菌剪刀将表面消毒后的根剪成0. 5*0. 5cm大小，接种于加工作浓度为 25yg/ml青霉素PDA固体培养基（马铃馨200g/L、葡萄糖20g/l、琼脂20邑/1、化6. 0-6. 5)， 置于28 °C下培养。
[0019] 菌株纯化：待平板上长出菌落后，根据形态挑取单菌落接种于新的PDA固体培养 基中，置于28°C下培养。
[0020] 菌株保藏：待菌株纯化后，挑取纯菌株接种于PDA斜面培养基，28°C培养4d，用灭 菌的液体石蜡封藏于4°C保藏。
[0021] 将该菌株烟曲霉（Aspergillusfumiga化S)进行保藏，保藏名称为SG17 ;保藏单 位：中国典型培养物保藏中屯、；保藏地址为中国，武汉，武汉大学；保藏日期：2015年5月11 日；保藏编号为，M2015286。
[0022] 实施例二：烟曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17 鉴定
[0023] 菌株的形态特征和显微特征见附图1.。
[0024] 18SrDNA序列分析：采用通用引物进行菌落PCR扩增18SrDNA序列。上游引物 ITS1 :5' -TCCGTAGGTGAACCTGCG-3'，下游引物口S4 :5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。反 应体系如下：
[0026]反应条件：94°C预变性 5min，94°C变性lmin，56°C退火 30sec，72°C延伸l.min，33 个循环，最后72°C延伸lOmin。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，挑取750bp左右的条 带进行凝胶回收，送上海生工测序。
[0027] 将测得的序列提交至GenBank,并获得登录号KR812470。
[0028]实施例S:烟曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17 菌体的制备
[0029] 菌体制备：取保存4°C冰箱的烟曲霉种划线接种于PDA平板中，28°C下，培养4山获 得菌体。
[0030] 发酵液制备：用打孔器在上述菌落培养基平板上打取1个菌饼置于含100mLPDA 液体培养基的500ml的=角锥形瓶中，摇匀，然后置于28°C摇床振荡培养（120rpm)，获得发 酵液。
[0031] 实施例四：烟曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17菌体提高水稻抗干旱胁迫能力 作用
[0032] 水稻幼苗制备：将从4°C冰箱中取出的日本晴种子置于自来水中浸泡4山促使其 生根发芽，并每隔1化更换一次水。4d后将其种植在盛装有±壤的塑料杯中，定期诱水，7d 后即可获得水稻日本晴幼苗。
[0033] 干旱胁迫试验：将发酵液超声波破壁化后加入到日本晴幼苗中得到实验组，用 5X105mol/l脯氨酸溶液代替发酵液为正对照组，自来水为空白组，不补充任何物质为干旱 胁迫，每组做=个平行，将上述幼苗放置25-3(TC的室溫下培养。胁迫开始前一天向各幼苗 充分诱水，在胁迫期间只定量向空白组补充水分，共胁迫12天。
[0034] 实施例五：水稻干旱胁迫后幼苗生理指标检测
[0035] 丙二醒含量：植物在逆境下遭受伤害与活性氧积累诱发的膜脂质过氧化作用密切 相关，膜脂质过氧化的产物有脂质过氧化物、丙二醒、乙烧等，其中丙二醒是最重要的产物 之一。因此可通过测定丙二醒含量了解膜脂质过氧化的程度，W间接测定膜系统受损程度 W及植物的抗逆性。利用南京建成生物工程研究所的植物丙二醒测定试剂盒测定丙二醒含 量。
[0036] 脯氨酸含量：在正常环境条件下生长的植物，体内游离脯氨酸的含量较低；但在 逆境条件下，植物体内游离脯氨酸的含量可显著增加。脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶 体及组织内的代谢过程。因此，游离脯氨酸的含量可作为植物抗逆性的指标。利用南京建 成生物工程研究所的脯氨酸测试盒测定脯氨酸含量。
[0037] 干旱胁迫后丙二醒及脯氨酸的检测结果
[0038] 表一干旱后水稻丙二醒含量
[0040] 表二干旱后水稻脯氨酸含量
阳042] 表1. 2中的正对照是为5XIO-SmoVl脯氨酸溶液，空白为自来水。
[0043] 实施例六：烟曲霉（Aspergillusfumigatus)SG17菌体提高水稻抗盐害胁迫能力 作用 W44] 水稻幼苗制备：将从4°C冰箱中取出的日本晴种子置于自来水中浸泡4山促使其 生根发芽，并每隔1化更换一次水。4d后将其种植在盛装有±壤的塑料杯中，定期诱水，7d 后即可获得水稻日本晴幼苗。
[0045] 盐害胁迫试验：将发酵液超声波破壁化后加入到日本晴幼苗中得到实验组，用 5X10 5mol/l脯氨酸溶液代替发酵液为正对照组，自来水为空白组，不补充任何物质为干 旱胁迫，每组做=个平行，将上述幼苗放置25-3(TC的室溫下培养。胁迫开始前一天向实验 组及正对照组中充分加入7. 5g/LNaCl溶液，在胁迫期间定量向各幼苗补充水分，共胁迫12 天。
[0046]
【主权项】
1. 烟曲霉)SG17,于2015年5月11日保藏于中国典型培养 物保藏中心，保藏编号为：M2015286。2. -种用于提高水稻抗干旱及盐害胁迫的改良剂，其活性成分为烟曲霉。3. -种生物改良剂，其含有权利要求1的烟曲霉。4. 权利要求1所述的烟曲霉、权利要求2所述的改良剂或权利要求3所述的生物改良 剂在提高水稻抗干旱及盐害胁迫中的应用，其逆境胁迫为干旱及盐害。5. 权利要求1所述的烟曲霉或权利要求2所述的生物改良剂在提高水稻抗干旱及盐害 胁迫能力中的应用。6. 权利要求5所述的应用，其中所述的生物改良剂提高水稻对干旱及盐害胁迫的抗 性。7. 权利要求1-6任一项所述的烟曲霉，该烟曲霉自疏花水柏枝的根中分离得到。
【专利摘要】本发明公开了一种烟曲霉及其应用。该烟曲霉保藏名称为<i>Aspergillus</i><i>？fumigatus？</i>SG17；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国，武汉，武汉大学；保藏日期：2015年5月11日；保藏编号为M？2015286。本发明经实验证明，烟曲霉菌体能提高水稻的对干旱和盐害胁迫的抵抗能力，不仅可以提高水稻在上述非生物胁迫条件下的生长，同时为筛选具有新型抗胁迫活性物质的微生物奠定了良好的基础，具有很好的经济和社会效益。CCTCC NO：M 201528620150511
【IPC分类】C12N1/14, A01P21/00, A01N63/04, C12R1/68
【公开号】CN105219651
【申请号】CN201510504330
【发明人】刘士平, 蒋维, 孔玉珊, 秦王阁阁, 李渊韬, 薛艳红, 高媛
【申请人】三峡大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年8月17日