蜡质发育调控基因cflap1及其在植物抗旱上的应用
【专利摘要】本发明公开了蜡质发育调控基因CFLAP1及其在植物抗旱上的应用。该基因编码序列表中SEQ ID No：3所示氨基酸序列的蛋白质，其基因组DNA序列和cDNA序列分别如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。CFLAP1基因具有调控拟南芥蜡质合成的功能，该基因组成型表达的转基因植物中莲座叶表面蜡质显著增加，具有广泛的抗旱应用价值。
【专利说明】
蜡质发育调控基因 CFLAP1及其在植物抗旱上的应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一个来源于拟南芥调控蜡质发育的转录 因子及其在抗旱相关方面的应用。
【背景技术】
[0002] 水是生命之源。对于陆地上生长的植物而言，如何获得、保留水分对其生存至关重 要。我国淡水资源有限，而且分布极为不均匀。整体表现为南方相对充足，而北方普遍缺乏 的状态。对于我国北方大面积的粮食主产区而言，如何应对旱情是一个迫在眉睫的问题。 目前的抗旱措施，主要体现在灌溉设施的改善和灌溉机械的使用、水源的开发（如：南水北 调）、抗旱品种的筛选及应用等。
[0003] 对于植物抗旱的生理生化基础，目前还知之甚少。植物激素 ΑΒΑ被普遍认为是植 物响应干旱胁迫的信号分子，它能通过调控气孔的关闭从而有效地减少水分流失。除此之 外，植物还能够通过其它方式应对干旱胁迫，例如形成保水的角质层。角质层是一层覆盖在 陆生植物表面的疏水结构，主要由角质和蜡质构成。角质层能够有效地减少水分蒸发、抵抗 各种生物胁迫及非生物胁迫，因此它对于陆生植物的生存具有重要的意义。角质层的发育 是否良好会严重影响植物在陆地，特别是在干旱陆地上的生存。因此，筛选角质层发育相关 的突变体，不失为一种可行的筛选抗旱优良品种的方法。
[0004] 目前的研究表明，角质层的发育主要分成角质和蜡质的合成。角质由角质单体通 过酯键连接而成，形成一个复杂的三维网状结构，它是构成角质层的主要骨架。蜡质是由超 长链脂肪酸及其衍生物组成的混合物，含有各种碳链长度在24-34之间的脂肪酸、醇类、醛 类、酮类以及酯类等。蜡质可以填充在具有三维网格的角质间隙中，也可以分泌到角质外， 形成特定形状的蜡质晶体。有意思的是，虽然角质和蜡质均是角质层的主要成分，但它们在 抗旱上的效果却很不一样。在番前突变体cutin deficient l(cdl)、cd2和cd3的突变体 中，番茄果实上的角质合成减少了 95-98%，但是果实的失水效率几乎不受影响（Isaacson et al·，2009, Plant Journal, vol, 60:363-377)。这暗示着，角质层的厚度，特别是角质的 厚度对于植物水分蒸发的速率影响不大。与之相反，若用机械手段去除番茄果实表面角质 层中的外蜡质，将使得失水增加2-4倍；若用氯仿浸泡去除角质层内外所有蜡质，将使得失 水效率增加到44倍之多。进一步的研究表明，蜡质对于控制番茄果实水分流失的贡献约为 70% (Leide et al·，2007, Plant Physiology, vol, 144:1667-1679)。
[0005] 目前，拟南芥中只发现了少数几个参与角质层形成的转录因子。其中研 究得最为透彻的转录因子是WIN1 (wax inducer 1) /SHN1，它属于一类乙稀响应 因子类（Ethylene Response Factor (ERF)-Type)的转录因子。在拟南芥中过表 达WIN1/SHN1会导致叶片和茎的蜡质积累，从而赋予转基因植株较强的抗旱能 力（Broun et al·，2004,PNAS，vol,101:4706-4711 ;Aharoni et al·，2004,Plant Cell, vol, 16:2463-2480)。
[0006] 综上所述，利用角质层特别是与蜡质相关的表型来筛选抗旱品种是一种可行的手 段。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一个调控蜡质发育的基因及其编码的蛋白，用于培养增强抗 旱性的植物。
[0008] 本发明所提供的植物錯质发育调控基因，来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana) 的Columbia-0生态型，编码下述下述蛋白质（i)或（ii):
[0009] (i)序列表中的SEQ ID No :3所示氨基酸序列的蛋白质；
[0010] (ii)序列表中的SEQ ID No :3所示氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、 缺失和/或添加而衍生的蛋白质，并且所衍生的蛋白质具有与（i)所述蛋白质相同的功能。
[0011] 该蛋白具有调控植物角质层发育，特别是蜡质发育的功能，具有bHLH结构域，能 够结合DNA，具有转录激活活性。
[0012] 具有序列表中的SEQ ID No :3所示氨基酸序列的调控蛋白命名为CFLAP1。序列表 中的SEQ ID No :3序列由379个氨基酸残基组成，具有磷酸化位点（第30位氨基酸残基和 第157位氨基酸残基）、核定位信号位点（第307位到324位氨基酸残基）和保守的bHLH 结构域（第305位到第361位氨基酸残基）。
[0013] CFLAP1蛋白的基因序列可如SEQ ID N0 :1所示，其中编码区序列如SEQ ID N0 :2 所示，编码的蛋白其氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示。
[0014] 含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系、转基因植物及宿主菌均属于本发明 的保护范围。
[0015] 扩增CFLAP1中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
[0016] 本发明的另一个目的是提供一种可能提高植物抗旱性的方法。
[0017] 本发明提供的提高植物抗旱性的方法是：通过转基因技术在植物中表达所述调控 蜡质发育的基因 CFLAP1。具体的，将上述具有调控角质层发育特别是蜡质发育的基因或者 修饰过的基因导入植物细胞、组织或者器官，然后再将被转化的细胞、组织或者器官培育成 植株，从而获得抗旱性提高的转基因植物。
[0018] 上述方法中提及的基因序列，既可为CFLAP1基因的cDNA序列，又可为所述基因 的基因组DNA序列；或者是与所述基因具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序 列，是将所述基因的cDNA或基因组DNA序列利用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设 计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可 能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用（例如，反义或共抑制技术，添加转 录增强因子或者抑制因子）中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序 列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员 熟知的。
[0019] 本发明中拟南芥蜡质发育的调控因子CFLAP1或其同源序列可通过植物表达载 体导入植物组织、细胞或器官。用于构建所述转基因的植物表达载体可为任意一种可用 于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如 GatewayTW系列载体（如pK2GW7等）、pBin系列载体（如pBin 19等）、pCAMBIA系列载体 (如PCAMBIA1301等）、pjim系列载体（如pjim 19等）、pER8、pX6或其它衍生的植物表达 载体。上述载体的构建过程中，还包含有可在原核生物中复制的中间载体，如pENTER-TOPO、 pUC系列载体或pBluescript系列载体等。
[0020] 使用本发明中CFLAP1基因或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核 苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型的启动子。所述组成性表达启 动子可为花椰菜花叶病毒（CAMV) 35S启动子、玉米Ubiquitin启动子或水稻Actinl启动子 等；所述组织特异性表达启动子可为根特异性表达启动子、叶片特异性表达启动子、维管特 异性表达启动子、种子特异性表达启动子、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子； 所述诱导型启动子可为受低温、干旱、ABA、乙烯、盐碱或化学等诱导的启动子；上述启动子 可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体 时，还可使用增强子（包括翻译增强子或转录增强子），这些增强子区域可以是ATG起始密 码子或邻接区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确 翻译。使用本发明的基因构建植物表达载体时，也还可以使用抑制子，抑制子的添加也不应 该影响该基因的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然 的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0021] 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工修饰。如：加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因 （⑶S 基因、GFP基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（潮霉素磷酸转移酶基因、庆 大霉素标记物或卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。也 可以从转基因植物的安全性考虑，不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。经 上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行 检测，以确定其是否转化有目的基因。
[0022] 携带有编码本发明的角质层发育调控基因 CFLAP1或其同源序列的植物表达载体 可通过使用原生质体-化学介导法（Ca2+、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA 转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几 种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株； 所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。
[0023] 通过将转化有本发明的蜡质发育调控基因 CFLAP1或与所述基因具有90%以上同 源性且编码相同功能蛋白的DNA序列的转基因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出 基因纯合的转基因植株。此外，还可对该转基因植株进行扩繁，可使转基因植物的性状进一 步改善和提高。所述转基因植物的扩繁包括无性繁殖和/或种子繁殖。
[0024] 本发明鉴定了一个全新转录因子CFLAP1，它可以参与拟南芥蜡质合成的调控。 CFLAP1基因组成型表达的转基因植物中莲座叶表面蜡质显著增加，具有广泛的抗旱应用价 值。
【附图说明】
[0025] 图1是实时定量PCR检测CFLAP1基因在转基因植物中的表达情况。
[0026] 图2是利用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS)对提取自转基因植物和同时期的野生 型叶片表面蜡质的分析结果。
【具体实施方式】
[0027] 下述实施示例中分子生物学相关实验所用方法均为常规方法，具体步骤可参见： ((Molecular Cloning:A Laboratory Manual)) (Sambrook, J. , Russell, David ff. ,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。所用引物 由生工生物工程（上海）有限公司合成。
[0028] 1、基因序列的获得
[0029] 从野生型拟南芥中提取得到基因组DNA，参考The Arabidopsis Information Resource (TAIR，www. arabidopsis. org)网站上的数据库信息，得到基因编号为Atlg51140 的基因序列，命名为CFLAP1。
[0030] 2、CFLAP1基因序列的扩增及序列分析
[0031] 用TRIzol试剂提取野生型拟南芥的总RNA，利用反转录试剂反转录得到cDNA。 以得到的cDNA为模板，根据TAIR提供的编码区序列设计引物，通过PCR的方法扩增得到 CFLAP1的编码区序列，引物序列如下：
[0032] 正向引物：5'-CACCATGGAATCAGAATTCCAGCAACATC-3'（SEQ ID NO :4)
[0033] 反向引物：5'-TCACGCACTAGAGCATCTACATCTT-3'（SEQ ID NO :5)
[0034] 具体的PCR扩增条件（25yL体系）：5Xfast Pfu buffer 5yL，正反向引物 (10 μ Μ)各 1 μ L，cDNA 模板 1 μ L，dNTP 2 μ L，fast Pfu 酶 0· 5 μ L，H20 14. 5 μ L。PCR 反应 条件为：预热95°(：预变性31^11，然后94°(：变性3〇8、56°(：退火3〇8、72°(：延伸21^11，共进行 34个循环；最后72°C延伸5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检 测，经扩增获得了大小为1140bp的DNA片段。上述所用RNA相关试剂购买自Invitrogen 公司，扩增所用试剂购买自Transgen公司。
[0035] 回收并纯化上述PCR产物，将其连接到Gateway入门载体pENTR-TOPO中。将该连 接产物用热激法转化到大肠杆菌（E. coli)DH5 α感受态细胞中，用含有50mg/L卡那霉素 的LB固体培养基筛选阳性克隆，并用前述引物进行PCR鉴定。鉴定后的阳性单菌落加入到 10mL含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在37°C、220rpm下培养12-16小时，提质粒， 得到含有目的片段的重组质粒，命名为pENTER-TOPO-CFLAP 1。对上述质粒进行测序，结果与 TAIR数据库中发布的序列一致。上述pENTER-TOPO载体购买自Invitrogen公司。
[0036] 3、组成型表达CFLAP1的转基因拟南芥的获得
[0037] 通过Gateway技术的LR反应将上述重组载体pENTER-TOPO-CFLAPl中的CFLAP1 片段克隆到植物表达载体PB2WG7 (购买于比利时Ghent大学）中。LR反应的5 μ L体系为： PB2WG7 载体质粒 1. 8 μ L、pENTER-TOPO-CFLAPl 载体质粒 2 μ L、1Μ TE (Tris-EDTA)缓冲液 0. 5 μ L、LR Clonase 0. 7 μ L。LR反应条件为25°C或者室温静置3-4小时。通过热激法将 上述LR反应体系转化大肠杆菌（E. coli)DH5 α感受态细胞，用含有50mg/L壮观霉素的LB 固体培养基筛选阳性克隆，并用前述引物进行PCR鉴定。鉴定后的阳性单菌落加入到10mL 含50mg/L壮观霉素的LB液体培养基中，在37°C、220rpm下培养12-16小时，提取质粒，得 到含有目的片段的重组质粒，命名为PB2GW7-CFLAP1。
[0038] 将测序正确的植物表达载体PB2GW7-CFLAP1通过冻融法转入到农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)GV3101中，该农杆菌菌株本身具有庆大霉素和利福平抗性。 其步骤是：约lyg PB2GW7-CFLAP1质粒加入农杆菌GV3101感受态中，冰浴5min，液氮中 5min，置于37°C水浴5min，然后加入400 μ L LB液体培养基，放入28°C摇床中，220rpm恢复 培养3-4h后，涂在含有10mg/L利福平、50mg/L庆大霉素、50mg/L壮观霉素的LB固体培养 基上，28°C温箱中生长2天后用前述引物进行PCR鉴定，筛选阳性克隆。鉴定得到的阳性菌 株可用于植物转化。
[0039] 用花序浸染法（Floral Dip)将植物表达载体pB2GW7-CFLAPl转化到拟南芥 Columbia-0生态型的野生型植株中，得到转基因拟南芥植株。具体步骤如下：
[0040] 1)挑取含有PB2GW7-CFLAP1质粒的农杆菌单克隆，用10mL含有10mg/L利福平、 50mg/L庆大霉素、50mg/L壮观霉素的液体LB培养基28°C、220rpm培养24小时；
[0041] 2)按1:100的比例转接到200mL含相同抗生素的液体LB培养基中，28°C继续培养 20小时；
[0042] 3) 3000rpm，室温离心10分钟，收集农杆菌菌体，倒掉上清，用100mL侵染缓冲液 (含有5%蔗糖、0.2%511?的1^77的1/21^液体培养基）重新悬浮；
[0043] 4)取生长良好的拟南芥，在浸染前剪去其长角果和已开放的花，只留下未开放的 花苞；
[0044] 5)将植物花序部分浸入上述农杆菌悬浮液中，尽可能的让花苞浸入液面之下，浸 泡10min，取出植物于黑暗中放置24小时；
[0045] 6)将植株正常放置，置于温室中16小时光照/8小时黑暗，温度22±2°C培养，直 至结实。
[0046] 收获的转基因种子经过消毒灭菌，铺在含有相应抗生素的1/2MS培养基上，筛选 得到的抗性苗（T1代）移入土中继续生长。
[0047] 4、pB2GW7-CFLAPl转基因植物蜡质合成情况的鉴定
[0048] 选取上述T1代转基因两个独立的转基因植物株系35S:CFLAP1-1和35S:CFLAPl-3 的莲座叶，用TRIzol试剂（Invitrogen公司）提取植物总RNA，DNase I (Takara公司）处 理消化DNA后，用Invitrogen公司的逆转录试剂盒进行逆转录，得到转基因植株的cDNA。 根据CFLAP1基因的cDNA序列设计基因特异的实时定量PCR引物Real-F和Real-R，通过 实时定量PCR检测CFLAP1基因在转基因植株的表达水平，内参基因选用拟南芥TUB2基因 (引物使用Real_F2和Real_R2)。各引物序列如下：
[0049] Real-F :5'-CGGACTCCGGTGAATAATCT-3'（SEQ ID NO :6)
[0050] Real-R :5,-AAGCGTCCGAGGAGGCAATC-3,（SEQ ID NO :7)
[0051] Real-F2 :5'-GTTCTCGATGTTGTTCGTAAG-3'（SEQ ID NO :8)
[0052] Real-R2 :5'-TGTAAGGCTCAACCACAGTAT-3'（SEQ ID NO :9)
[0053] 实时定量PCR检测CFLAP1基因在转基因植物中的表达情况如图1所示，其中 35S: CFLAP1-1转基因植物中相对野生型过量表达了约490倍，35S: CFLAP1-3转基因植物中 过量表达了约50倍。
[0054] 将T2代的转基因植物种子铺在抗性板上，筛选含有转基因的后代。提取转基因植 物和同时期的野生型叶片表面蜡质，用于气相色谱-质谱联用仪（GC-MS)进行分析。结果 表明，在转基因后代的叶片表面，大量蜡质组分得到富集（附图2)，这样的转基因植物具有 良好的抗旱性筛选前景。
【主权项】
1. 一种植物蜡质发育调控蛋白，是下述蛋白质（i)或（ii): (i) 序列表中的SEQ ID No :3所不氣基酸序列的蛋白质； (ii) 序列表中的SEQ ID No :3所示氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失 和 /或添加而衍生的蛋白质，并且所衍生的蛋白质具有与（i)所述蛋白质相同的功能。2. -种植物蜡质发育调控基因，编码下述蛋白质（i)或（ii): (i) 序列表中的SEQ ID No :3所不氣基酸序列的蛋白质； (ii) 序列表中的SEQ ID No :3所示氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失 和 /或添加而衍生的蛋白质，并且所衍生的蛋白质具有与（i)所述蛋白质相同的功能。3. 如权利要求2所述的植物蜡质发育调控基因，其特征在于，所述基因是来源于拟南 芥Columbia-0生态型的CFLAP1基因的基因组DNA序列或cDNA序列。4. 如权利要求2所述的植物蜡质发育调控基因，其特征在于，所述基因的序列如序列 表中 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO :2 所示。5. 包含权利要求2~4任一所述基因的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。6. 权利要求2~4任一所述植物蜡质发育调控基因在提高植物抗旱性中的应用。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，通过转基因技术在植物中表达所述蜡质发 育调控基因。8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述植物蜡质发育调控基因或其修饰过 的基因导入植物细胞、组织或者器官，然后再将被转化的细胞、组织或者器官培育成植株， 从而获得抗旱性提高的转基因植物。9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述植物蜡质发育调控基因或其修饰过 的基因通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器官；在构建植物表达载体时，在所述基因 的转录起始核苷酸前加上一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。10. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物是拟南芥。
【文档编号】C12N15/82GK105985416SQ201510046995
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年1月29日
【发明人】李世柏, 张立, 瞿礼嘉, 顾红雅
【申请人】北京大学