一种¹⁸F标记的多肽化合物及其制备方法和应用

一种¹⁸F标记的多肽化合物及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种18F标记的多肽化合物，其结构如式1所示；其中，R1为或R2为C1～C10直链烷基、C1～C10支链烷基、C5～C7环烷基、聚乙二醇基、C6～C10芳基、C6～C10芳基-C1～C4烷基或C1～C4烷基-C6～C10芳基-C1～C4烷基。本发明还公开了一种制备所述18F标记的多肽化合物的制备方法，其包括下述步骤：在溶剂中，在Cu(I)的催化下，将化合物D与化合物B进行叠氮与端位炔基的1,3-偶极环加成反应：以及该18F标记的多肽化合物的应用。所述18F标记的多肽类化合物成像分辨率高，稳定性好，所述18F标记的多肽类化合物的制备方法反应放化产率较现有技术有显著提高。
【专利说明】
一种18F标记的多肽化合物及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及多肽化合物领域，具体的涉及一种1SF标记的多肽化合物及其制备方 法和应用。
【背景技术】
[0002] 碳酸酐酶IX (CA IX)是碳酸酐酶家族的异构体之一，它一种含锌的金属酶，参 与体内许多生理过程，如酸碱平衡、离子转运、气体交换、钙化作用等（Claudiu T. Drug Design of Zinc-Enzyme Inhibitors[M]. ffiley, 2009. Simone G.D.BBA-PROTEINS PR0TE0M, 2010:404-409.)〇
[0003] 研究发现，CA IX是一种新型的肿瘤相关抗原，可以作为肿瘤细胞特异性的生物 标志物，同时，CA IX与肿瘤的乏氧密切相关，作为一种肿瘤乏氧的标志物，在调节细胞 增殖和肿瘤形成中具有潜在作用。由于肿瘤局部血供需失衡或恶性肿瘤代谢旺盛，消耗 大量的氧，导致供氧不足，使肿瘤局部处于乏氧状态。CA IX的表达受缺氧调节，在正常 组织中，CA IX不表达或表达极低，而在肿瘤（如：结肠癌、子宫颈癌、乳腺癌、肺癌、胰腺 癌、卵巢癌等）组织中会过量表达。（Niemela AM, et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2007,16:1760-1766. W0ELBER L, KRESS K, KERSTEN J F,et al. Carbonic anhydrase IX in tumor tissue and sera of patients with primary cervical cancer[J]. Bmc Cancer, 2011，11:1-10. )CA IX作为人类肿瘤的预后因子，在宫颈癌、肺癌和乳腺癌等癌症 中，表达越高则预后越差。而在晚期肾细胞癌中，较低的CA IX表达水平预示着较差的生 存率。（ILIE M，MAZURE N M，H0FMAN V，et al· High levels of carbonic anhydrase IX in tumour tissue and plasma are biomarkers of poor prognostic in patients with non-small cell lung cancer[J]. British Journal of Cancer, 2010, 102(11):1627-35. K0RKEILA E, TALVINEN K, JAAKK0LA P M, et al. Expression of carbonic anhydrase IX suggests poor outcome in rectal cancer[J]. British Journal of Cancer, 2009, l〇〇(6) :874-80. Κ0Ν-Ν0 Η, ISHII G, NAGAI K, et al. Carbonic anhydrase IX expression is associated with tumor progression and a poor prognosis of lung adenocarcinoma[J]. Lung Cancer, 2006, 54(3):409-18.)
[0004] CA IX与肿瘤发生、发展、转移和治疗效果之间存在密切关系，是一个非常具有前 景的肿瘤显像靶点。正电子发射型电子计算机断层显像（PET)具有灵敏度高、分辨率高、特 异性强等特点（李林法，张敏鸣等.肿瘤靶向分子影像.北京：科学出版社，2006,204.)，目 前已经普遍应用于肿瘤的早期诊断和术后评价，具有极大的研究价值和市场需要。而氟-18 有相对较长的半衰期（约llOmin)，可进行多步合成；正电子能低（0. 64MeV)，显像的分辨率 高；氟-18通过加速器生产，无载体，可获得高比活度的PET药物，使得氟-18标记的放射性 药物的研究成为PET药物研究的一个热点。
[0005] 因此，研究制备对CA IX具有特异性的氟-18标记分子探针，通过PET显像无创、 方便的实现对肿瘤的早期诊断、准确分期、监测复发和转移，协助确定肿瘤治疗方案，对于 提高肿瘤治疗的效果和降低死亡率具有重要的现实意义和应用价值。
[0006] Rana课题组通过噬菌体展示技术筛选出的多肽YNTNHVPLSPKY和NHVPLSPy能够 特异性地靶向重组的人CA IX的胞外结构域，可与表达CA IX的多种肿瘤细胞结合，而不与 CA IX阴性表达的肿瘤细胞结合，具有较高的革巴向亲和性。（Askoxylakis V，Garcia_Boy R，Rana S，et al. A new peptide ligand for targeting human carbonic anhydrase IX，identified through the phage display technology[J]. PLoS One, 2010, 5:el5962. Rana S，Nissen F，Marr A，et al. Optimization of a Novel Peptide Ligand Targeting Human Carbonic Anhydrase IX[J].PLoS One，2012,7(5) :e38279)因此，对其进行标记后 将是非常潜力的分子影像探针。而目前基于该靶点的PET探针的相关研究国内外均鲜有报 道，使得这一发明具有很好的创新型和较好应用价值。
[0007]目前已有的关于氟-18标记技术针对的CA IX靶点报道的18F标记的多肽几乎 没有，已有的针对该靶点的显像探针也十分少，且已报道的标记核酸的方法效果并不理 想，其主要问题在于反应产物得率较低，并且反应时间很长（Mercier F，Paris J，Kaisin G et al Bioconjugate Chem. 2011，22, 108 - 114General Method for Labeling siRNA by Click Chemistry with Fluorine_18for the Purpose of PET Imaging ；Inkster JA，Adam MJ，Storr T et al Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2009Nov ； 28 (11):1131_43Labeling of an antisense oligonucleotide with[ (18)F]FPy5yne)， 并且现有文献报道125I标记的与本发明产品结构类似化合物在血清中孵育1. 5小时就有 50%的分解（Askoxylakis V，Garcia_Boy R，Rana S，et al.A new peptide ligand for targeting human carbonic anhydrase IX, identified through the phage display technology [J] · PLoS One，2010, 5: el5962.)，因此目前本领域尚缺少一种可以用氟-18高 效、稳定标记多肽的方法。

【发明内容】

[0008] 本发明要解决的技术问题：本发明提供了一种与现有技术完全不同的1SF标记的 多肽类化合物，其制备方法及应用。所述 1SF标记的多肽类化合物成像分辨率高，稳定性好， 所述1SF标记的多肽类化合物的制备方法反应放化产率较现有技术有显著提高。
[0009] 本发明技术方案之一：一种如式1所示的1SF标记的多肽化合物：
[0010]
[0011] 其中，札为
所述NHVPLSPKy为序列 为 Asn-His-Val-Pro-Leu-Ser-Pro-Lys-Tyr 的多肽，y 为 D-酪氨酸，所述 YNTNHVPLSPKY 为 序列为 Tyr-Asn-Thr-Asn-His-Val-Pro-Leu-Ser-Pro-Lys-Tyr 的多肽，R2为 C2~C 丨。直链 烷基、Ci~C i。支链烷基、C 5~C 7环烷基、聚乙二醇基、C 6~C i。芳基、C 6~c i。芳基-c C 4 烷基或Ci~C 4烷基-c 6~c i。芳基-c C 4烷基；所述c 6~c i。芳基-c C 4烷基的C 6~ Q。芳基部分与所述1SF标记的多肽化合物的N相连，所述C6~C i。芳基-c C4烷基的C (：4烷基部分与所述1SF标记的多肽化合物的1SF相连。
[0012] 所述C2~C i。直链烷基较佳地为如式2所示基团，其中η为1~9,较佳地为1~ 3,例如η = 1 ;
[0013]
[0014] 所述C i。支链烷基较佳地为如式3所示基团，其中η为0~8,较佳地为1~ 3,例如η = 2 ;
[0015]
[0016] 所述C5~C 7环烷基较佳地为如式4所示基团，其中η为1~3 ;
[0017]
[0018] 所述聚乙二醇基较佳地为如式5所示基团，其中η为2~7,较佳地为2~3 ;
[0019]
[0020] 所述C6~C !。芳基-C广C 4烷基较佳地为如式6所示基团，其中η为1~2,较佳 地为1 ;
[0021]
[0022] 所述C 4烷基-C 6~C i。芳基-C广C 4烷基较佳地为如式7和式8所示基团的 任一种，其中化为1~5,较佳地为1~2 ;112为0~4，较佳地为2~3。
[0023]
[0024] 本发明技术方案之二：一种制备如本发明技术方案之一所述1SF标记的多肽化合 物的方法，其包括下述步骤：在溶剂中，在Cu(I)的催化下，将化合物D与化合物B进行叠氮 与端位炔基的1，3-偶极环加成反应：
[0025]
[0026] 其中，所述化合物D中的&和所述化合物B中的R 2如本发明技术方案之一所示。
[0027] 本发明中，所述制备方法较佳地还可以包括以下步骤：进一步分离纯化化合物A， 将所述分离纯化后的化合物A减压浓缩、溶于生理盐水、经无菌滤膜过滤。所述分离纯化为 本领域常规，较佳地为通过放射性HPLC分离纯化，更佳地为先通过S印-Pak C18柱纯化后 再通过放射性HPLC分离纯化。
[0028] 本发明中，所述制备方法中的所述溶剂为本领域常规，较佳地为选自水、叔丁醇、 乙腈、四氢呋喃、DMF(N，N-二甲基甲酰胺）和DMS0(二甲基亚砜）中的一种或多种。所述 溶剂的pH值为本领域常规，较佳地为3~11，更佳地为5~8。
[0029] 本发明中，所述化合物D在反应体系中的浓度为本领域常规，较佳地为0. 1~ 50mmol/L，更佳地为 1 ~7mmol/L。
[0030] 本发明中，所述化合物B在反应体系中的浓度为本领域常规，较佳地为0. 02mCi/ mL ~2000mCi/mL，更佳地为 lmCi/mL ~500mCi/mL，最佳地为 100mCi/mL ~300mCi/mL。
[0031] 本发明中，所述Cu(I)为本领域常规，较佳地为通过包括下述步骤的方法所制得： 将二价铜的强酸盐和抗坏血酸或其强碱盐进行还原反应，制得Cu (I)。所述的二价铜的强 酸盐为本领域常规，例如为硫酸铜。所述抗坏血酸的强碱盐为本领域常规，例如为抗坏血酸 钠。所述Cu(I)在反应体系中的浓度为本领域常规，较佳地为lmol/L~5mol/L。所述的 二价铜的强酸盐和抗坏血酸或其强碱盐的摩尔比较佳地为1:1. 2~1:8,更佳地为1:2~ 1:4〇
[0032] 本发明中，所述1，3-偶极环加成反应的时间为本领域常规，较佳地为1~80min， 更佳地为10~20min，最佳地为15min。所述1，3-偶极环加成反应的温度为本领域常规， 可根据参与反应的化合物D的稳定性以及采用的反应溶剂体系的沸点适当调节温度，较佳 地为2~110°C，更佳地为35~70°C。
[0033] 本发明中，所述化合物B较佳地可通过包括下述步骤的制备方法来制备：在有机 溶剂中将含有K 222、1(20)3和1SF的混合物与化合物C进行亲核取代反应，得到化合物B。所 述化合物C的通式如下面方程式所示：
[0034]
[0035] 其中，所述化合物C的R3基团为亲核取代反应中的常规离去基团，较佳地为选 自-OTs、-OMs、-N0 2、I、Br、-OTf 和-N+Me3中的任一种，更佳地为选自-OTs、-0ms 和-N +Me3 中的任一种，最佳地为-OTs或-N+Me3。所述化合物C的R2基团如本发明技术方案之一 中所示。所述化合物为C市售可得，或可通过已报道的技术合成得到（郭飞虎；施玲丽； 王妮；武明星；张勇平；杜进.P_[18F]FSTC的合成和初步动物学评价，核化学与放射化 学，2010,32(4):236-242 ;Gill HS, Marik J.Preparation of(18)F_labeled peptides using the copper (I)-catalyzed azide-alkyne 1,3-dipolar cycloaddition. Nature Protocols2011 ;6 (11):1718-1725.)。
[0036] 本发明中，所述制备化合物B的制备方法中的所述有机溶剂为本领域常规，较佳 地为选自无水乙腈、无水二甲基甲酰胺和无水二甲亚砜中的一种或多种。所述有机溶剂的 含量为本领域常规，较佳地为无水乙腈、无水二甲基甲酰胺、无水二甲亚砜、无水乙腈与无 水二甲基甲酰胺的混合溶剂，更佳地为无水乙腈、无水二甲基甲酰胺或无水二甲亚砜，最佳 地为无水乙腈。
[0037] 本发明中，所述1SF在反应体系中的活度为本领域常规，较佳地为0. 01mCi/mL~ 1000mCi/mL，更佳地为 5mCi//mL ~500mCi/mL，最佳地为 20mCi//mL ~200mCi/mL。所 述K222在反应体系中的浓度为本领域常规，较佳地为15~200 μ mol/mL，更佳地为35~ 100 ymol/mL。所述K2C03在反应体系中的浓度为本领域常规，较佳地为0. 01~100mmol/mL， 更佳地为0. 05~50mmol/mL。所述化合物C在反应体系中的浓度较佳地为0. 005~lmol/ L，更佳地为 0· 05 ~(λ 25mol/L。
[0038] 本发明中，所述含有K222、K2C0jP 1SF的混合物较佳地可通过包括下述步骤的制备 方法制得：1)用QMA柱捕获所述1SF ; ;2)用包含1(222和K 2C03的溶液淋洗富集的1SF的QMA 柱。
[0039] 本发明中，所述亲核取代反应的温度为本领域常规，较佳地为80~150°C，更佳地 为80~120°C。所述亲核取代反应的时间为本领域常规，较佳地为2~15min，更佳地为 5 ~10min〇
[0040] 本发明中，所述化合物B较佳地还可以提纯，所述提纯为本领域常规，较佳地为通 过包括下述步骤的提纯方法提纯：当化合物B的沸点低于200°C时，向反应液中加入乙腈， 以氮气作为载气，蒸馏分离杂质，收集含有化合物B的乙腈冷凝溶液。所述蒸馏的温度为本 领域常规，较佳地为85~150°C。所述蒸馏的时间为本领域常规，较佳地为5~30min。
[0041] 本发明技术方案之三：一种如式9所示的端位带有炔基的化合物：
[0042]
[0043] 其中，&如本发明技术方案之一所示。
[0044] 本发明技术方案之四：一种多肽化合物，其结构如式10所示：
[0045]
[0046] 其中，&和R 2如本发明技术方案之一所示。
[0047] 本发明中，所述F标记的多肽化合物可通过与本发明技术方案之二中所述制备方 法相同的方法制得：
[0048]
[0049] 本发明中，所述化合物B'为本领域常规，较佳地可通过包括下述步骤的制备方法 制得：向含有1_〇1化合物E的5mL无水DMF溶液中加入叠氮化钠至终浓度3_〇1，反应混 合物在常温下搅拌48小时，过滤除去固体后得到化合物B'的DMF溶液：
[0050]
[0051] 其中，R3为亲核取代反应中常用的离去基团，如为选自-OTs、-OMs、-N0 2、I、 Br、-OTf和-N+Me3中的任一种，R 2如本发明技术方案之一所示。
[0052] 本发明技术方案之五：一种如技术方案之一所述的1SF标记的多肽化合物在制备 医学显像剂中的应用。
[0053] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0054] 本发明的积极进步效果在于：
[0055] 1、本发明的PET显像剂制备方法简单，放射性化学产率高，反应时间短，易于工业 化大批量生产，更加适合放射药物临床应用。制备得到的 1SF标记化合物放射化学纯度大于 99%〇
[0056] 2、本发明所得到的PET显像剂结构稳定，体内未见脱[1SF]氟现象，且显像分辨率 尚。
[0057] 3、本发明中用到的多肽合成简单，廉价易得，可以实现工业化生产。
[0058] 4、本发明中所用到的硫酸铜、抗坏血酸钠等均为商品化试剂，原料廉价易得。
【附图说明】
[0059] 图1.实施例2标记产物A1在PBS中37°C孵育180min时的Radio-HPLC检测谱 图。
[0060] 图2.实施例2的标记产物A1在小牛血清中37°C孵育时的稳定性变化图。
[0061] 图3.实施例3的标记产物A2在小牛血清中37°C孵育180min时的Radio-HPLC检 测谱图。
[0062] 图4.实施例3的标记产物A2在PBS中37°C孵育180min时的Radio-HPLC检测谱 图。
[0063] 图5.实施例2的1SF放射性标记多肽化合物A1对荷结肠癌HT29肿瘤鼠的PET-CT 扫描lh时的影像图（横断面）。
[0064] 图6.实施例2的1SF放射性标记多肽化合物A1对荷结肠癌HT29肿瘤鼠的PET-CT 扫描lh时的影像图（冠状面）。
[0065] 图7.实施例2的1SF放射性标记多肽化合物A1在荷结肠癌HT29肿瘤鼠的SUV-t 曲线。
[0066] 图8.实施例5的合成产物炔基-NHVPLSPy的质谱检测结果图。
[0067] 图9.实施例5的合成产物炔基-NHVPLSPy的高效液相色谱检测结果图。
[0068] 图10.实施例5的合成产物炔基-YNTNHVPLSPKY的质谱检测结果图。
[0069] 图11.实施例5的合成产物炔基-YNTNHVPLSPKY的高效液相色谱检测结果图。
【具体实施方式】
[0070] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0071] 实施例1
[0072] 20mCi 1SF被季铵型阴离子柱QMA(美国Waters公司产品，1SF由上海科兴药业有 限公司提供）捕获后，取 1. OmL K2. 2. 2 (即 Kryptofix 222)溶液（14. 4mg K2. 2. 2, 3. Omg K2C03,960 μ L乙腈，40 μ L水配成的溶液）将1SF冲洗到反应瓶中，反应瓶浸入95°C的油浴， 氮气吹干，然后再加入500 μ L无水乙腈吹干，重复上述操作两次。
[0073] 实施例2
[0074] (l)30mCilsF被季铵型阴离子柱QMA(美国Waters公司产品， 1SF由科兴药业有 限公司提供）捕获后，取 1.2mL K222 (即 Kryptofix 222)溶液（17.5mg K222 , 3 . 5mg K2C03， 1152 μ L乙腈，48 μ L水配成的溶液）将1SF冲洗到反应瓶中，反应瓶浸入95°C的油浴，氮气 吹干，然后再加入500 μ L无水乙腈吹干，重复无水乙腈吹干两次；
[0075] (2)将含有5mg 2-叠氮乙基对甲苯磺酸酯的500 μ L无水乙腈溶液在氮气保护下 迅速加入含有Κ222、1(20)3和 1SF的混合物中，95°C下密闭反应10min后停止反应，冰水浴冷 却，得到化合物B1，标记率可达97 %以上；
[0076]
[0077] (3)向含有化合物B1的反应液中补加乙腈200 yL，氮气辅助载流，进行蒸馏，并收 集冷凝液，蒸馏10_20min，得含有提纯的化合物B1的乙腈冷凝收集液约700 yL，蒸馏效率 可达到75% ;
[0078] (4)向1. 5mL指形管中先后加入50 μ L浓度为0· 45mol/L硫酸铜溶液和50 μ L浓 度为1. 5mol/L抗坏血酸钠溶液，混匀后加入350 μ L含有2. Omg化合物D1的PBS溶液（pH =6. 0)，涡旋混合lmin后，加入350 μ L含有活度为1. 5mCi的提纯后的化合物B1的乙腈溶 液，振荡器50°C反应15min ;
[0079] (5)标记产物用HPLC检测并分离（美国Agilent 1100 HPLC系统，半制备柱为 Agilent C18 column(9.3mmX250mm))，流动相为添加了 0.1%三氟乙酸的水（A)和乙腈 (B)，梯度分离条件为：0-20-24-25min，20 % - 25 % - 75 % - 20 % B，流速为 2. OmL/min， 分离后得到化合物Al，UV(220nm)检测和放射性检测；再将所述分离纯化的产物A1减压 (Mpa)浓缩至溶剂完全蒸干、溶于2500 μ L生理盐水，使探针浓度大约为4. 5mCi/mL、经无 菌滤膜过滤，得到1SF标记多肽化合物A1。A1的标记率>96 %，放射化学纯度大于99 %，经 HPLC分离后的放射化学产率~45% (未衰变校正，从1SF计）。
[0080]
[0081] 实施例3
[0082] (1)将含有5mg2_叠氮乙基对甲苯磺酸酯的500 μ L无水乙腈溶液在氮气保护下迅 速加入含有K222、K2C0#P 1SF的混合物中，95°C下密闭反应lOmin后停止反应，冰水浴冷却， 得到化合物B1，标记率可达97 %以上；
[0083]
[0084] (2)向含有化合物B1的反应液中补加乙腈200 yL，氮气辅助载流，进行蒸馏，并收 集冷凝液，蒸馏10_20min，得含有提纯的化合物B1的乙腈冷凝收集液约700 yL，蒸馏效率 可达到75% ;
[0085] (3)向1. 5mL指形管中先后加入40 μ L浓度为0· 45mol/L硫酸铜溶液和40 μ L浓 度为1. 5mol/L抗坏血酸钠溶液，混匀后加入350 μ L含有2. Omg化合物D2的PBS溶液（pH =6. 0)，涡旋混合lmin后，加入300 μ L含有活度为1. 3mCi的提纯后的化合物B1的乙腈溶 液，振荡器50°C反应15min得到产物A2。A2的标记率>95%，放射化学纯度大于99%，经 HPLC分离后的放射化学产率~40% (未衰变校正，从1SF-计）。
[0086]
[0087] 实施例4
[0088] (1)将含有5mg 2-叠氮乙基对甲苯磺酸酯的400 μ L无水二甲基甲酰胺溶液在氮 气保护下迅速加入含有Κ222、1(20)3和 1SF的混合物中，100°C下密闭反应5min后停止反应， 冰水浴冷却，得到化合物B1，标记率可达98 %以上；
[0089]
[0090] (2)向含有化合物B1的反应液中补加乙腈500 yL，氮气辅助载流，进行蒸馏，并收 集冷凝液，蒸馏10_20min，得含有提纯的化合物B1的乙腈冷凝收集液约500 yL，蒸馏效率 可达到80% ;
[0091] (3)向1. 5mL指形管中先后加入50 μ L浓度为0· 45mol/L硫酸铜溶液和50 μ L浓 度为1. 5mol/L抗坏血酸钠溶液，混匀后加入300 μ L含有2. Omg化合物D1的PBS溶液（pH =7. 0)，涡旋混合lmin后，加入300 μ L含有活度为20mCi的提纯后的化合物B1的乙腈溶 液，振荡器30°C反应20min ;
[0092] (4)标记产物用HPLC检测并分离（美国Agilent 1100 HPLC系统，半制备柱为 Agilent C18 column(9.3mmX250mm))，流动相为添加了 0.1%三氟乙酸的水（A)和乙腈 (B)，梯度分离条件为：0-20-24-25min，20 % - 25 % - 75 % - 20 % B，流速为 2. OmL/min， 分离后得到化合物Al，UV(220nm)检测和放射性检测；再将所述分离纯化的产物A1减压 (Mpa)浓缩至无溶剂、溶于生理盐水，经无菌滤膜过滤，得到 1SF标记多肽化合物。
[0093] 实施例5
[0094] (1)将含有5mg C2的500 μ L乙腈溶液在氮气保护下迅速加入含有K222、1(20)3和 1SF的混合物中，110°C下密闭反应lOmin后停止反应，冰水浴冷却，得到化合物Β2,标记率 可达97%以上；
[0095]
[0096] (2)向含有化合物B2的反应液中补加乙腈100 μ L，氮气辅助载流，进行蒸馏，并收 集冷凝液，蒸馏10_20min，得含有提纯的化合物Β2的乙腈冷凝收集液约600 μ L，蒸馏效率 可达到80% ;
[0097] (3)向1. 5mL指形管中先后加入50 μ L浓度为0· 45mol/L硫酸铜溶液和50 μ L浓 度为1. 5mol/L抗坏血酸钠溶液，混匀后加入350 μ L含有2. Omg化合物D1的PBS溶液（pH =6. 0)，涡旋混合lmin后，加入350 μ L含有活度为50mCi的提纯后的化合物B2的乙腈溶 液，振荡器50°C反应20min ;
[0098] (4)标记产物用HPLC检测并分离（美国Agilent 1100HPLC系统，半制备柱为 八区;[161^(]18(3〇1111]111(9.3111111\25〇111111))，流动相为添加了0.1%三氟乙酸的水（4)和乙腈 (B)，分离后得到化合物A2, UV (220nm)检测和放射性检测；再将所述分离纯化的产物A1减 压浓缩至无溶剂、溶于生理盐水，经无菌滤膜过滤，得到1SF标记多肽化合物。
[0099]
[0100] 实施例6
[0101] 炔基-NHVPLSPy与炔基-YNTNHVPLSPKY化合物的合成
[0102] (1)树脂溶涨：将2-氯三苯甲基氯树脂放入反应管中，加 DMF(15ml/g)，振荡 30min ；
[0103] (2)接第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量Fmoc-L-炔丙基甘 氨酸-OH，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入DMF溶解，振荡30min，甲醇封闭30min ;
[0104] (3)脱保护：去掉01^，加20%哌啶01^溶液（15!111/8)，51^11，去掉再加20%哌啶 DMF 溶液（15ml/g)，15min ;
[0105] (4)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶 液各一滴，l〇5°C - 110°C加热5min，变深蓝色为阳性反应；
[0106] (5)洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇（10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次；
[0107] (6)缩合：保护氨基酸三倍过量，HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应 管，立刻加入DIEA十倍过量，反应30min ;
[0108] (7)洗涤：DMF(10ml/g) -次，甲醇（10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次；
[0109] (8)重复二至六步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸，直至最后一个氨基 酸，并脱除其氨基保护Fmoc;
[0110] (9)抽干，按照下列方法洗树脂：DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)三次，甲醇 (10ml/g)四次，抽干 lOmin;
[0111] (10)脱去侧链保护基：配制切割液（l〇/g)TFA 94. 5% ;水 2. 5% ;EDT 2. 5% ;TIS 1% ;切割时间：120min ;
[0112] (11)吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干；
[0113] (12)纯化制备，将纯化后的溶液冻干，既得到成品；
[0114] (13)鉴定；分别取少量的成品多肽，做MS的分子量鉴定和HPLC分析的纯度鉴定；
[0115] (14)将白色粉末状的多肽，密封包装，-20度保存。
[0116] NHVPLSPy- (L-炔丙基甘氨酸）HPLC鉴定：序列：NHVPLSPy- (L-炔丙基甘氨酸） (C端连接L-炔丙基甘氨酸）小写的y为D-酪氨酸测量对象为峰形覆盖区域，运行时间 13min。计算类型为百分比，检测的波长为220纳米，流速lml/min，上样体积10 μ 1。缓冲 液Α为溶于水的0. 1 %三氟乙酸，缓冲液Β为溶于乙腈的0. 1 %三氟乙酸，线性梯度为13min 内20% -55 %缓冲液B。
[0117] 表1 :NHVPLSPy_ (L-炔丙基甘氨酸）HPLC鉴定结果
[0118]
[0119] NHVPLSPy-(L-炔丙基甘氨酸）MS鉴定：预计分子量：1021. 06。流速0. 2ml/min，运 行时间lmin，缓冲液A为0. 1 %甲酸溶于水，缓冲液B为0. 1 %甲酸溶于乙腈。
[0120] YNTNHVPLSPKY-丙炔酸HPLC鉴定：探测器检测波长：215nm
[0121] 表 2 :YNTNHVPLSPKY-丙炔酸 HPLC 鉴定结果
[0122]
[0123] YNTNHVPLSPKY-丙炔酸的MS鉴定：质量范围：200. 00-2000. 00,对照程序： 300-2000 (+，-)，注射体积：3· 0,通道：TICF_01，运行时间：1. 5min
[0124] 实施例6
[0125] 向1. 5mL指形管中先后加入40 μ L浓度为0. 45mol/L硫酸铜溶液和40 μ L浓度为 1. 5mol/L抗坏血酸钠溶液，混匀后加入350 μ L含有2. Omg化合物D的PBS溶液（pH = 6. 0)， 涡旋混合lmin后，加入300 μ L含有活度为1. 3mCi的化合物B的乙腈溶液，振荡器50°C反 应15min，得到产物化合物A。
[0126] 实施例7
[0127] 参比化合物ΑΓ的合成
[0128] (1)向化合物对甲苯磺酸氟乙酯FI (4. 26g，19. 54mmol)的30mL无水DMF溶液中， 加入叠氮化钠（3. 81g，58. 63mmol)，反应混合物在室温下搅拌反应48小时，过滤除去固体 后得到 ΒΓ 的 DMF 溶液。iH-NMRGOOMHz, CDC13) : δ 4. 6 (dt, 2H, CH2-F, 2Jfh= 47Hz, 2Jhh = 4. 5Hz) ;3. 5 (dt, 2H, CH2-CH2-F, 3Jfh= 27Hz, 2Jhh= 4. 5Hz)
[0129]
[0130] (2)向指形管中依次加入无水硫酸铜（0· 45mol/L，30 ymol，3eq)溶液和抗坏血酸 钠（1.5mol/L，90ymol，9eq)的溶液，混匀后加入多肽 Dl(10ymol，leq)的 350 yL PBS 溶 液和化合物ΒΓ (30ym〇l，3eq)的100yL DMF溶液，反应混合物50°C振荡反应30min。将 反应体系倒入15mL水中，然后用S印-pak C18柱纯化，产物用乙腈淋洗下后，用LC-MS检测。 (tR= 7. 01min,555. 80[M/2+H] +)
[0131]
[0132] 实施例8
[0133] 参比化合物A2'的合成
[0134] 向指形管中依次加入无水硫酸铜（0. 45mol/L，30 ymol，3eq)溶液和抗坏血酸钠 (1.5mol/L，90ymol，9eq)的溶液，混匀后加入多肽 D2(10ymol，leq)的 350 yL PBS 溶液 和化合物ΒΓ (30ymol，3eq)的lOOyLDMF溶液，反应混合物50°C振荡反应30min。将反 应体系倒入15mL水中，然后用Sep-pak C18柱纯化，产物用乙腈淋洗下后，用LC-MS检测。 (tR= 12.4min，787.60[M/2+l] +)
[0135]
[0136] 实施例9
[0137] 搅拌下，向KF(lmmol)、18冠6 (5mmol)的乙腈悬浮液中加入1-叠氮-4-氟甲基苯 (F2) (lmmol)的乙腈溶液，50°C加热搅拌反应48小时。反应混合物加入乙酸乙酯和水萃取 产物，有机层硅胶柱层析纯化（展开剂：石油醚，乙酸乙酯）。获得产物113mg，收率75%。 NMR (400MHz, CDC13) d: 5. 34 (2H, d, J = 47. 5Hz)，7. 05 (2H, d, J = 8. 4Hz)，7. 38 (2H, dd, J = 8. 4, 2. 0Hz). T0F-ESI-MS:M(C7H6FN3) = 151.05(m/z), (M+H)+151.04
[0138]
[0139] 效果实施例1
[0140] 实施例1的标记产物A1在PBS中的稳定性测试：取1SF标记制剂50yL(约 60 μ Ci)，置于lmL PBS中，置于37°C下，振荡孵育30、60、90、120、180min后，用HPLC测定其 放射化学纯度，以观察其体外稳定性。HPLC分析结果显示此实施例的标记化合物未见有放 射性杂质产生，表明其在PBS中有良好的稳定性。
[0141] 效果实施例2
[0142] 实施例1的标记产物A1在血清中的稳定性：取1SF标记制剂50 μ L (约80 μ Ci)， 置于1000 yL小牛血清中，置于37°C下，振荡孵育30、60、90、120、18011^11后，取样10(^1^ 置于已含200 μ L甲醇的指形管中，混匀后离心两分钟，取上清液用HPLC测定其放射化学纯 度，以观察其在血清中的稳定性。HPLC分析结果显示此实施例的标记化合物未见有放射性 杂质产生，表明其在小牛血清中有良好的稳定性。
[0143] 效果实施例3
[0144] 实施例1的标记产物A1的亲脂性（Log P)的测定：标记化合物的亲脂性在正辛醇 与水溶性缓冲溶液（PBS)组成的体系中测定。该项指标是衡量药物在生物体内的吸收、分 布、代谢和消除的一个重要因素 。Log P为化合物的脂水分配系数，能反映出一个化合物亲 脂性的强弱。其测量计算公式为：
[0146] 取10 μ L1SF标记制剂于2mL指形管中（含有600 μ L正辛醇和590 μ L PBS)，密封 好，在室温下充分涡旋2min后，高速离心3min，至两相平衡。用移液器从有机相和水相各取 样100yL分置于两只γ计数管中，用γ计数器测定计数。根据两次平行实验，每次测得 的三组平行数据，计算出Log Ρ = -1. 75。亲脂性数据显示，标记化合物有较好的亲水性。
[0147] 效果实施例4
[0148] 实施例1的标记产物A1在荷结肠癌HT29肿瘤鼠的PET/CT显像中的应用：小 鼠麻醉后进行CT扫描定位后，把 1SF标记多肽A1的制剂100 μ L(约60 μ Ci)通过尾 静脉注射到小鼠体内，进行动态PET扫描。整个扫描过程中，保证2L/min的氧气流，混 有1.5%的异氟烧。Inveon Acquisition Workplace(IAW)控制整个扫描过程。利用 0SEM3D(Three-Dimensional Ordered Subsets Expectation Maximum)算法重建图像。
[0149] PET-CT显像表明：PET探针A1在肿瘤鼠体内主要通过肾脏、肝脏和肠道代谢，体内 清除速度较快。HT29肿瘤对PET探针A1有特异性的摄取，肿瘤吸收清晰可见。肿瘤与肌肉 的摄取比在lh为6. 5,肿瘤与脑的摄取比在lh为17. 1，均高于文献报道的1251标记的与本 发明产品结构类似化合物。A1在老鼠体内稳定性良好，未发现有脱[ 1SF]氟现象。因此，A1 是一个潜在的靶向CA IX的PET探针，可用于CA IX高表达肿瘤的早期诊断。
[0150] 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明的相关 条件作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种I中标记的多肤化合物，其特征在于，其结构如式I所示： 其中，Ri3R2为C2~Cl。直链烷基、Cl~ Cic支链烷基、C 5~C 7环烷基、聚乙二醇基、C e~C 1。芳基、C e~C 1。芳基-C 1~C 4烷基或C 1~ C4烷基-C 6~C 1。芳基-C广C 4烷基；所述C 6~C 1。芳基-C广C 4烷基的C 6~C 1。芳基部分 与所述1中标记的多肤化合物的N相连，所述Ce~C 1。芳基-C 1~C 4烷基的C 1~C 4烷基部 分与所述1中标记的多肤化合物的1中相连。2. 如权利要求1所述的1中标记的多肤化合物，其特征在于，所述Cz~C 1。直链烷基如 式2所示： 其中n为1~9,较佳地为1。 ~C 1。支链烷基如式3所示： 其中n为O~8,较佳地为1。 ~C 7环烷基如式4所示： 其中n为1~3;和/或，所述 斤示： 其中n为2~7,较佳地为2~3 ;和/或，所述Ce~C 1。芳基-C 1~C 4烷基如式6所 示：其中n为I~2,；和/或，所述Cl~C 4烷基-C 6~C 1。芳基-C广C 4烷基如式7和式 8所示基团的任一种：其中叫为1~5,较佳地为1~2 ;n 2为O~4,较佳地为2~3。3. -种如权利要求1所述1中标记的多肤化合物的制备方法，其特征在于，包括下述步 骤：在溶剂中，在Cu (I)的催化下，将化合物D与化合物B进行叠氮与端位烘基的1，3-偶极 环加成反应?4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为选自水、叔下醇、乙腊、四氨 巧喃、N，N-二甲基甲酯胺和二甲基亚讽中的一种或多种；和/或，所述溶剂的抑值为3~ 11 ;和/或，其中所述化合物D在反应体系中的浓度为0. 1~50mmol/L ;和/或，所述化合 物B在反应体系中的浓度为0. 02mCi/mL~2000mCi/mL ;和/或，所述化(I)在反应体系中 的浓度为Imol/L~5mol/L ;和/或，所述1，3-偶极环加成反应的时间为1~80分钟；和 /或，所述1，3-偶极环加成反应的溫度为2~Iior。5. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述化(I)通过包括下述步骤的方法所 制得：将二价铜的强酸盐和抗坏血酸或其强碱盐进行还原反应，制得化(I);和/或，所述二 价铜的强酸盐为硫酸铜；和/或，所述抗坏血酸的强碱盐为抗坏血酸钢；和/或，所述的二 价铜的强酸盐和抗坏血酸或抗坏血酸强碱盐的摩尔比为1:1. 2~1:8。6. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，其还包括下述步骤：在有机溶剂中将含 有K222、K2CO3和1中的混合物与化合物C进行亲核取代反应，得到所述化合物B :其中Rs为选自-OTs、-OMs、-NO 2、I、化、-OTf和-Nlfes中的任一种；R 2如权利要求1 或2所述。7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述含有K 222、K2CO3和叩的混合物通 过包括下述步骤的制备方法制得：1)用QM柱捕获所述叩^ ;2)用包含所述K 222和K 2CO3 的溶液淋洗所述富集的1中的QMA柱；和/或，所述亲核取代反应的溫度为80~150°C ;和 /或，所述亲核取代反应的时间为2~15分钟；和/或，所述化合物B还通过包括下述步骤 的提纯方法提纯：当所述化合物B的沸点低于20(TC时，向反应液中加入乙腊，W氮气作为 载气，蒸馈分离杂质，收集含有所述化合物B的乙腊冷凝溶液；和/或，所述蒸馈的溫度为 85~150°C ;和/或，所述蒸馈的时间为5~30分钟。8. -种端位带有烘基的多肤化合物，其特征在于，其结构如式9所示：其中，Ri如权利要求1所示。9. 一种多肤化合物，其特征在于J 所示： 其中，Ri如权利要求1所示；R如权利要求1或2所述。10. -种如权利要求1或2所述的1中标记的多肤化合物在制备医学显像剂中的应用。
【文档编号】A61K101/02GK105985406SQ201510053912
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月2日
【发明人】张岚, 贾丽娜
【申请人】中国科学院上海应用物理研究所