一种提高植物耐非生物胁迫能力的方法
【专利说明】-种提高植物耐非生物胁迫能力的方法
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技术领域
[0002] 本发明设及生物技术领域，具体设及一种利用耐逆基因提高转基因植物耐非生物 胁迫的方法。
【背景技术】
[000引在中国的盐碱地面积约9913万公顷，占世界总盐碱地面积的10% ;运些±壤中往 往含有较多的可溶性盐，造成生长在运种±壤上的植物细胞壁两侧体液渗透压不同，使得 细胞内部发生程度的脱水，从而影响植物生长甚至造成死亡。在中度W上盐碱化的±壤中， 只有少数具有较强耐盐碱能力的高等植物能够存活，但在同样的环境中，有大量具有较强 耐盐碱能力的微生物可W正常生长。
[0004] 嗜盐菌是生活在盐度较高环境中的一类细菌，它们可W生长在高盐(一般10%~ 30%)条件下，主要发现于盐湖、盐场等浓缩咸水中，W及騰鱼、咸菜等盐制品上。中度嗜盐菌 (Moderatelyhalophilicbacteria)是一类在3%~15%化Cl浓度之间有最佳生长状态的 细菌，它们对环境中的盐浓度适应范围较宽，对营养的要求很低，适应环境能力较强。
[0005] 嗜盐菌的盐适应机理包括：1、由于嗜盐菌的质膜和液泡膜上的累有K7化+逆 向转运功能，拥有从环境中吸收浓缩r和向胞外或液泡内排放化+的能力，嗜盐菌采用在细 胞内高度积累r来抵抗细胞外的高渗环境，造成嗜盐菌本身虽然生长在盐浓度比较高的环 境中，但是细胞内的化+浓度并不高。2、嗜盐菌大量产生内溶质或保留从外部取得的溶质， 如氨基酸等具有渗透保护作用的小分子物质，使它们能够在高盐浓度环境中保持细胞内的 渗透压，从而正常生活。3、嗜盐菌的酶类对高盐浓度具有适应能力，在高盐浓度下仍保持正 常、甚至比低盐浓度时更高的活性，而不象其它生物的酶那样会在高盐浓度下失活。
[0006] 植物耐盐设及多种机制和代谢途径：1.质膜和液泡膜上的多种离子转运体和离 子通道蛋白，如液泡膜化7H+逆向转运蛋白、氨离子Ξ憐酸腺巧酶酶和氨离子焦憐酸化酶 等，在离子转运和重建离子平衡发挥着重要的作用，保持细胞膨压和维持正常的生化反应， 从而使植物在高盐环境中能够重建体内离子平衡。2.氨基酸及其衍生物、糖醇类及其衍 生物等有机渗透调节物质，通过维持细胞的渗透压、稳定蛋白质的高级结构W保护植物免 受高盐胁迫伤害。运类物质中研究较多的是脯氨酸和甜菜碱，它们在细胞中起着无毒渗透 保护剂的作用，其大量积累可保持许多代谢过程中的重要酶类的活性；植物中甜菜碱合成 途径的两个关键酶是胆碱单加氧酶（cholinemonooxygenase,CM0)和甜菜碱醒脱氨酶 化etainealdehydedehy化ogenase,BADH)，向植物转入外源胆碱脱氨酶基因可W催化乙 酷胆碱合成甜菜碱。3.具有一定耐盐能力的植物细胞中的超氧化物歧化酶、过氧化氨酶、抗 坏血酸一谷脫甘肤循环中的酶类，在盐胁迫下会过量表达，清除细胞内会产生氧自由基、过 氧化氨化2〇2)和径基自由基（0H)等活性氧（R0巧，减轻盐胁迫的影响。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种培育耐非生物胁迫能力提高的转基因植物的方法。
[0008] 本发明提供的技术方案如下： 在培养基中培养海杆菌必arino如cter5A，提取基因组DNA，用耐逆基因特异引物进行PCR扩增，扩增产物构建入植物表达载体，此载体转化入根癌农杆菌，用根癌农杆菌侵染拟 南芥，经过抗除草剂筛选、自交、分子鉴定等步骤，得到纯合转基因拟南芥。用不同浓度化C1 溶液处理转基因植株和对照非转基因植株，发现转基因植株的耐盐、耐旱能力与对照非转 基因植株相比显著提高，具体表现在存活率、叶片大小、叶绿素含量和植株重量等方面。
[0009] 上述方法中，所述耐逆基因为海杆菌甜菜碱醒脱氨酶基因（Aefc4)，其核酸序列为 序列表中的序列1，氨基酸序列为序列表中的序列2; 所述耐盐基因特异正反向引物序列分别为序列表中序列3和序列4 ; 上述方法中，所述耐逆基因W基因表达盒的形式导入目的植物；所述耐逆基因表 达盒具体包括花挪菜花叶病毒35S启动子（pCaMV35S)、耐逆基因和nos终止子 (化OS)，其序列为序列表中序列5,其中l-828bp为花挪菜花叶病毒35S启动子序列，其中 848-2542bp为耐逆基因序列，其中2561-2815bp为nos终止子序列； 上述表达盒中的耐逆基因的序列为基因编码区序列。
[0010] 上述方法中，所述耐逆基因表达盒通过重组表达载体pTFlOl. 1-betA导入目的植 物中，其序列为序列表中序列6; 上述方法中，所述目的植物是双子叶植物或单子叶植物。在本发明的实施例中采用的 双子叶植物为拟南芥，具体生态型为Columbia。
[0011] 本发明提供的方法，包括如下步骤： 1) 耐逆基因的获得： 曰、在高盐LB培养基中培养嗜盐细菌（ifarinoAac妃r邱.）；b、用细菌基因组DNA提取液提取细菌基因组DNA; C、用耐逆基因特异引物，从细菌基因组中PCR扩增逆盐基因；t耐逆基因利用酶切/连接方法，重组入植物表达载体，将此重组植物表达载体用热 激法转入大肠杆菌感受态中，用LB液体培养基摇菌，菌液离屯、后的得到的菌体用碱裂解法 小量提取质粒，经过酶切、测序验证； 2) 植物转基因： a、 植物重组表达载体用热激法转化入根癌农杆菌； b、 根癌农杆菌浸花法转化拟南芥； C、转化的拟南芥结的种子经除草剂Basta筛选，对抗性植株用Trizol法分别提取基因 组DNA和总RNA，分别W耐逆基因特异引物做PCR和反转录-PCR(RT-PCR)进行分子鉴定， 经过W上检测步骤得到的植株为T1代转基因植株； d.获得耐逆基因纯合转基因植株：T1代转基因植株自交得到T2代种子，种植T2代种 子并用除草剂Basta筛选，抗性植株继续生长、结出T3代种子，种植T3代种子，用抗除草剂 Basta筛选，并根据其除草剂抗性，挑选已纯合的T2代产生的纯合T3代进行后续耐逆表型 研究； 3) 转基因植物的耐逆性鉴定： a、 盐胁迫后存活率分析； b、 盐胁迫后植株大小分析； C、盐胁迫后叶绿素含量分析；t干旱胁迫后植株重量分析； 上述方法中，步骤1)中，所述高盐LB液体培养基，按照如下方法制备：向800ml蒸馈水 中分别加入lOg膜蛋白腺，5g酵母水解物，50g氯化钢，揽拌充分溶解后，用蒸馈水水补足体 积1000ml，121°C高压灭菌18分钟后备用； 步骤1)中，所述细菌基因组DNA提取液成分为：Tris盐酸40mM，醋酸钢20mM，邸TA ImM,SDS1%,pH7. 8 ； 步骤1)和步骤2)中，所述PCR及RT-PCR扩增程序为预变性95°C5分钟；30个循环： 95°C30秒，56°C45秒，72°C100秒；72°C延伸10分钟；所述PCR及RT-PCR反应体系为：细 菌基因组DNA或植物基因组DNA或反转录产生的cDNA2yl，dNTPs(2. 5mM) 1μ1，正向引物 (2. 5μΜ) 1μ1，反向引物（2. 5μΜ)1μ1，10ΧPCRbuffer2yl，rTaq0. 2μ1，Η2〇 13μ1。
[0012] 步骤2)中，所述LB培养基成分为：膜蛋白腺1%，酵母水解物0.5%，氯化钢1%;在 配制固体LB培养基时，还需加入琼脂使其终浓度为2%。
[0013] 步骤2)中，所述除草剂为Basta(草下麟)，浓度为5mg/L。
[0014] 步骤2)中，所述根癌农杆菌为具体为GV3101。
[0015] 本发明的实验证明，采用本发明的方法，可将耐逆基因，通过根癌农杆菌方法转入 植物，得到转基因植株与野生型植物相比，在高盐和干旱胁迫情况下，具有显著增强的耐逆 能力。
【附图说明】
[0016] 图1 :a. 基因编码区PCR、酶切产物；b.载体pTFlOl. 1酶切产物 图2:菌落PCR检测结果 图3 :转基因植株基因组DNA的PCR鉴定结果，wt:非转基因植株对照山2 :不同的转