提高植物胁迫抗性的方法和材料的制作方法

专利名称：：提高植物胁迫抗性的方法和材料的制作方法
技术领域：
：本发明涉及植物中的胁迫抗性，比如抗旱性、抗盐性、抗热或抗旱性、抗光性和抗PH性，以及用于提高植物中胁迫抗性和用于筛选植物中与提高胁迫抗性提高相关的突变的方法和材料。本发明还涉及用于延迟植物中开始开花和改变植物叶片形状的方法和材料。
背景技术：
：全世界作物产量最大的限制因素是非生物胁迫，导致平均有超过50%的潜在产量损失(Boyer,J.S.(1982),"PlantProductivityandEnvironment"Science218(4571)443-448)。非生物胁迫包括极端温度、盐度、酸性土壤、高光强、干旱及其组合。因为植物是固定的，不能逃离这些胁迫条件，所以它们通过改变蛋白质和代谢物组成、形状和生理而作出响应。这些改变允许植物通过适应胁迫条件而使所受损伤受到限制，还可以修复由胁迫引起的损伤。这些改变由过程介导，所述过程可感知胁迫和/或其对植物的影响，并激活多个复杂的信号传导通路。依赖于经历的胁迫条件的类型，由植物激活不同的通路，但是通路间经常重叠并且相互作用。这种重叠能引起交叉抗性，即尽管只接触一种胁迫条件，却对多种类型胁迫产生抗性。这很重要，因为胁迫很少单独发生。例如低温胁迫还会导致高光胁迫，因为尽管低温会引起植物代谢变慢，但如果光能和从前一样多，植物还是能丰收。同样地，干旱能引起高温胁迫，因为要关闭气孔保持水分，但是因此牺牲了蒸发的冷却作用，导致高温胁迫。此外，在自然中，胁迫条件很少单独存在。在澳大利亚，作物同时经历干旱和高光胁迫是可以理解的。尽管已经研究了胁迫信号传导通路的一些组分，但是由于胁迫响应通路的复杂性，对这些组分在通路中的位置和它们与其它组分的相互作用知之甚少，并且因此现有的改善植物胁迫抗性的方法有限。因此，需要新方法生产胁迫抗性提高的植物。
发明内容本研究令人惊讶地显示了SALl基因中的突变，所述突变可导致与SALl蛋白质有关的活性降低或消失，使突变体植物的胁迫抗性提高。因此，根据本发明的一个方面，提供用于获得相对于野生型植物的胁迫抗性提高的植物的方法，方法包括(a)将至少一个突变或外源性核酸导入一个或多个植物细胞的基因组，所述至少一个突变或外源性核酸导致在所述一个或多个植物细胞中与SALl或其同源物有关的活性降低；(b)从所述一个或多个植物细胞再生一个或多个植物；和(c)选择一个或多个相对于野生型植物的胁迫抗性提高的植物。可以通过本领域已知的任何适当方法将至少一个突变或外源性核酸导入。例如，可以通过化学或物理诱变技术，或使用插入突变方法如转座子或T-DNA，导入突变，并且可以通过重组方法，使用例如化学辅助细胞渗透(使用，例如钙、锂、PEG)、电穿孔、微注射、月旨质体介导的转染、微粒轰击(生物弹道)、农杆菌介导的转化、病毒感染、原生质体融合或本领域已知的任何其它合适的方法导入外源性核酸。根据本发明的实施方式，所述方法包括将至少一个突变导入SALl基因或其同源物，或者抑制或阻抑SALl基因或其同源物的表达。可以将至少一个突变导入一个或多个植物细胞中编码SALl或其同源物的核苷酸序列中，并且可以包含一个或多个核苷酸的插入、缺失或替代。根据另一个实施方式，突变可以包括位于SEQIDNO:1的核苷酸731至745、1226、1518、1519和1690区域中，或在SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置处的一个或多个核苷酸的插入、缺失或替代。根据另一个实施方式，突变可以包括在SEQIDNO:1的位置1226处，或SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置处由鸟嘌呤至腺嘌呤的突变。产生的突变可以导致SEQIDNO:2的位置217处由甘氨酸至天冬氨酸的氨基酸变化。根据另一个实施方式，突变可以包括在SEQIDNO:1的位置731处，或SEQIDNO:1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置处由胞嘧啶至胸腺嘧啶的突变。产生的突变可以导致SEQIDNO2的位置124处由丙氨酸至缬氨酸的氨基酸变化。根据另一个实施方式，突变可以包括在SEQIDNO1的位置736处，或SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置处由鸟嘌呤至腺嘌呤的突变。产生的突变可以导致SEQIDNO:2的位置217处由谷氨酸至赖氨酸的氨基酸变化。根据另一个实施方式，突变可以包括在SEQIDNO:1的位置1690处，或SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置处由鸟嘌呤至腺嘌呤的突变。根据另一个实施方式，突变可以包括在SEQIDNO:1的位置734和735之间，或SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置处一个或多个核苷酸的插入，或者突变可以包括用一个或多个核苷酸替代SEQIDNO1的核苷酸734-735，或SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同的核苷酸。根据另一个实施方式，突变可以包括在SEQIDNO1的位置1518和1519之间或包含位置1518和1519，或在SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置处插入一个或多个核苷酸。根据一个实施方式，突变可以是SALl无效突变。根据另一个实施方式，本发明的方法可以包含向所述一个或多个植物细胞导入外源性核酸，所述外源性核酸能抑制内源性SALl或其同源物的表达，或者用外源性蛋白质的表达替代内源性SALl或其同源物的表达。外源性蛋白质可以是外源性突变SALl或其同源物，或者任何其它合适的蛋白质，比如提供可筛选的表型的蛋白质。由根据本发明方法产生的植物对很多非生物胁迫的抗性相对于野生型植物提高，所述胁迫包括，但不限于，干旱、盐、温度胁迫、光胁迫、土壤PH和矿物质毒性、或它们的任何组合。相对于野生型植物，所述植物对生物胁迫的抗性提高，所述胁迫由动物(包括食草动物和宠物或寄生生物体)、细菌、真菌和病毒或它们的任何组合诱导，但不限于此。根据一个实施方式，产生的植物相对于野生型植物至少抗旱性提高。根据本发明的方法的另一个实施方式，产生的植物的开花时间延迟。根据本发明的方法的另一个实施方式，产生的植物的叶片表型改变。根据本发明的另一个实施方式，提供用于获得相对于野生型植物的开花时间改变的植物的方法，方法包含(a)将至少一个突变或外源性核酸导入一个或多个植物细胞的基因组，所述至少一个突变或外源性核酸使所述一个或多个植物细胞中与SALl或其同源物有关的活性降低；(b)从所述一个或多个植物细胞再生一种或多种植物；和(c)选择相对于野生型植物的开花时间改变的一种或多种植物。根据本发明的另一个实施方式，提供用于获得相对于野生型植物叶片表型改变的植物的方法，方法包括(a)将至少一个突变或外源性核酸导入一个或多个植物细胞的基因组，所述至少一个突变或外源性核酸使所述一个或多个植物细胞中与SALl或其同源物有关的活性降低；(b)从所述一个或多个植物细胞再生一种或多种植物；和(c)选择相对于野生型植物的叶片表型改变的一种或多种植物。还提供通过本发明的方法获得的植物，和植物部位(包括叶、茎、根、块茎、花、果实及其部分)和来自植物的突变体/转基因种子。根据本发明的另一个实施方式，提供筛选存在核苷酸序列的至少一个突变等位基因的植物的方法，所述核苷酸序列编码SALl或其同源物，所述方法包括使用至少一个适合作为探针或引物的核酸分子分析植物的DNA，所述探针或引物能在严格条件下与SALl基因或其同源物杂交。根据更具体的实施方式，筛选方法可以包括使用适于扩增SALl基因或其同源物区域的至少一个寡核苷酸引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，检测所述区域中是否存在突变。所述区域包含完整的SALl基因或其同源物，或者可以仅包含其中一部分，比如，例如(参照图10)，核苷酸区域，其包含外显子3、外显子3和4之间的内含子、外显子5、外显子5和6之间的内含子、和外显子6和7之间的内含子、或它们的任何组合。核酸分子，或寡核苷酸引物对的成员，可以是适于在严格条件下与靶标核苷酸序列特异性杂交的任意长短，并且包含从约15个核苷酸到约100个核苷酸，但是长度更通常地从约15至约30个核苷酸。图l-alx8中SAL基因中点突变的鉴定A.色谱图谱，表示Col-O野生型和由逆代杂交得到的多个alx8个体以及包含APX2-LUC构建体的Col-O野生型中点突变区域的序列。下划线表示由ContigExpress(Invitrogen,Carslbad，CA,USA)计算得到的一致性序列。第二个下划线表示来自ArabidopsisInformationResource(TAIR;www.arabidopsis.orR)的SALl基因序列。点划线框表示点突变的位点，并且实线框表示为dCAPS引物导入的突变。除APX2-LUC之外的所有序列为反向，即3’到5’。B.来自TAIR的所有alx8个体和SALl基因+3kb启动子的所有序列的比对。箭头表示基因序列5’到3’的方向。图2-alx8中SALl基因中点突变的验证将来自拟南芥信息资源(TAIR)的T8H11BAC的SALl基因和约1.07kb的启动子消化并连接进PCAM2300文库载体(CAMBIA，Canberra,Australia)。通过农杆菌介导转化而转化Col-O野生型和alx8植物。分离得到用基因的野生型拷贝回补的alx8的两系。还分离得到七个系的包含构建体的Col-O野生型，并且所述野生型未表现出可见的表型。图3-alx8SALl基因组序列(TAIR登录序列4010730406；名称AT5G63980.1；序列长度(bp):2122；最后修正日期2007-04-17)。这个序列在序列表中鉴定为SEQIDN0:1。这个基因组序列是此前的TAIR登录号2160829的更新版本，并且其位于TAIR登录号2160829中预测的起始密码子上游162个核苷酸处。alx8中的点突变(gl226a)、起始密码子(atg)和终止密码子(tga)高亮显示。图4-alx8氨基酸序列(TAIR登录号:AA序列4010745380；名称AT5G63980.1；长度407aa；最后修订日期2007-08_16)。这个序列在序列表中鉴定为SEQIDNO:2。alx8中的氨基酸变化(G217D)高亮显示。图5-与SALl同源的蛋白质的比对使用blastp工具，在国家生物技术信息中心网站(NCBI;www.ncbi.nlm.nih.gov)鉴定与SALl同源的蛋白质。然后使用ClustalW，在欧洲生物信息研究所(EMBL-EBI；www,ebi.ac.uk)比对这些蛋白质。登录号如下SALl，AY03894/Q42546(SEQIDNO46)；水稻(Oryzasativa),NP_001066326/NM_001072858(SEQIDNO44)；玉米(Zeamays),AAK57915/AF288075(SEQIDNO:45)。“*”表示列中的残基在所有序列中都一样，“”表示观察到保守替代，并且“.”表示观察到半保守替代。图6-EST与SALlmRNA的同源性A.在基因索引软件网站(TGI；www.compbio.dfci.harvard,edu)使用blastn，发现EST与SALlmRNA具有同源性。通过同样的软件计算得到百分比同一性。B.A中列出的EST的序列比对，在EMBLjBI网站使用ClustalW比对序列。“*”表示列中的核苷酸在比对的所有序列中相同。鉴定了序列表中的下述序列云杉(SEQIDN047)；松树(SEQIDNO48)；苜蓿(SEQIDNO49)；莲花(SEQIDNO50)；大豆(SEQIDNO51)；SALl(SEQIDNO52)；油籽(油菜籽)(SEQIDNO53)；白杨(SEQIDNO54)；棉花(SEQIDNO55)；西红柿(SEQIDNO56)；马铃薯(SEQIDNO57)；洋葱(SEQIDNO58)；小麦(SEQIDNO59)；大麦(SEQIDNO60)；稻米(SEQIDNO61)；和玉米(SEQIDNO62)。C.进化分支图，显示根据B中的比对对共同祖先的估计。由EMBL-EBI网站计算。图7-干旱条件对Col-O野生型、fryl-Ι和alx8的影响。在21°C，150微摩尔光子mY1，16小时白昼/8小时黑夜，保持水分13天。对于每种生态型，由5个生物复制样本作为代表。所有植物都是大概相同的发育年龄，并且在干旱时期开始时尚未开花野生型植物4周龄，而alx8和fryl-Ι植物为8周龄。图8-fryl-l和alx8耐旱。4周龄植物接触干旱条件25天，条件为21°C，150微摩尔光子JiT2iT1,12小时白昼/12小时黑夜。A)0、10、17、21和25天后，fryl_l、C24野生型、alx8和Col-O野生型植物接触干旱条件。在两个单独的实验中，每个基因型由五株植物作为代表。B)由盆重量随时间的变化估计土壤的水流失。给出了A)中植物的盆重量和平均盆重量。误差条为五个生物副本之间的标准偏差。图9-来自耐干旱拟南芥突变体SALK—020882的SALl基因组序列(突出显示起始密码子(atg)和终止密码子(tga))。从拟南芥生物资源中心(ABRC)获得Col-O生态型中的T-DNA插入系。突变与alx8等位。A)TAIR给出的插入位点。通过从T-DNA插入的LB单次测序而建立。这给出了互补序列，即朝向基因的5，末端。(SEQIDNO3)B)为了确认插入的位置，从来自一个植物的DNA上的插入的左边界开始进行热不对称交错PCR(TAIL-PCR)。由两侧获得序列，表明出现双插入的可能性。获得的序列还表明在插入位点附近缺失llbp。(SEQIDNO4)图10-SAL1基因的大规模描述。外显子用方框表示，内含子用线表示，箭头代表设计用于扩增的引物(参见表1)，还给出了salk和fryl-3插入的位置，和fryl-l,fryl_2、hos2和鉴别的alx8点突变的位置。图Il-SALl的western印迹。使用抗SALl抗体和来自Col-O和alx8的全叶蛋白质，将来自Col-0、C24、alX8和fryl-Ι的体内全可溶叶蛋白质提取物中的SALl蛋白质粉丰度与5ng重组SALl蛋白质比较(图11B)。使用由Ponceau染色检测的二磷酸核酮糖羧化酶的大亚基作为上样对照(loadingcontrol)。分析每个基因型的两株植物，并标明蛋白质标记的分子量。图12-从左至右为下述照片alx8突变体、fryl-Ι突变体、Col-O野生型、C24野生型和salk_020882突变体拟南芥植物，表示与对应于C24野生型的叶形改变相比，salk_020882突变体和alx8突变体叶形的改变和fryl_l突变体叶形的改变相似。图13-表示植物无水存活平均天数的条形图。突变体salk_020882表现出最大的耐干旱性，平均存活18.4天，alx8突变体为16.3天，野生型为12.0天(样品大小三株野生型和alx8植物和六株salk_020882植物)图14-照片表示最下面一行_干旱测试；最上面一行_对照；从左至右野生型植物(11天，干旱胁迫植物即将死亡前)，salk_020882突变体和alx8突变体(两种突变体在14天干旱处理后仍然存活)。图15A和15B-图15A显示下述照片，从左至右为，在接触干旱条件0、14、16和18天后(从上至下)，然后重新浇灌后三天的Col-O野生型、alX8、salk_020882、fryl-l和C24野生型植物。重新浇灌三天后，alx8和fryl-Ι突变植物表现出较强的恢复，包括叶片绿色并膨胀，同时野生型植物如果有任何恢复的迹象，也是表现为大多数叶子变黄和枯萎。所示植物是三次重复实验的代表，实验涉及每个基因型的五株植物。图15B显示干旱处理过程中的土壤水含量(SWC)。图16A和16B-图16A显示叶片相对水含量(RWC)，并且图16B显示在非胁迫条件下和干旱12天后Col-O和alx8的叶片中的叶片水势。柱为至少四株植物的平均值士标准偏差(SD)。图17-显示下述照片2、3、5和8周龄Col-O野生型植物(上图)和alx8植物(下图)，表明alx8植物中存在发育延迟。还证明8周龄Col-O野生型植物正在开花(花籽为证)，同时alx8植物还没有开花。图18-A显示Col-O野生型叶片和alx8叶片的叶片厚度的条形图；B显示典型的Col-O野生型叶片和alx8叶片的横截面。图19-表示早晨(上图)和晚上(下图)fryl_l、C24野生型、alx8和Col-O野生型植物叶片碘染色的结果，表明这些SALl突变体叶绿体中的淀粉含量显著降低。图20-SAL1突变体及其野生型的代谢物谱的主成份分析(PCA)。使用每个生态型的至少四株生物副本中的超过150个代谢物的丰度计算PCA。绘制出由主成份1和2(PCl和PC2)考查的总方差百分比。图21-显示大小、发育和形态对抗旱性的影响。㈧在相同发育阶段(开始开花)时Col-0,alx8和salk_020882的抗旱性；显示了27株alx8和5株fryl-Ι植物在干旱的第O天和第9天的代表图像。植物每天生长12小时。(B)在发育的相同生长阶段(成熟绿色)植物的抗旱性，alx8和fryl-Ι为四周龄，Col-O为八周龄。植物为每个生态型的五株生物副本的代表，生长条件为每天16小时。(C)测量(A)的盆重量，并绘制成初始重量的百分比；绘制了五个家系中每个的平均值+S.D.。(D)针对干旱活力，绘制在两个单独实验中生长的一些30日龄Col-O植物的莲座区域。生长条件为每天8小时。(E)分离的莲座的脱水。数据为四个生物副本的平均值+SD。实验重复三次。(F)在相同年龄的Col-O(每盆一株植物)和alx8(每盆两株植物)进行9天保水。生长条件为每天16小时。缩写ABA-脱落酸IP3-I,4，5三磷酸肌醇I(1，4)P2-I，4二磷酸肌醇1(4,5)P2-4，5二磷酸肌醇PAP-3’多腺苷5’磷酸酯ROS-活性氧部分WT-野生型定义如本文所使用的，术语“包含”表示“主要包括，但不一定仅包括”。单词“包含”的变化形式，具有相对应的相似含义。如本文所使用的，术语“基因”，指位于基因组中的确定区域，并且可以包含负责控制表达，即编码部分的转录和翻译的控制性核苷酸序列。基因还可以包含其它5’和3’未翻译序列和终止序列。可以存在的其它元件为例如内含子。如本文所使用的，在描述蛋白质时，术语“同源”表示在不同部分基本具有相同功能和相似性质的蛋白质，并且其在至少部分区域中，共享至少50%氨基酸同一性。这种同源蛋白质可以在完整的氨基酸序列中共享至少约30%氨基酸同一性，至少约40%氨基酸同一性，至少约50%氨基酸同一性，至少约60%氨基酸同一性，至少约70%氨基酸同一性，至少约80%氨基酸同一性，至少约90%氨基酸同一性或至少约95%氨基酸同一性。相似地，核苷酸分子的同源性是编码在不同部分基本具有相同功能和相似性质的蛋白质的核酸分子，其中所述编码的蛋白质在至少部分区域中，共享至少50%氨基酸同一性(这种核酸同源性由于基因编码的简并性和不同植物种属之间优选密码子用途之间的差异而共享显著少于50%的同一性)，可以在完整的氨基酸序列中共享至少约30%氨基酸同一性，至少约40%氨基酸同一性，至少约50%氨基酸同一性，至少约60%氨基酸同一性，至少约70%氨基酸同一性，至少约80%氨基酸同一性，至少约90%氨基酸同一性或至少约95%氨基酸同一性。如本文所使用的，术语“突变”表示相对于野生型多肽或核酸分子，多肽或核酸分子中的任何变化，由这种变化产生“突变体”，并且“突变体”可以例如包含单个或多个氨基酸或核苷酸变化，或者同时包含核苷酸和氨基酸变化，包括点突变、无效突变、移框突变，并且可以包含一个或多个核苷酸或氨基酸的缺失、插入或替代，其可以包含天然或非天然发生的核苷酸或氨基酸或其类似物。“核酸”，如本文所表示的，指脱氧核糖核酸或核糖核酸及其单链、双链或三重形式的聚合物。该术语可以包括包含天然核苷酸的类似物的核酸，所述天然核酸与参照核酸具有相似的结合活性。特定的核酸序列还可以包含其经过保守修饰的变体(例如简并密码子替代物)和互补序列。术语“核酸”、“核酸序列”或“多核苷酸”也可以与基因、cDNA和由基因编码的mRNA交替使用。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可以交替使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语的范围中包括聚合物，其中一个或多个氨基酸残基可以包含相应天然发生的氨基酸的人工化学类似物，以及，或者替代天然发生的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”还可以包括包括修饰的聚合物，比如，但不限于，糖基化、脂质吸附、硫酸化、谷氨酸残基的、羧化作用、羟基化和ADP-核糖基化。术语SALl和FRYl如本文所使用的，可互换，术语SALl和FRYl亦然，这些术语指相同的蛋白质和编码核苷酸序列。具体实施例方式本发明基于下述发现在SALl编码基因中具有突变的植物对胁迫的耐受性提高，包括提高抗旱性。SALl蛋白质是双功能的，具有肌醇多磷酸酯1-磷酸酶活性和3’(2’)，5’-二磷酸核苷酸酶活性，并且参与IP3的分解代谢，IP3是涉及压力信号传导的小分子。有多种肌醇磷酸酶或Ptase，其都从IP3分子上的不同位置剪切磷酸酯。这些不同的活性，除了全部导致IP3降低外，经常产生不同表型，可能是由于水解产物的功能功能，比如I(1，4)P2和1(4，5)P2。表型差异还可能由于这些已经被极大削弱的酶的第二种活性，比如SALl的核苷酸酶活性。此外，酶的定位和表达水平的差异可能影响表型。令人惊讶的是，SALl对IP3的体外活性相对较低(特别是和它的核苷酸酶比较)。已经分离了SALl中的多个突变体，并称为fryl突变体(fieryl；Ishitani,M.,L.M.Xiong等(1997),"GeneticahalysisofosmoticandcoldstresssignaltransductioninArabidopsisInteractionsandconvergenceofabscisicacid-dependentandabscisicacid-independentpathwaysPlantCell9(11)1935-1949；Xiong,L.Μ.,B.H.Lee^(2001),"FIERY1encodinganinositolphlyphosphate1-phosphataseisanegativeregulatorofabscisicacidandstresssignalinginArabidopsis，，，Genes&Development15(15):1971-1984)或hos2突变体("highexpressionofosmoticstressregulatedgeneexpression2，，；Lee,H.,L.Xiong等(1999),‘‘Cold-regulatedgeneexpressionandfreezingtoleranceinanArabidopsisthalianamutant，，，ThePlantJournal17(3)301-308；Xiong,L.,H.Lee,等(2004),‘‘AsingleaminoacidsubstitutionintheArabidopsisFIERYl/H0S2proteinconferscoldsignalingspecificityandlithiumtolerance",ThePlantJournal40=536-545)。如先前所报道的，在选择胁迫响应基因RD29A的表达变化中分离这些突变体。在正常条件下fry1-1突变体的RD29A表达增加，在低温、盐和渗透胁迫和ABA处理后也是如此。据报道这是由于点突变产生SALl蛋白质(At5g63980)的第六个外显子中的终止密码子，产生截短型蛋白质，其不包含保守的α-螺旋，α-螺旋包含WD-X11-GG基序，是金属离子和磷酸盐的协调以及亲核水活化所需的。结果是蛋白质对IP3或PAP无活性。据报道fryl-Ι突变体对盐、低温和渗透压的胁迫敏感性增加(Xiong等，2001)。胁迫响应基因表达，比如HSP70(Atlgl6030)、C0R15A(At2g42540),KINl(At5gl5960)和ADH(Atlg77120)，与野生型相比，在对胁迫响应时在突变体中也增加(Xiong等，2001)，使人们相信SALl作为压力胁迫途径的负调节子。也报道了其它fryl突变体，fryl-2和fryl_3，，是具有相似性质的无效突变(Xiong等，2001)。hos2-l突变体是温度敏感突变体，其中胁迫响应基因表达在低温改变，并且是低温胁迫敏感型(Xiong等，2004)。与野生型植物相比，这个突变体的基因表达在正常条件下或通过渗透或ABA胁迫不会改变(Lee等，1999)。在fryl或hos2突变体中未报道干旱、盐、光、冷或热耐受性。本发明人先前在正常条件和高光胁迫后筛选抗氧化酶抗坏血酸过氧化物酶2(APX2)诱导变化的突变体中，已经分离了拟南芥突变体，alx8。在两种条件下alx8突变体的APX2表达均增加，并且叶形变化，抗旱性增加(Rossel,J.B.，P.B.Walter等.(2006),"AmutationaffectingASC0RBATEPER0XIDASE2geneexpressionrevealsalinkbetweenresponsestohighlightanddroughttolerance",Plant,CellandEnvironment29(2)=269-281)发现这些性质共分离(co-segregating)，表明它们是单点突变的结果。还发现alx8改变了多个胁迫响应基因的表达，表明参与拟南芥中干旱胁迫响应信号传导的多个途径的差异调节。然而，这个突变体的本质至今为止尚未确定。在突变体的定位克隆后，发现突变位于先前鉴别的SALl基因中。对这个基因的无效突变体fry1-1的研究，现在表明还增加了抗旱性。另一个拟南芥突变体，命名为salk_020882，其在SALl基因中包含约IOkbT-DNA插入，对其已经进行了研究，发现相对于野生型植物增加了抗旱性。因此，通过修饰这个基因的表达可能改善农业上具有重要意义的植物品种的抗旱性。因此，本发明提供用于获得相对于野生型植物的胁迫抗性提高的植物，包括(a)将至少一个突变或外源性核酸导入一个或多个植物细胞的基因组中，使所述一个或多个植物细胞中与SALl或其同源物有关的活性降低；(b)从所述一个或多个植物细胞再生一个或多个植物；和(c)选择相对于野生型植物的胁迫抗性提高的一个或多个植物。根据实施方式，方法包括向SALl基因或其同源物导入至少一个突变，或者抑制或阻抑SALl基因或其同源物的表达。可以通过本领域已知的任何合适的方法，将导致一个或多个植物细胞与SALl或其同源物有关的活性降低的突变导入所述一个或多个植物细胞中，例如，合适的方法可以包括使一个或多个植物细胞(其可以是植物种子细胞，或植物部位的细胞，以及分离的植物细胞)接触化学或物理突变手段，或插入突变手段如转座子、还原转座子、逆转录病毒或T-DNA。合适的用于将突变导入植物基因组的材料和方法也在例如国际专利公开W098/26082,"ArabidopsisProtocoIs，，(2ndEdition,Salinas,J.禾口Sanchez—Serrano，J.，eds,MethodsinMolecularBiology323(2006),HumanaPress)，禾口“CurrentProtocolsinMolecularBiology”(Ausubel等(eds)，JohnWiley&Sons(2000))中描述，其通过引用并入本文。还通过用野生型植物与包含突变的植物(如先前通过基因筛选和/或分析所确定的-包含期望突变的植物可以已经存在于提供的植物种质/培养物/种子收集物/变体中)杂交而将突变导入一个或多个植物细胞，并且植物可以由得到的种子产生，然后筛选突变继承。根据本发明的实施方式，将突变导入所述一个或多个植物细胞中编码SALl的核苷酸序列或其同源物，并且突变可以包括编码SALl的核苷酸序列或其同源物中一个或多个核苷酸的插入、缺失或替代。在一个实施方式中，突变是SALl无效突变。或者，突变可以产生表达产物，然而其与SALl或其同源物有关的活性至少降低。在本研究过程中鉴别的SALl突变导致相对于野生型植物，包括fryl-1、alx8和salk_02882突变体，拟南芥植物的抗旱性至少提高。fryl-Ι突变导致从色氨酸到终止密码子的第341个氨基酸的变化，产生缺失α5螺旋的截短型蛋白质，所述螺旋是酶活性所需要的(At5g63980)。alx8突变体具有点突变，包括在At5g63980.1基因组序列中第1226个碱基对上鸟嘌呤到腺嘌呤的变化(TAIR序列4010730406(2007年4月17日)，登录号NM_125794.4:SEQIDNO1的1226位置)。alx8突变体表达突变的SALl蛋白质，包含氨基酸序列的第217个氨基酸上甘氨酸到天冬氨酸的氨基酸变化(TAIR序列4010745380(2007年8月16日)，登录号NP_201203.2:SEQIDNO:2)，并且salk_02882突变体在SEQIDNO1的位置734和735之间包含约IOkbT-DNA插入或替代SEQIDNO1的核苷酸735至745。期望具有更高胁迫抗性的其它突变体，包括抗旱性更高的突变体，是fryl-2、fryl-3和hos2突变体。fryl_2突变体包括在At5g63980.1基因组序列中第736个碱基对上鸟嘌呤到腺嘌呤的变化(TAIR序列4010730406，登录号:NM_125794.4=SEQIDNO:1的736位置)，导致位置126(SEQIDNO2)的谷氨酸残基替代成赖氨酸，产生无活性蛋白质。fryl-3突变体在At5g63980.1基因组序列中第1518个碱基对上第五个和第六个外显子之间包含6.7kbT-DNA插入(TAIR序列4010730406，登录号NM_125794.4=SEQIDNO1的1518位置)，导致没有RNA转录本。hos2-l突变体在At5g63980.1基因组序列中第731个碱基对上包含胞嘧啶到胸腺嘧啶的突变(TAIR序列:4010730406，登录号:NM_125794.4=SEQIDNO1的731位置)，导致位置124(SEQIDNO2)的丙氨酸残基由缬氨酸替代，产生具有温度敏感活性的表达蛋白质。根据本文提供的教导，仅通过常规实验，可以获得或产生SALl的其它突变体，或其同源物，并且，例如，这种核苷酸序列(和编码蛋白质)表现出高保守程度-参见，例如，图5和6。本发明的方法能应用本领域已知的任何诱变剂(使用本领域同样已知的方法)，包括，但不限于紫外光、X-射线辐射、Y辐射或快中子突变、N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)、甲基亚硝基脲(MNU)、甲苄胼(PRC)、三乙撑蜜胺(TEM)、丙烯酰胺单体(AA)、苯丁酸氮芥(CHL)、美法仑(MLP)、环磷酰胺(CPP)、二乙基磺酸(DES)、乙基甲磺酸(EMS)、甲基甲磺酸0MS)、6_巯基嘌呤(6-MP)、丝裂霉素C(MMC)、N-甲基-N，-亚硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、3H2O和尿烷(UR)。接触一种或多种诱变剂的基因修饰率可以通过改变处理剂量和/或重复次数而调节，并且能为具体应用定制。在一个实施方式中，处理剂量和方案基本不诱导对于一个或多个细胞的细胞毒性。SALl或其同源物中的突变，可以检测，然后(在后面几代中)通过使用本领域公知的技术，用已知的SALlDNA序列，和根据编码SALl或其同源物的基因或核苷酸序列的合适探针或引物检测。如果突变在SALl以外的基因中，在植物传代中跟踪/追踪之前需要鉴别、定位和/或识别突变。用于鉴别、定位和识别未知突变的合适方法对于本领域人员已知，并且在很多公知的标准文本中描述，比如Sambrook，J.等，MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory(1989),Sambrook,J.和Russell，D.W.(2001),"MolecularCloning:ALaboratoryManual，，，3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,和本文弓|用的文献，禾口Ausubel等(eds)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(2000)。还参见Rossel，J.B.，Cuttriss,Α.禾口Pogson,BlJ."IdentifyingPhotoprotectionMutantsinArabidopsisthaliana"inMethodsinMolecularBiology274287-299(Carpentier,R.Ed,HumanaPress)。鉴别突变等位基因的更新的方法包括“Tilling”和高分辨熔融(HRM)。ILLING(基因组中的靶向诱导局部损伤)是分子生物学中的方法，允许特定基因中突变的定向鉴别。方法将标准技术(例如，用化学诱变剂如乙基甲磺酸(EMS)诱变)与可以鉴别靶基因中单碱基突变(也称作点突变)的敏感的DNA筛选技术相结合。第一篇描述拟南芥中TILLING的论文(McCallumCM,ComaiL,GreeneEA,HenikoffS,"Targetedscreeningforinducedmutations，，，NatBiotechnol.(2000)Apr；18(4):455_7,通过交叉引用并入本文)使用dHPLCHPLC鉴别突变。所述方法通过使用限制性酶Cel-I结合基于凝胶的系统鉴别突变而获得更高的通量(ColbertΤ,TillBJ,TompaR，ReynoldsS，SteineMN,YeungAT,McCallumCM,ComaiL,HenikoffS,"High-throughputscreeningforinducedpointmutations，，，PlantPhysiol.(2001)Jun；126(2):480_4，也通过交叉引用并入本文)。其它突变检测，比如重测序DNA，已经与TILLING结合。已经使用TILLING作为其它生物体如斑马鱼、玉米、小麦、稻米、大豆、马铃薯和莴笋中的反向基因方法。还参见McCallumCM，ComaiL，GreeneEA,HenikoffS.“Targetinginducedlocallesionsingenomes(TILLING)forplantfunctionalgenomics，，PlantPhysiol.(2000)Jun；123(2)439-42；ColbertT，TillBJ，TompaRiReynoldsSiSteineMN，YeungATjMcCallumCM，ComaiL，HenikoffS.High-throughputscreeningforinducedpointmutations”，PlantPhysiol.(2001)Jun；126(2)480-4；DraperBff,McCalIumCM,StoutJL,SladeAJ,MoensCB,"Ahigh-throughputmethodforidentifyingN-ethyl-N-nitrosourea(ENU)-inducedpointmutationsinzebrafish，，，MethodaCellBiol.(2004)；77:91_112；禾口SladeAJ,FuerstenbergSi,LoefflerD,SteineMN,FacciottiD,"Areversegenetic,nontransgenicapproachtowheatcropimprovementbyTILLING，，，NatBiotechnol.(2005)Jan；23(1):75_81，也通过交叉引用并入本文。HRM(高分辨熔融)是近来的进展，其能通过利用高分辨熔融设备最近的进展和双链特异性DNA(dsDNA)结合染料的进展的优势，极大地扩展传统DNA熔融分析的用途，其中所述染料能以足够高的浓度使用，使PCR过程中产生的所有双链位点饱和(参见http//www,corbettlifescience.com/control,cfm？page=Introduction4&bhcp=1)，以及DufresneSD，BelloniDR，WellsWA,TsongalisGJ,"BRCAlandBRCA2MutationScreeningusingSmartCyclerIIhigh-resolutionmeltcurveanalysis”，ArchPatholLabMed(2006)130185-187；GrahamR，LiewM,MeadowsC,LyonE,WittwerCT，"DistinguishingdifferentDNAheterozygotesbyhighresolutionmelting，，，ClinicalChemistry(2005)511295-1298；HermannMG,DurtschlJD,BromleyK，WittwerCT,VoelkerdingKV,"AmpIiconDNAmeltinganalysisformutationscanningandgenotypingcross-platformcomparisonofinstrumentsanddyes，，，ClinicalChemistry(2006)52494-503；LiewM，PryorR，PalaisR,MeadowsC，EraliM，LyonE，WittwerC，“GenotypingofsinglenucleotidepolymorphismsbyhighresolutionmeltingofsmallampIicons",ClinicalChemistry(2004)501156-1164；MargrafRL,MaoR，HighsmithWE,HoltegaardLM,WittwerCT，“MutationScanningoftheRETprotooncogeneusinghighresolutionmeltinganalysis，，，ClinicalChemistry(2006)52138-141；NGRL(Wessex)ReferenceReagentReportJanuary2006，“Plasmidbasedgenericmutationdetectionreferencereagents；productionandperformanceindicatorfieldtrial，，(www.nRrl.orR.uk/ffessex/downloads,htm)；NGRL(Wessex)ReferenceReagentReportJanuary2006，"ProductionandfieldtrialevaluationofreferencereagentsformutationscreeningofBRCAl，BRCA2，hMLHlandMHS2”(www.nRrl.orR.uk/ffessex/downloads.htm)；NGRL(Wessex)ReferenceReagentReportJanuary2006，"MutationScanningbyHighResolutionMelts-EvaluationofRotor-Gene6000(CorbettLifeScience)，HR-1and384wellLightScanner(IdahoTechnology)”(www.nRrl.orR.uk/ffessex/downloads,htm)；ReedGH,WittwerCT，"Sensitivityandspecificityofsingle-nucleotidepolymorphismscanningbyhighresolutionmeltinganalysis，，，ClinicalChemistry(2004)501748-1754；Willmore-PayneC，HoldenJA,TrippS，LayfieldLJ,"HumanmalignantmelanomadetectionofBRAF—andc-kit-activatingmutationsbyhigh-resolutionampliconmeltinganalysis”，HumanPathology(2005)36486-493；WittwerCT，ReedGH,GundryCN,VandersteenJG,PryorRJ,“High-resolutiongenotypingbyampliconmeltinganalysisusingLCGreen，，ClinicalChemiatry(2003)49:853_860；WormJ，AggerholmA，GuldbergP，“In_tubeDNAmethylationprofilingbyfluorescencemeltingcurveanalysis”ClinicalChemistry(2001)471183-1189；ZhouL,MyersAN,VandersteenJG,WangL,WittwerCT,"Closed-tubegenotypingwithunlabeledoligonucleotideprobesandasaturatingDNAdye，，ClinicalChemistry(2004)501328-1335；禾口ZhouL,WangL,PalaisR,PryorR,WittwerCT,"High-resolutionDNAmeltinganalysisforsimultaneousmutationscanningandgenotypinginsolution，，ClinicalChemistry(2005)51:1770-1777。可以设计寡核苷酸引物或用其它技术选择SALl基因或其同源物中突变/插入的家系。通过培养，然后开发植物家系，其中SALl基因或其同源物的突变拷贝同源。为此可以设计PCR引物，使大部分SALl基因(或其同源物)的编码序列使用来自待检测种属的SALl基因或其同源物的序列特异性扩增(参见，例如，Baumann等(1998)，"SuccessfulPCR-basedreversegeneticscreensusinganEn-l-mutagenisedArabidopsisthalianapopulationgeneratedviasingle-seeddescent，，，Theor.Appl.Genet.97:729_734)。可以从突变体群落或现有种质，使用按照本发明表征的不同基因型(比如抗旱性、SALl相关活性降低，或与野生型植物相比基因表达的变化)，分离其它SALl-类突变体。在合适的生长时期并施加合适的非生物胁迫如保水后，可以选择SALl突变体的基因型。然后由SALl基因或其同源物中的突变引起的基因型可以通过本领域公知的分子手段构建。SALl-类突变体，包括等位基因杂合的突变体，并且其可以表达胁迫抗性基因型，也可以如后所述筛选，并且筛选用于培养过程将突变渗入同源系的突变体或为产生突变体植物而在重组技术中分离并使用的突变体基因。本发明的突变体可以通过随机诱变产生(或者已经存在)，任何植物都可以重组改造，使其表现出相似的基因型，例如一旦确定了突变如突变的SALl基因的基因基础。对于植物转化和再生的常规描述可参见，例如，Walbot等(1983)in"GeneticEngineeringofPlants，，,Kosug等(eds)PlenumPublishingCorporation,1983禾口‘‘PlantCell,TissueandOrganCulture:FundamentalMethods，，,Gambor禾口Phillips(Eds.),Springer-Verlag,Berlin(1995)ο还可参见SambrookJ.等，MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory(1989),SambrookJ.禾口Russell，D.W.(2001)，"MolecularCloning:ALaboratoryManual，，,3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,禾口其中弓|用的文献，禾口Ausubel的(eds)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(2000)。例如，本发明的方法包含向所述一个或多个植物细胞插入外源性核酸，所述核酸抑制内源SALl或其同源物的活性的表达(例如，通过调节区域，其调控SALl或其同源物、SALl-编码序列或其同源物，或由SALl-编码序列或其同源物翻译的mRNA的表达)，或者用外源蛋白质的表达替代内源SALl或其同源物的表达。外源蛋白质可以是外源的突变SALl或其同源物，或者任何合适的蛋白质，比如提供可筛选基因型的蛋白质。在一个实施方式中，外源性核酸可以包含寡核苷酸或多核苷酸，其向编码SALl或其同源物的内源核苷酸序列中，通过同源重组导入包含单个或多个核苷酸插入、缺失或替代的突变。可以通过用导入的靶向核苷酸序列与靶突变位点重组而导入单个或多个核苷酸插入、缺失或替代。例如，这样的导入核苷酸序列可以包含待导入的核苷酸序列，其任一侧为与靶序列同源的连续序列所侧翼包围，或者其位于期望的突变插入位点任一侧。按照本发明的方法，待导入基因组的核苷酸序列还可以包括与期望的调节域可操作连接的选择性标记(其可以包括，例如，胁迫诱导启动子)。与靶序列同源的核苷酸序列可以与靶序列同基因，从而提高同源重组的效率。还可以使用并非严格与靶序列同基因的同源核苷酸序列。尽管同源核苷酸序列和靶序列之间的错配能降低同源重组效率，但是不严格要求同基因，基本同源即足够。就本发明而言，同源序列和靶序列之间同源水平可以是至少约90%同一性，至少约95%同一性，至少约99%同一性或100%同一性。靶核苷酸序列可以包含于载体中。代表性载体包括质粒、粘粒和病毒载体。载体还可以包含包括表达调控元件的核酸，比如转录/翻译调控信号、复制起点、多腺苷化信号、内部核糖体进入位点、启动子、增强子等，其中调控元件与编码基因产物的核苷酸可操作地相关。这些和其它常用载体元件的筛选是常规的，并且很多这样的序列源自商业提供载体。参见，例如，Sambrook,J.等，MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory(1989),Sambrook,J.禾口Russell，D.W.(2001),"MolecularCloning:ALaboratoryManual3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,禾口其中弓|用的文献禾口Ausubel等(eds)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(2000)。可以使用本领域已知的任何合适的用于将DNA导入细胞的方法，将靶向载体导入靶向细胞，包括但不限于微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体介导的传递、病毒感染、原生质体融合和颗粒介导的摄入。可选地，用重组酶例如recA，将靶向DNA共施用与靶细胞，从而增强同源重组的效率。必要时，靶细胞可以已经包含，或已经通过转化而包含合适的靶序列。例如，可以如美国专利6，255，113所述将重组酶蛋白质载于靶向DNA上。为了增强载入过程，靶向DNA可以包含一个或多个同源核酸序列。靶向DNA还可以通过将靶向多核苷酸与重组酶一起孵育而包被重组酶蛋白质，其中重组酶与多核苷酸是非共价结合。参见，例如，A.Vergunst等(1998)，NucleicAcidsRes.262729和A.Vergunst和P.Hooykaas(1998)，PlantMolec.Biol.38:393-406，国际专利公开WO99/25821，WO99/25840，WO99/25855，和WO99/25854和美国专利5，780，296，6，255，113，和6，686，515。根据进行本发明方法的另一个实施方式，可以通过由RNA干扰(RNAi)、反义或翻译后基因沉默技术抑制SALlmRNA(或其同源物)的翻译而产生相对于野生型植物的胁迫抗性提高的植物。可以使用来自物种的靶向下调SALl基因或其同源物，或其片段，调控编码蛋白质的产生。为此可使用全长反义分子。或者，可以使用双链寡核苷酸、正义和/或反义寡核苷酸，或它们的组合靶向SALl编码RNA特定区域。使用寡核苷酸分子降低预定基因的表达水平在本领域中已知(参见，例如，Hamilton，A.J.和Baulcombe，D.C.(1999)，"AspeciesofsmallantisenseRNAinposttranscriptionalgenesilencinginplants",Science286950-952；WaterhouseP.Μ.等(1998),"VirusresistanceandgenesilencinginplantscanbeinducedbysimultaneousexpressionofsenseandantisenseRNA”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9513959-13964；和国际专禾丨」公开WO99/53050，WO99/49029，WO99/32619)。可以通过用DNA构建体转化植物细胞而原位提供寡核苷酸分子，其一旦转录，可产生双链和/或反义RNA序列，所述序列可以是全长或部分序列。基因沉默技术可以通过过量产生正义和/或反义序列(可以是全长或部分)而增强，从而产生大量dsRNA。可以使用本领域技术人员已知的标准植物转化方法产生具有上述转基因之一的转基因植物，例如，农杆菌介导的转化、原生质体的阳离子或聚乙二醇处理、电穿孔、微粒轰击、用包被转化DNA的微球或微粒搅拌溶液中的细胞悬浮液、直接DNA摄入、脂质体介导的DNA摄入等，如很多公开文本中所述，比如“MethodSforPlantMolecularBiology，，(ffeissbach&Weissbach,eds.,1988)；Clough,S.J.禾口Bent,A.F.(1998)"Floradip-.asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana"PlantJ.16,735-743；"MethodsinPlantMolecularBiology，，(Schuler&Zielinski,eds.,1989)；"PlantMolecularBiologyManual，，(Gelvin,Schilperoort,Verma,eds.,1993)；和”MethodsinPlantMolecularBiology-ΑLaboratoryManual，，(Maliga,Klessig,Cashmore,Gruissem&Varuer,eds.，1994)。还参见Sambrook,J.等，MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory(1989),SambrookJ.禾口Russell，D.W.(2001)，"MolecularCloning:ALaboratoryManual，，,3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,禾口其中弓|用的文献禾口Ausubel等(eds)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&SonS(2000)，这些文献通过交叉弓I用并入本文。转化的优选方法依赖于待转化的植物。经常使用农杆菌载体转化双子叶物种。对于单子叶物种的转化，经常使用基因枪轰炸包被转化DNA的颗粒和包被转化DNA的硅纤维，用于核转化。然而，现在已知农杆菌介导转化单子叶植物包括小麦的方法(参见，例如，国际专利公开WO97/48814；还参见Hiei，Y等(1994),PlantJ.6(2):271_282和国际专利公开WO92/06205)。用于转化选择的植物的DNA构建体可以包含与合适的5’调节序列(例如，启动子和翻译调节序列)和3’调节序列(例如，终止子)可操作连接的目的编码序列。在优选的实施方式中，编码域位于有效的组成型启动子之下，比如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子或玄参花叶病毒35S启动子。期望用于本发明的其它组成型启动子包括，但不限于T-DNA甘露氨酸合成酶、胭脂氨酸合成酶(NOS)和章鱼碱合成酶(OCS)启动子。在本发明的范围中也期望在诱导型启动子下表达正义或反义SALl-编码序列的转基因植物。本发明特别期望胁迫诱导型启动子，比如高光、干旱、盐度或温度诱导型启动子。根据本发明可以使用的启动子包括，例如，用于在光合作用组织中表达的二磷酸核酮糖羧化酶(RuBisCo)小亚基基因启动子或叶绿素a/b结合蛋白质(CAB)基因启动子；用于在种子中表达的各种种子储存蛋白质基因启动子；或者用于在转化植物的根系统中表达的根_特异性谷氨酰胺合成酶基因启动子。编码域还与合适的3’调节序列可操作地连接。例如，可以使用胭脂氨酸合成酶(NOS)多腺苷化域或章鱼碱合成酶(OCS)多腺苷化域。使用农杆菌二元载体系统进行转化，在如上所述的组成型或诱导型启动子调控下的选择的编码域，可以与核药物抗性标记连接，比如卡那霉素抗性。其它选择性标记系统包括，但不限于携带抗生素抗性(例如，对潮霉素或双丙氨磷抗性)或杀虫剂抗性(例如，对磺酰脲、草丁膦或草甘膦的抗性)的其它基因。可以使用本发明的方法转化任何植物细胞。用这种方式，可以获得基因修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子等。根据一个实施方式，待转化的植物细胞可以选自经济和/或农业经济上重要的植物家族，包括伞形科(Apiaceae)、紫菀科(Asteraceae)、十字花科(Brassicaceae)、薬禾斗(Chenopodiaceae)/览禾斗(Amaranthaceae)、菊禾斗(Compositae)、葫声禾斗(Cucurbitaceae)、蝶形花禾斗(Fabaceae)、禾本禾斗(Gramineae)、豆禾斗(Leguminosae)、早熟禾禾斗(Poaceae)、蔷薇禾斗(Rosaceae)或爺禾斗(Solanaceae)0已经转化的细胞可以按照本领域已知的常规方法在植物中生长(参见，例如，McCormick,S.等(1986)，PlantCellReports5:81-84)。得到的植物可以使自花授粉，用同样的转化株或不同转化株或混合株授粉，并且鉴别与SALl或其同源物有关的活性降低或失活的植物。可以生长两代或多代，确保这种基因型特性能稳定保持。或者，在生长繁殖的作物中，通过剪切或通过组织培养技术产生相同的植物，可以繁殖成熟突变体/转基因植物。可以进行突变体/转基因植物的选择，并且可以获得并繁殖新品种用于商业用途。可以根据缺少SALl蛋白质或其同源物或其活性，或通过增加胁迫(比如干旱)抗性，使用特异性寡核苷酸探针和/或靶基因的扩增，筛选通过本发明的方法转化/突变的植物。根据本发明的实施方式，得到的植物相对于野生型植物，对干旱、温度胁迫、光胁迫或任何其它非生物或生物胁迫，或它们的任何组合的抗性提高。根据本发明的具体实施方式，得到的植物至少相对于野生型植物的抗旱性提高。在本研究的过程中，还发现影响植物中SALl活性的突变可以以特有的方式影响开花时间，以及叶形，并且与野生型相比，显著影响突变植物的代谢。具体地，研究的所有SALl突变体中的开花时间都显著延迟，研究的植物延迟约4-5周(从而使开花时间延迟约100%)。依赖于引起开花时间延迟的突变或内源核酸，和突变或外源性核酸导入的植物，可以期望开花时间延迟不同时间，例如开花时间可以延迟从约7天至约100天，比如约14天至约80天，约21天至约60天，约25天至约50天，约30天至约40天，约10天，约20天，约25天，约30天，约35天，约40天，约45天，约50天，约60他，约80天或约100天。SALl活性改变，其包括但不限于过表达，也可以以近似的时间推迟开花时间。叶形也受到显著影响，导致叶片厚度比野生型植物厚，并且还更短、更圆，浅裂叶缘更多。观察到的叶片表面有起伏，并且叶柄长度减小，使叶莲座变成卷心菜样外观。叶片表明的起伏增加能增加边界层效应，减少蒸发。代谢组学分析表明，两种突变体都表现出相似的明显代谢重建，包括暗示胁迫抗性的多胺、腐胺的水平增加，和很多未知的可能的渗透保护剂糖衍生物的积累。还提供由本发明的方法获得的植物部位，包括但不限于获得自植物的叶、茎、根、块茎、花、果实和种子。检测SALl或其同源物中突变的方法筛选存在编码SALl或其同源序列至少一个突变等位基因的植物，可以包含使用至少一个适合作为探针或引物的核酸分子分析植物的DNA，所述探针或引物能与SALl基因或其同源物在严紧条件下杂交。在更具体的方法中，筛选方法可以包括使用至少一个适合扩增SALl基因或其同源物的寡核苷酸引物对，其中包含正向引物和反向引物，检测在所述区域中是否存在突变。区域可以包括完整的SALl基因或其同源物，或者可以仅包括其中部分，比如，例如(并参照图10)，包含下述的核苷酸区域外显子3，外显子3和4之间的内含子，外显子5，外显子5和6之间的内含子，外显子6，和外显子6和7之间的内含子，或它们的任何组合。来自待评价客体的DNA可以通过本领域技术人员已知的很多合适的方法提取，比如很多公知文本所述，包括(但不限于)Sambrook，J.等，MolecularCloning，ColdSpringHarborLaboratory(1989),Sambrook,J.禾口Russell，D.W.(2001)，"MolecularCloningALaboratoryManual，，,3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,禾口其中弓|用的文献，禾口Ausubel等(eds)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(2000)，其通过交叉引用并入本文。还参见Lukowitz，W.，Gillmor，C.S.和Scheble，ff-R.(2000)"PositionalCloninginArabidopsis:ffhyItFeelsGoodtoHaveaGenomeInitiativefforkingforYou"PlantPhyiology123，795-805中所述方法，和其中引用的文献。一旦已分离合适的DNA，可以通过本领域已知的任何合适方法分析是否存在突变，并且使用何种方法/策略依赖于期望的特异性，和是否可用合适的序列和/或酶进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析。合适的方法可以涉及在突变特异性探针和至少部分SALl基因或其同源物之间标记的杂交产物，或者更通常地，通过使用引物和合适的探针，或使用用于SALl基因或其同源物的特异性部分扩增的一对引物(正向和反向引物)扩增至少部分SALl基因或其同源物，然后进行扩增DNA的直接部分和/或完全测序，或其RFLP分析。用于扩增SALl基因的部分的合适引物对提供于表1中(还参见图10)-可以根据SEQIDNO:1设计其它合适的引物或引物对用于分析SALl基因或其同源物，所述序列以At5g63980(TAIR序列4010730406，登录号NM_125794.4)或其同源物(参见，例如，图6B)提供。用于PCR扩增反应中的方法和试剂为本领域技术人员所公知。合适的规程和试剂在很大程度上依赖于个体环境。可以从多种来源获得指南，比如例如Sambrook，J.等，MolecularCloning,ColdSpringHarborLaboratory(1989),Sambrook,J.禾口Russell，D.W.(2001),"MolecularCloning:ALaboratoryManual3rdedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,禾口其中弓|用的文献，禾口Ausubel等(eds)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons(2000)，其通过交叉引用并入本文。本领域的技术人员将容易理解的是，可以改变PCR反应的各种参数而不影响扩增期望产物的能力。例如Mg2+浓度和使用的温度可以改变。类似地，用作模板的基因组DNA的量还可以依赖于提供的DNA的量而改变。分析扩增的DNA以确定是否存在突变的其它方法为本领域中技术人员所公知。例如，在用合适的限制性酶消化扩增的DNA以检测SALl基因或其同源物中的突变后，可以通过多种合适的方法包括电泳分析DNA。特别是琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是本领域的技术人员常用的技术，用来根据大小分离DNA片段。凝胶中琼脂糖或聚丙烯酰胺的浓度在很大程度上决定了凝胶的解析能力，并且因此琼脂糖或聚丙烯酰胺的合适的浓度将依赖于待识别的DNA片段的大小。SALl基因或其同源物中突变存在的检测和/或确定可以使用任何合适的软件由计算机分析辅助进行。合适的用于比较已确定核苷酸序列的软件包在本领域中公知，并且容易获得。现在描述本发明的优选形式，仅通过实施例的方式，参照下述实施例，包括可比数据，并且其不应视为以任何方式对本发明的范围或精神的限制。实施例实施例I-材料与方法植物和生长条件用甲磺酸乙酯(EMS)诱变已经用APX2启动子-荧光素酶报告子基因(APX2=LUC)构建体转化的拟南芥种子(Karpinski,S.等(1999)，Science284:654_657)，并且从源自500M1亲本的植物池中筛选M2植物(参见Ball，L.等(2004)，PlantCell16:2448-2462)。如Rossel，J.B.等(2004),MethodsinMolecularBiology274:287_300所述，使用发光计数器为96孔微孔板中每株幼苗发射的光子计数，进行突变体筛选。为了确认改变的APX2表达的重复性，使用冷却CCD照相机(ModelDV435，AndorTechnology，Tokyo，Japan)，将包含APX2=LUC的四周龄拟南芥植物成像。在成像前，用包含几滴Tween80的ImMD-荧光素(BI0SYNTH,Staad,Switzerland)溶液喷洒植物，并保持生长光条件5分钟。使用Image-Pro软件(MediaCybernetics；Carlsbad,CA,USA)分析用CCD照相机获得的图像。鉴别了几株APX2:LUC表达改变的突变体，包括突变体alx8，其中APX2:LUC表达增加，并且还表现出抗旱性提高，以及叶形改变。对于fryl-Ι无效突变的种子保存液，由拟南芥生物资源中心(Columbus，Ohio)获得salk020882插入突变体和野生型(WT)哥伦比亚植物。此处的WT所有参照请参照哥伦比亚生态型；salkl和salk2指来自salk_020882家系种子保存液的T3代的两株相同植物。fryl-Ι突变是在C24野生型背景中发生的，并且是第三次逆代杂交。对于在土壤中的生长，在早期实验中，将一些拟南芥种子洒在盆(4CmX4CmX6Cm)中的无菌土壤(1份蛭石对4份土壤)上，并且在后期实验中，植物在metromix土壤(35%加拿大泥煤苔，19%珍珠岩500，40%蛭石，1.5gL—1石灰)上生长。在4°C，黑暗中保持72至96小时，人工促进种子开花结果。然后将幼苗转移至生长室，在约21+/-2，以100-160微摩尔光子HT2s-1进行12小时光照/12小时黑暗的循环。选择光照较短的循环以促进生长。为了促进开花，在同样的条件下生长植物，但是用16小时光照。使用保鲜膜保持环境湿度，直至幼苗生成。使幼苗稀疏至每盆一株，定位群体除外，其每盆两株生长。用0.5X荷格兰特(Hoaglands)培养基每十四个晚上为植物杀菌一次(Hoaglands和Arnon，1950)。还将底盘从边缘旋转至光源的中心，保持所有植物都具有相似的生长条件。而且，在可能时，将进行相同实验的植物紧挨着在相同的底盘中生长，使它们经历相同的生长条件。对于在组织培养基上发芽的种子，在层流中完成表面杀菌。将种子置于1.5mLEppendorf管中，并用ImL70%乙醇洗涤3分钟。将种子在台式离心机(14，OOOrpm)中旋转30秒，并去除乙醇。在ImL漂白溶液(3%次氯酸钠，75%压0+1滴1^扰11-20清洁剂)中重新悬浮并洗涤种子5分钟。如前旋转种子。进行5个洗涤和离心步骤，每次洗涤使用ImL无菌水，每次旋转后弃去水。在涂布在Murashige和Skoog(MS)(GibcoBRL,USA)植物应用琼脂上之前将种子重新悬浮于无菌水中。MS琼脂由下述组成4.3g/LMS盐、20g/L蔗糖、lmL/L维生素、7g/L植物凝胶，用KOH将pH调至5.8，溶于Mi11iQ处理后的水中。当需要进行筛选时，琼脂中包含抗生素30-50μg/mL卡那霉素(MPBiomedical，Solon，0H，USA)，或30yg/mL潮霉素(GibcoBRL)。用铝箔包被平板，并将平板置于4°C72小时以促进开花，然后放置在21°C的生长柜中，24小时光照，100微摩尔光子HT2iT1,或者在与土壤中植物相同的条件下生长。胁迫条件对于干旱胁迫实验，在正常条件下放置底盘，并在底盘上随机分布生物副本，每两天轮换一次，以控制光密度、温度和空气接触的差异。在处理前一天和t=O天浇灌植物，将过量的水倒出底盘，表明植物在干旱实验开始时相对土壤水含量为100%。每天为每个盆称重，如下计算得到相对水损失％<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>对于低温胁迫，土壤中生长的植物接触24小时低温胁迫(4°C)，使用1微摩尔光子mY1的光照。对于盐胁迫，土壤中生长的植物从下用NaCl溶液浇灌，每两天浇灌一次。培养基上生长的植物的胁迫处理在涂布在包含适当浓度的蔗糖、甘露醇、LiCl,NaCl或甲基紫罗碱的培养基上之前，如常将种子杀菌。然后如常人工促进平板发育和生长。观察对于发芽和幼苗生长的影响。DNA操作拟南芥DNA提取DNA粗提向小量植物组织中加入40μL0.25ΜNaOH。使用黄色P20枪尖研磨样品，直至色素溶入溶液。加热样品至100°C30秒钟，然后加入20μL0.5MTriS-HCl、ρΗ8和0.25%TritonX-100。通过倒置混合样品，然后加热至100°C2分钟。DNA的提取方法本提取方法改编自Weigel禾口Glazebrook,Arabidopsis:alaboratorymanual,(ColdSpringHarborPress,2002)0使用油漆搅拌器和两个玻璃珠，在2mL管中震荡组织和提取缓冲液(220mMTris-HClpH7.5,250mMNaCl，25mMEDTA，0.5%SDS)。如此研磨并裂解组织。然后在微型离心机中用最大速度离心5分钟，并将300μ1上清液转移至1.5mLEppendorf管中。加入300μ1异丙醇沉淀DNA，然后通过以最大速度(Eppendorf离心机)离心5分钟而使DNA成球。弃去上清液，并用70%乙醇洗涤DNA球。然后将DNA溶于100μ1TEdOmMTris-HClpH8.0、ImMEDTA)中。DNA的CTAB提取从每株植物富集少量植物组织，所述组织为叶或花。向每个样品加入300μ1CTAB缓冲液(2%(w/v)溴化十六烷基三甲胺(CTAB)U.4MNaClUOOmMTrisHClpH8.0、20mMEDTA)，伴随使用1/8”滚珠。然后在TissueLyser(Qiagen，Hilden，Germany)以30/秒的频率裂解样品2分钟。然后在65°C培育样品，时间在30分钟和几小时之间。使样品冷却，然后加入300μ1氯仿并剧烈漩涡震荡。在14，OOOrpm旋转样品1分钟，并将上面的水层转移至新的Eppendorf管中。向每个样品加入300μ1异丙醇，并通过倒置几次而混合。以14，OOOrpm将样品旋转5分钟，以成球。倒去上清液，并用500μ170%乙醇洗涤小球。将样品风干，然后溶于100μ1TE缓冲液(IOmMTrisHClρΗ8.0,ImMEDTA)中。针对96孔模式的适应如下改编CTAB提取方法，用于96孔板使用板底座(Qiagen，Hilden，Germany)通过台式4-15°C离心机离心沉淀的DNA，并使用多通道多次分配移液器。PCR扩增和凝胶电泳引物设计除了参照论文之外，可以佳用在TAIR网站(www,arabidopsis.org)上公开的序列禾口Primer3禾呈序(www,frodo.wi.mit.edu/cRi-bin/primer3/primer3www,cri)设计弓I物。使用下述条件设计引物50mM盐浓度；GC含量约50%;最大自互补为8；并且最大3’自互补为3。通常，引物的Tm为55-60°C，并且长约20bp。在NCBI网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)上通过使用BLASTn的“短，接近完全匹配”测试引物结合并扩增其它产物的可能性。用于扩增和测序的引物的实例(正向-F-和反向-R)提供于表1中，并且图10中提供了对SALl基因的大规模描述，其中表示了内含子、外显子、引物杂交位置，以及fryl-3和salk_020882T-DNA插入、fryl-1、fry1-2和alx8突变的位置。表1-用于部分SALl基因扩增的引物<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>对于SSLP绘制，如MonsantoSNP和LerCollections在TAIR网站上公布的，围绕InDels设计引物。在TAIR多态性数据库中还发现了一些多态性。设计引物以产生200-300bp的产物，Tm为57°C。所述区域的序列取自合适的BAC。对于SNP，使用在线程序dCAPSFinder2.0(www,helix,wustl.edu/dcaps/dcaps.html:Neff等，2002)、合适的BAC序列和Primer3设计dCAPS引物。对于alx8突变体特异性的dCAPS引物(其在alx8突变体产物中产生限制性位点，但在野生型中则没有，并且其通过XbaI限制性酶表征)如下F5，-GAGGAAGGGAAAGTAGTTCTAG-3，(SEQIDNO21)；R:5，-TGCACTTTTACAGGAGAAGA-3，(SEQIDNO22)。然后在NraCutterV2.0(www,tools,neb.com/NEBcutter2/index.php；Vinzce等，2003)中模拟测试消化结果。对于重组载体构建，如上设计引物，但是向引物的5’末端加入合适的间隔段和重组位点。弓I—自Proligo(Lismore,Australia)Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)。标准的PCR条件使用标准PCR条件进行构建体的绘制、确认和聚集群落的筛选。所有PCR反应在PeltierThermalCycler(MJResearch,BI0RAD,ffaltham,MA,USA)或Palm-Cycler(CorbettResearch,Sydney,Australia)中进行。在阳性克隆的PCR不产生任何产物或多个产物时，优化扩增条件。在Palm-Cycler上运行有12个不同温度的温度梯度，MgCl2含量从1-2.5mM不等，并且测试了不同Taq聚合酶的优先性。反应液通常包含下述成分0.2mMdNTPUXTaq缓冲液(酌情)、0.5μM每条引物、2mMMgCl2(FisherBiotech,WA,Australia)、1-2μ1样品DNA和0.25UTaq(酌情)。典型的循环条件为94°C2分钟；940C30秒钟，Tm-2°C30秒钟和72°C30秒钟的40个循环；72°C2分钟。高保真PCR条件对于测序和构建体产生，需要非常精确和/或长的PCR产物。在这些情况下，根据生产商的说明，使用校对聚合酶。这些酶是PfuDNA聚合酶(Promega，Madison，WI)，PlatinumPfxTaq聚合酶(Invitrogen，Carlsbad,CA)和Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzyme,Espoo,Finland)。电泳对于核酸分离和定量，用精确分子量标准梯度(BioRad，USA)和IkbDNA梯度(Promega,USA)，在琼脂糖凝胶上跑样。还使用了用HindIII和EcoRI消化的自制λDNA梯度。对于标准PCR，电泳在0.5-2%(w/v)琼脂糖凝胶(FisherBiotech,WA,Australia)中进行，凝胶中包括0.5ng/mL溴化乙啶(Biorad)用于成像。当需要高分辨率时，比如dCAPS分离，用琼脂糖-1000(GibcoBRL，Invitrogen，Rockville，MD，USA)制成3-4%(w/v)凝胶。用IXTBE缓冲液(89mMTris碱、89mM硼酸、2mMEDTA,pH8.0)或IXTAE缓冲液(40mMTris-乙酸、20mMNa2EDTA,pH8.5)制胶并跑样。在传统的电泳设备或超级120高效凝胶系统(6mgel,Biokeystone,EIMonte,CA,USA)中跑胶。对于质粒消化物的分离，将0.7-1.0%凝胶在4°CIOOV跑样6小时。在上样前向PCR产物加入上样缓冲液(70%甘油、30%H20、溴酚蓝)。通过UV光源使凝胶成像。DNA片段的纯化和凝胶提取在用于连接或测序前，从琼脂糖凝胶或PCR混合物中纯化DNA片段。这个过程可去除引物、核苷酸、酶、矿物油、盐、琼脂糖、溴化乙啶和其它杂质。对于70-i0kp的小片段，按照生产商的说明使用Wizardsv凝胶和PCRClean-Up系统或QIAquick凝胶提取试剂盒或PCRClean-Up试剂盒(Qiagen)。总而言之，从凝胶上切下合适的条带，并将其溶于包含异硫氰酸胍的缓冲液中。然后使溶解的凝胶或PCR产物在存在高离液盐的情况下通过包含硅膜的柱。然后洗涤结合DNA的膜，之后将DNA洗脱在无菌dH20中。对于IOObp-IOkbp的DNA片段的凝胶提取，也按照生产商的说明使用Ultrafree-DA离心过滤单元(Millipore)。这个试剂盒与凝胶喷雾器不同，使用凝胶压缩来从琼脂糖提取DNA。然后通过加入1/10体积的3M乙酸钠，加入2.5体积的100%乙醇并在-20°C沉淀DNA3小时而纯化DNA。通过在台式离心机中以最大速度离心15分钟而使DNA成球。用70%乙醇洗涤小球。然后将DNA溶于无菌dH20中。使用QIAEXII试剂盒进行已知大于IOkb的条带的凝胶提取，并且按照生产商的说明使用。这个试剂盒使用硅珠结合DNA，而不是使用硅膜，当较大的DNA片段通过膜时可防止片段发生剪切。MMiSfflnanodrop^jfeT^iSif(GenomicSolutions,Melbourne,Australia)产量定量。定位克隆和互补从alx8(Col-0背景)和野生型Landsbergerecta之间杂交的F2群落提取基因组DNA。使用F2的叶片表型，或野生型F2的后代，确定它们在alx8突变位点的表型。使用由Lukowitz等(Lukowitz,W.，C.S.Gillmor,等(2000)，“PositionalcloninginArabidopsis.Whyitfeelsgoodtohaveagenomeinitiativeworkingforyou，，,PlantPhysiology123(3):795_805)。在Cereon数据库(www,arabidopsis.org)中发现的SSLP和SNP附近设计标记。在dCAPSFinder2.O(http//helix,wustl.edu/dcaps/dcaps.html；Neff等，2002)的帮助下设计dCAPS引物。使用标准方法进行PCR、消化和凝胶电泳。载体操作限制性消化所有酶都来自Promega，并且按照生产商的说明使用，只做了一些修正。为了精细的绘制而使用dCAPS标志进行限制性消化。在这个情况下，用1单位合适的酶在37°C将10μ1消化一小时到过夜。质粒如BACS的限制性消化，在1μgDNA和5单位酶上进行。通过在65°C加热15分钟或在_20°C冷冻而停止消化。去磷酸化按照生产商的说明，使用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP；Promega)将消化的片段去磷酸化。反应重复两次，然后使用提供的终止缓冲液停止。然后通过苯酚氯仿异戊醇(25241)提取液和乙酸钠和100%乙醇沉淀而净化溶液。在70%乙醇中洗涤小球，然后风干，并重新悬浮于无菌水中。载体连接按照生产商的说明，使用T4连接酶连接制备的插入片段和质粒。主要使用插入片段载体DNA为31的比例，其优于11或13比例，并且在4°C过夜进行连接。载体重组对于需要重组的载体，使用高保真条件和包含attB重组序列的引物扩增插入片段。按照生产商的说明，使用Gateway系统(Invitrogen)进行重组反应。总而言之，使用10μ1反应液中的2μ1BP克隆酶，将50fmol合适的插入片段与50fmol载体pDONR/Zeo(Invitrogen)重组，所述载体包含相应的attP重组序列。这可以参照BP反应，并产生attL重组序列。反应在25°C过夜，然后通过与1-2μg蛋白酶K在37°C孵育10分钟而停止。在转化进感受态大肠杆菌并在筛选条件系孵育后，纯化质粒并确认插入片段。然后在LR反应中使分离的质粒与目的载体重组。目的载体，比如pHellsGate8(pHG8；由PeterWaterhouse和ChrisHelliwell,PI,CSIRO捐赠)，包含attR重组序列。然后将这些与包含插入片段的供体质粒中的attL位点重组，再次得到SttB序列。LR反应与BP反应相同，但是需要LR克隆酶。再次将相同摩尔数的pDONR-插入片段和pHG8过夜重组，得到pHG8_插入片段。然后使用这个质粒转化大肠杆菌，在筛选条件下扩增，分离并确认。感受态大肠杆菌为了产生感受态大肠杆菌，用5μ1DH5a细胞接种5mLLB，并在37°C以适度的震荡(200rpm)过夜培养。然后使用这个起始培养物接种200mLLB，其于37°C以适度震荡培养3-4小时，直至培养物的0D600为0.6。然后在冰上孵育培养物30分钟，之后以约3，OOOg在4°C离心20分钟使其成球。将小球重新悬浮于200mL冰冷的水中，然后再次以相同的条件成球。这个循环再重复两次，其中最后一次重新悬浮于20mL冰冷的10%甘油中。再次在4°C将细胞成球，但是为2，OOOg10分钟，并且重新悬浮于ImL冰冷的10%甘油中。然后将这个重新悬浮液稀释于50μL等分试样中，其在液氮中急速冷冻，并保存于-80°C。大肠杆菌转化对于较难的转化，使用商业感受态细胞，OneShotOmniMAXTM-TlR化学感受态大肠杆菌(Invitrogen)。将100μ1细胞在冰上解冻，并加入IOOng连接混合物。然后将细胞置于冰上30分钟，之后在42°C热击30秒钟。然后将细胞放回冰上2分钟，之后加入提供的250μ1SOC培养基。然后在37°C震荡回收细胞1-2小时。对于大多数转化，使用自制的感受态细胞。将100μL感受态细胞在冰上解冻，并加入IOOng质粒DNA，用移液器枪尖混合。然后在液氮中将细胞急冻，之后在37°C水浴中培育五分钟。然后向细胞中加入ImLLB，并在37°C震荡培养1-2分钟。然后将两个不同体积的细胞涂布在合适的选择性培养基上并在37°C过夜培养。细菌生长和甘油储备(glycerolstock)所有细菌液体培养物都在Luria-Bertani(LB)培养基中生长，所述培养基由下述组成10g/L细菌用胰蛋白胨(BactoLaboratories，Australia)，5g/L酵母提取物(BactoLaboratories)和5g/LNaCl的MilliQ处理的水溶液。如果需要LB琼脂，向肉汤中加入15g/L琼脂(LenerDavisGelatin，Australia)。所有培养基在使用前通过高压而灭菌。以下述浓度使用抗生素100μg/mL壮观霉素(Sigma)，100μg/mL氨苄青霉素(Sigma)和150μg/mL利福平(Sigma)，30-50μg/mL卡那霉素(MPBiomedical,Solon,OH,USA),50g/mL§iMM(zeomycin)(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。)(寸f霉素筛选，使用低盐LB:10g/L细菌用胰蛋白胨(BactoLaboratories，Australia)，5g/L酵母提取物(BactoLaboratories)和5g/LNaCl的MilliQ处理的水溶液。对于蓝-白筛选，平板还包含0.5mMIPTG(异丙基-b-硫代半乳糖苷；FisherBiotech)和80μg/mLX-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷；ProgenBioscience,QLD,Australia)。大肠杆菌的液体培养物在37°C震荡过夜培养，大肠杆菌的平板在37°C过夜培养，农杆菌的平板在28°C培养几天，并且农杆菌的液体培养物在28°C震荡培养16-20小时。细菌培养物的甘油储备通过将700μL的培养物与700μL甘油溶液(65%甘油ν/v、0.IMMgS04、0.025MTris-Cl,ρΗ8)相混合而得到。随后将储备保存在-800C0菌落PCR进行菌落PCR，筛选存在质粒和插入片段的菌落。PCR条件与平常一样，但是每个反应的体积为20μ1，并且使用移液器枪尖将少量细胞从菌落转移至PCR。质粒分离对于大多数应用，使用GeneEluteTM质粒小提试剂盒(Sigma)从3_5mL液体培养物分离质粒，所述培养物来自单菌落或甘油储备的过夜生长。总而言之，使细胞成球并使用修正的碱-SDS裂解方法裂解。然后在存在高盐的情况下将质粒DNA吸附至硅膜上。然后洗涤膜，之后用无菌dH20洗脱质粒DNA。对于需要大量质粒的应用，比如BACDNA的制备，使用大规模碱裂解规程。这个操作规程基于获得自NIH细胞和分子调控实验室(Bethesda，MA,USA)的规程。将包含筛选物的500mL培养物在37°C和200rpm过夜生长。然后在4°C6000g离心15分钟使250mL细胞成球，弃去上清液，将瓶置于冰上。然后将细胞悬浮于20mL室温的IOmMEDTA，pH8.0中，并置于室温5分钟。然后加入40mL裂解溶液(0.2MNaOH,1%SDS)，并将瓶置于室温5分钟。然后加入30mL冰冷的中和溶液(11.5%(体积比)乙酸，1.9M乙酸钾)，，并将瓶置于冰上15分钟。然后在4°C30，OOOg离心20分钟使细胞碎片成球。将上清液移至新瓶并重复上述过程。然后通过加入45mL异丙醇使DNA从上清液沉淀出来，并在6，500g离心15分钟使其成球。然后将小球溶于9mLIOmMtris/50mMEDTA中并加入4.5mL7.5M乙酸钾。然后在_70°C冷冻溶液30分钟，解冻并在4，OOOg离心10分钟。然后通过加入27mL100%乙醇而沉淀DNA，并在4，OOOg离心10分钟而使DNA成球。然后将小球溶于700μL50mMTris/50mMEDTA，pH8.0中，并加入10μL的lOng/μLRNAse。然后在37°C培育样品1小时，使RNA分解。然后通过加入700μ1苯酚氯仿异戊醇(25241)，混合并在微型离心机中以14，OOOrpm离心5分钟而净化样品。然后再次在700μ1氯仿异戊醇中净化顶层。然后通过加入700μ1异丙醇而将DNA从顶层沉淀出来，并通过在14，OOOrpm离心20分钟而使DNA成球。去除上清液并用500μ70%乙醇洗涤小球，并在14，OOOrpm旋转10分钟。再次去除上清液，并风干小球，然后重新悬浮于100μ1无菌H2O中。消化物判断为了确认质粒和是否存在插入片段，过夜消化分离的质粒并在琼脂糖凝胶上跑样。使用NEBEutterV2.0(www,tools,neb.com/NEBcutter2/index,php；NewEnglandBiolabs)鉴别条带的期望模式。感受态农杆菌由在28°C过夜生长的500mL培养物产生感受态根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)。然后将250mL培养物在冰上冷藏，并在4°C以3，OOOg离心5分钟而成球。将小球重新悬浮于ImL冰冷的20mMCaCl2中，并分成0.ImL等分试样，然后在液氮中冷冻并于-80°C保存。农杆菌转化用分离的质粒转化自制的感受态根癌农杆菌细胞。将100μ1感受态细胞在冰上解冻，并加入Iyg质粒。然后在37°C热击细胞5分钟，然后加入ImL液体LB。在28°C震荡回收细胞2-4小时。包括无任何质粒的感受态农杆菌细胞阴性对照。然后将细胞涂布在LB琼脂平板上，平板包含用于筛选质粒的卡那霉素(50yg/mL)；和用于筛选农杆菌的利福平(100μg/mL)和庆大霉素(25μg/mL)。然后在28°C培养平板2_3天或直至菌落出现。通过菌落PCR，使用插入片段的特异性引物筛选包含插入片段的菌落。这些菌落还用于接种于包含筛选物(50μg/mL卡那霉素，100μg/mL利福平，25μg/mL庆大霉素)的5mL液体LB发酵剂。培养物在28°C过夜震荡生长。拟南芥转化待转化的拟南芥在土壤上生长，并修剪第一个开花的花苞，以促进多个二次花苞出现。当有很多花丛时将植物浸湿并剪去任何已发育的果实。然后使用来自Clough和Bent(1998)的规程的修正规程转化拟南芥。使用包含筛选物的5mL发酵剂接种500mL液体LB。然后在28°C震荡过夜生长。在RC5CPlus离心机(Sorvall)中使用SLA-3000转头，以4，OOOrpm在室温离心20分钟，使500mL培养物成球。然后将小球重新悬浮于500mL5%(w/v)蔗糖溶液中。然后加入清洁剂SilwetL-77(lehleSeeds,RoundRock,TX,USA)至终浓度0.05%(体积比)。将花浸入溶液中5-10秒钟，伴有温和搅拌，然后平放在保鲜膜下的底盘中保湿。第二天静置植物，并在一周后重复所述过程。种子放置两周后，将植物转移至黑暗的干燥柜中干燥种子。将种子置于筛选剂上分离转化体，然后将其转移至土壤上。测序将DNA片段或质粒与合适的引物一起送至BiomolecularResourceFacility(JCSMR,ANU,Canberra)或AustralianGenomicResourceFacility(UQ,Queensland)测序。或者，在20μL测序反应液中制备DNA，所述反应液由下述组成0.5μM引物，IX缓冲液，2yLDNA和1.5yLBigDye。如下进行反应96°C2分钟和下述共40个循环96°C5秒钟，50°C15秒钟，60°C3.5分钟。然后使用EDTA纯化方法纯化PCR产物。加入5μL0.125ΜEDTA和60μL室温100%乙醇至20μL。混合样品并覆盖锡箔纸在室温静置沉淀40分钟。然后以最大速度离心20分钟，使标记的DNA成球，并用70%乙醇洗涤，之后再次离心5分钟。去除上清液，并使用Speedi-Vac干燥小球。然后将样品送给Yang测序。热不对称互动式(Tail)-PCR改编了来自(LiuY-G,MitsukawaN,OosumiT和Whittler，RF(1995)“EfficientisolationandmappingofArabidopsisthalianaT-DNAinsertjunctionsbythermalasymmetricinterlacedPCR",ThePlantJournal8:457_463)的操作规程。如Liu等1995所述，顺序使用三个对T-DNA插入片段左边界特异性的引物(LBal-5’-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3'(SEQIDNO23)；LBb1-5‘-GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3‘(SEQIDNO24)；和LBc1-5'-GGACTCTTGTTCCAAACTGG-3'(SEQIDNO25))和随机简并引物，AD2(5，-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3’，128倍简并，其将结合至拟南芥序列中)，进行了一系列三个PCR反应。第一次的反应液为2(^1^，包含1\0缓冲液，20(^]每种(1^13，21111MgCl2,0.2μMLBal,3yMAD2,0.8UFlTaq和约20ng基因组DNA。每个样品进行两次平行反应，一个稀释50倍以进行下一次PCR，另一个保留以在最后的凝胶上跑样。第二次的反应液为20μL。包含1父？0缓冲液，20(^]\1每种(1^13，211111%(12，0.2μΜLBcl,2yMAD2,0.6UFlTaq和1μL来自第一次反应的稀释PCR产物。每个样品进行两次平行反应，一个稀释10倍以进行下一次PCR，另一个保留以在最后的凝胶上跑样。第三次反应为100μL，并且除了使用第三条LB特异性引物和AD2之外，条件和第二次反应相同。通过琼脂糖凝胶电泳分析所有扩增产物。通过第二次和第三次反应中条带之间的大小差异鉴别插入特异性产物。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从凝胶上切下合适的条带并测序(AGRF,Brisbane,Australia)。SALl蛋白质分析为了产生重组SALl蛋白质，使用PlantRNeasyKit，用柱上DNAse消化步骤(Qiagen，www.qiagen.org)从Col_0和alx8叶片提取总RNA，并按照生产商的说明用于第一链cDNA合成(SuperScriptII,Invitrogen,www,invitrogen.com)。从克隆的Col-0禾口alx8SALlcDNA,用弓I物SacII-SALlFl(5，-ctccgcggtggtatggcttacgagaaagagc-3，)(SEQIDNO26)和EcoRI-SALl(5，-gctcgaattctcagagagctgaagctttctc-3，)(SEQIDNO:27)，扩增完整的SALl编码序列，然后克隆进pHUE载体(Baker等，2005)。在用ImMIPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen,www,emdbiosciences.com)中表达重组蛋白质，并使用His-结合树脂，根据生产商(Novagen)的说明通过亲和色谱纯化。通过酶裂解回收无标签的真正SALl蛋白质，并测定对于磷酸腺苷5’磷酸酯(PAP)的磷酸酶活性(Murguia等，(1995)，Science267，232-234)，并通过免疫亲和纯化从接种的兔血清IgG部分分离抗SALl多克隆抗体(IMVS，Adelaide)。对于western印迹，将20μg叶片蛋白质提取物溶于梯度凝胶中，电转移至硝酸纤维素膜，并用11，000稀释的针对重组SALl蛋白质的纯化单克隆抗体进行检测。在用0.05%(体积百分比)TweenPBS洗涤后，用110，000稀释的HRP-结合羊抗兔IgG孵育印迹，并使用SuperSignalWestFemtoChemilumiscent检测试剂盒(Pierce)展开。基因表达分析处理RNA时的注意事项因为环境中存在大量RNAse酶，所以要注意很多事情以避免RNA发生降解。在处理RNA时始终戴手套，并且尽可能在干净的环境中谨慎操作。样品保持置于冰上，于-80°C保存，并限制冻融次数。无RNAse的水可以购买或通过用0.2%(体积百分比)焦磷酸二乙酯(DEPC，Sigma)处理MilliQH20而产生。在使用前，用DEPC处理的水过夜搅拌，然后高压灭菌，以破环任何残余的DEPC。玻璃容器在180°C过夜烘焙，塑料容器在稀释的H2O2中过夜浸泡，然后用DEPC处理过的水冲洗几次。RNA提取使用PlantRNeasy试剂盒(Qiagen，Germany)提取RNA。总而言之，使用无菌微型杵将不超过IOOmg的冷冻组织研磨成粉末。裂解样品并在提供的包含异硫氰酸胍(GITC)的缓冲液中变性，所述缓冲液也可使任何RNAse失活。然后将样品应用于QIAshredder，去除不溶材料并剪切基因组DNA。洗脱液与100%乙醇混合，沉淀RNA，并使混合物通过RNeasy微型柱，RNA在其中结合硅凝胶膜。洗涤膜并用无RNAse的DNAseI(Qiagen)处理约20分钟，并在用无RNAseH2O洗脱RNA前再次洗涤。RNA沉淀为了浓缩并纯化RNA，使用了分子生物学(Ausubel等，1998)中当前的规程。概述之，向RNA加入1/10体积的乙酸钠，pH5.2。将样品短暂漩涡震荡而混合，然后加入2.5体积的冰冷的100%乙醇。再次通过漩涡震荡混合样品，并置于-20°C30分钟以促进RNA沉淀。然后在台式离心机中以最大速度离心5分钟而使RNA成球。去除上清液，并用70%乙醇洗涤小球，然后再次离心。去除上清液，并在Speedi-Vac中以中热干燥RNA5分钟，然后溶于无RNAse的H2O中。eDNA合成根据获得自ChristianDelessert(PlantIndustry,CSIRO,Canberra,Australia)的规程进行cDNA合成。向IygDNA中加入1μgT23V引物，并在70°C孵育10分钟，使引物结合。然后反应液由下述组成30yL:lX合适的缓冲液，IOmM二硫苏糖醇，0.17mM无RNAse的dNTP(Invitrogen)，100单位的SuperScriptII(Invitrogen)和无RNAse的H2O至30μL。然后在45°C孵育反应物2小时，并在无菌milliQH2O中稀释至200μL0然后准备cDNA进行实时RT-PCR分析。实时RT-PCR使用实时反转录聚合酶链式反应(实时RT-PCR)测定转录本丰度。引物设计使用Primer3禾呈序(www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)，用下述条件设计用于实时RT-PCR的合适的引物产物大小约250bp熔融温度(Tm)约60°CGC含量约50%最大自互补为4最大3’自互补为3使用的基因序列为拼接的cDNA序列，获得自TAIR(www,arabidopsis.org)。可能时，设计引物使其位于内含子的任一边，以检测DNA的污染。通过“Blastn”，在国家生物技术中心网站(NCBI，http//www,ncbi.nlm.nih.gov/)上搜索，检查引物的特异性。所有引物都订购自Proligo(Australia)。使用的一些引物的实例在(Rossel,J.B.，P.B.Walter等(2006),Plant,CellandEnvironment29(2):269_281)中给出。使用的其它引物的实例包括APX2(At3g09640)，5，-GGCTGGGACATTTGATGTG-3，(SEQIDNO28)禾口5，-AGGGAACAGCTCCTTGATAGG-3’(SEQIDNO29)；APXl(Atlg07890)，5，-CCACTCGCATTTCTCCAGAT-3，(SEQIDNO30)禾口5’-TCGAAAGTTCCAGCAGAGTG-3，(SEQIDNO31)；sHSP(At2g29500)，5，-CCTGGATTGAAGAAGGAGGAAG-3，(SEQIDNO32)和5，-TAGGCACCGTAACAGTCAACAC-3，(SEQIDNO33)；ZAT10(Atlg27730)，5，-AGGCTCTTACATCACCAAGATTAG-3，(SEQIDNO34)和5，-TACACTTGTAGCTCAACTTCTCCA-3’(SEQIDNO35)；亲环蛋白(At2g29960)，5，-TCTTCCTCTTCGGAGCCATA-3，(SEQIDNO36)禾口5’-AAGCTGGGAATGATTCGATG-3’(SEQIDNO37)；DREB2A(At5g05410)，5，-AGACTATGGTTGGCCCAATG-3，(SEQIDNO38)禾口5，-TCGAGCTGAAACGGAGGTAT-3，(SEQIDNO39)；HSP70(At3g09440)，5，-GCTGCTATTGCTTACGGTCTTG-3，(SEQIDNO40)和5，-CTCTCGGGTTTCCACTAATGTC-3‘(SEQIDNO:41)。为了检查引物的精确度和有效性，用100、25、5和IngcDNA制作标准曲线。每个浓度重复两次。通过Rotorgene5程序自动生成R2值、反应效率和熔融曲线。对于精确的引物，R2值必须>0.99，反应效率必须>95%，并且熔融曲线必须说明只扩增一个产物。只有在这些条件都满足时，这些引物才可用于实时RT-PCR。实时RT-PCR过程建立在Rotor-Gene2000或Rotor-Gene3000(CorbettResearch,Australia)中进行实时RT-PCR反应。在某些情况下，每个cDNA样品重复三次实验。或者，重复两次反转录，并且每个反转录有两次技术重复，所以每个RNA样品有四个重复。用针对目的基因和针对“管家”基因的引物测试每个样品。在相对于管家基因(其表达不改变)进行各种处理后，实时RT-PCR可以定量具体组织中的mRNA丰度。这可以如下进行通过测定转录本中荧光染料SYBR绿的合并而测定转录本经过重复循环后的扩增速率。这种染料可以结合所有dsDNA分子，并且在结合时仅发出荧光信号。为了进行反应，按照生产商的说明使用SYBRGreenJumpStartTMTaqReadyMixTM(SigmaAldrich)RocheLightCycler4800SYBRMaster(Roche,Basel,Switzerland)。对于Sigma产品，混合物包含IOmMTris-HCl,ρΗ8.3,50mMKC1,3.5mMMgCl2,0.2mM每种dNTP，0.25单位TaqDNA聚合酶，JumpStartTaq抗体和SYBR绿I。对于Roche产品，混合物的内容物未公开。通常1(^1^反应液包含25叫cDNA，0.2μM每条引物和0.9ΧMaster混合物。典型的循环条件如下950C2分钟(TaqDNA聚合酶的初始活化)循环重复45次95°C15秒钟(变性)，55°C30秒钟(引物结合)，72°C30秒钟(延长和荧光读数)和80°C15秒钟(荧光读数)600C2分钟(最后的延迟步骤)通过升至99°C，每5秒钟增加1°C，从而进行熔融曲线分析。分析使用Rotor-Gene5程序(CorbettResearch)分析实时RT-PCR结果。对于每次反应，查看熔融曲线，确保每组引物产生单一的产物，并且产物进行了有效扩增。用于实时RT-PCR的分析方法如前所述(Rossel,J.B.，P.B.Walter等(2006)，Plant,CellandEnvironment29(2)269-281；Pfaff1,Μ.W.(2001),"Anewmathematicalmodelforrelativequantificationinreal-timeRT-PCR，，，NucleicAcidsResearch29(9))。对于可比的Ct方法，将扩增反应的阈值设定为所有样品以指数速率扩增的点。阈值循环(Ct)值是特定样品达到阈值而进行的循环数，其中每个样品的荧光量相同，并且从而dsRNA量相同。然后将这些Ct值转化成Excel(Microsoft，USA)。删除每组三个重复中Ct值相差超过0.5的异常值。然后通过在某个时间点和条件比较目的基因的表达和相同时间和条件的管家基因的表达，将得到的数据集归一化。这可以通过从目的基因三个重复的每个Ct值减去该样品中管家基因的平均Ct值而得到ACt=Ct(目的基因)_平均Ct(管家基因)然后将这些数值与对照样品比较，通常t=0。这可以通过从每个样品值剪去对照值而得到ΔACt。ΔΔCt=ΔCt(目的基因)-ΔCt(对照)然后使用这些数值，用公式2-ΔACt计算绝对值。结果是，对照值成为1，并且所有其它样品给出相对于对照值的数值。对于可比定量方法，将程序分析的样品与用户确定的对照样品比较，通常t=0。然后使用下述公式计算可比浓度可比浓度=扩增(对照takeoff-本样品takeoff)使用随循环增加的荧光速率而计算takeoff值。最大速率为峰值速率，并且takeoff速率是峰值速率的80%以下。Takeoff值是当反应到达takeoff速率时已进行的循环数。扩增是对于特定引物组，所有样品的评价扩增效率。可以以到达take-off点后四个循环中荧光增加的平均倍数而计算。理想地，这个数值在反应的指数期为2。对每个引物组，给出了平均扩增效率和置信区间，并且置信区间值增加，说明样品之间波动更大。然后将每个引物源自计算机的可比浓度输出至Excel，并针对管家基因归一化。这导致表达量相对于对照的百分比或倍数改变。使用Excel功能计算每组平行实验的标准偏差。然后使用Excel将结果绘成柱状图。适当的时候，将多个生物副本的结果平均，并使用STDEVPA功能计算实验间的标准偏差，其根据全群落确定标准偏差作为参数。Northern印迹使用Northern印迹研究基因表达的程度和是否出现拼接变体。使用RNeasy试剂盒，如上进行RNA提取，每个生物副本仅使用三个QIAShredder柱，并且通过一个RNeasy柱洗脱，使得到的洗脱液浓度最大。然后如上将每个样品的20μgRNA沉淀，并重新悬浮于5μL无RNAse的水中。用浓缩的RNA在无RNAse的条件中进行凝胶电泳。通过在125mLDEPC处理的H2O中使2.25g琼脂糖熔化而制胶。冷却混合物，然后加入15mL10XMOPS(0.4MM0PS，0.IM乙酸钠，0.OlMEDTA)，7.5mL甲醛和2μL溴化乙啶(EtBr)。将凝胶置于正常凝胶电泳槽中，然后用加入1μL/IOOmLEtBr的1XMOPS平衡。向每20μgRNA中加入9yL甲醛、25yL甲酰胺和4.2yL10XM0PSo然后将样品漩涡震荡而混合，并在55°C加热使RNA变性。在向凝胶上样前，向每个样品加入0.5μLEtBr和2μL上样缓冲液(ImMEDTAρΗ8.0，50%甘油，2.5mg/mL溴酚蓝，2.5mg/mL二甲苯蓝)。以100V跑胶几小时，直至染料沿凝胶移动2/3。然后在UV照射下快速给RNA照相，查看RNA的质量和数量。通过用20XSCC过夜重力印迹，将RNA转移至尼龙膜(Hybond-N，AmershamBiosciences,Buckinghamshire,UK)。然后用保鲜膜将尼龙膜包起来，并通过UV以1200V照射而将RNA固定于膜上。然后在黑暗中保存膜备用。通过使用引物Fryl-IF(5，-AACCCATTTTGTAAATCTTCC-3，)(SEQIDNO42)和Fryl-rt2R(5，-CAGAGAAACAAAGAACGTACGAGA-3，)(SEQIDNO43)和40μL反应液，从Col-0WTcDNA扩增SALl而产生探针。在凝胶上将PCR产物跑样，并使用凝胶提取试剂盒纯化。然后使用Prime-a-gene标记系统(Promega)，按照生产商的说明，用放射性α32P_dCTP标记探针。如(RosselJ.B.,WilsonI.W禾口PogsonB.J.(2002),“GlobalchangesingeneexpressioninresponsetohighlightinArabidopsis",PlantPhysiol.130:1109_1120)中所述进行过程。微阵列使用RNeasy试剂盒如上提取RNA用于微阵列。然后使用Nanodrop分光光度计测定RNA的浓度和纯度。还通过3ygRNA的凝胶电泳检查RNA的数量。概述之，通过在1XMOPS缓冲液中融化高保真琼脂糖-1000而制成1%凝胶。在55°C冷却混合物，然后加入温的甲醛至终浓度18%(体积百分比)并倒入凝胶槽中。凝固后用1XM0PS跑样缓冲液平衡凝胶。将IOyL的RNA与20μL上样缓冲液(52%甲酰胺，1XM0PS，17%甲醛，7%甘油，0.02mg/mLEtBr,少许溴酚蓝)，在70°C加热5分钟，然后在冰上冷却2分钟。然后在凝胶中在90V跑样几小时，直至染料走过凝胶长度的2/3。如果需要更浓的RNA，以中热在Speedi-Vac中短时间降低体积。也在RNA6000NanoLabChip上，根据生产商的说明，使用Agilent2100Bioanalyser系统(SantaClara,CA,USA)测试RNA的质量和数量。这个系统由通过毛细管中凝胶基质上电泳的RNA分子大小而分离RNA分子。在不同的管中跑样之前加热使每个样品和梯度变性。凝胶基质中的插入染料可以标记RNA，并在通过毛细管时读出数量和重量。一旦确认了RNA的质量，使用生产商试剂盒和说明制备RNA用于AffymetrixGeneChip表达分析系统(SantaClara,CA,USA)中。概述之，使用T7_01igo(dT)引物和SuperscriptII，将5ygRNA反转录，称为第一链合成。这使RNA结合在互补的DNA链上。然后合成cDNA的第二链，替代第二链合成中的RNA。这个合成使用RNAseH去除RNA，然后使用T4DNA聚合酶如DNA—样重建第二链。然后通过使用cDNA结合柱而从cDNA去除反应组分，所述柱经过洗涤、干燥并洗脱cDNA。然后使用体外转录(IVT)过程，从cDNA扩增用生物素标记的cRNA。这个过程使用生物素化核苷酸类似物/核苷酸混合物和T7RNA聚合酶。然后使用可以结合cRNA的柱纯化cRNA，并允许少量等分试样通过Bioanalyser，确认产物的质量和数量。也通过nanodrop分光光度计定量用生物素标记的cRNA，并确认纯度。由于初始样品中使用总RNA，针对存在的未标记RNA而调整产量。使用下述公式进行调整的cRNA产量=RNAm-总RNAi其中RNAm是在IVT反应和净化后测得的cRNA的量(μg)，并且总RNAi是RNA的初始起始量(μg)。然后通过Mg2+离子诱导的水解，将20μgcRNA分解成35_200bp的片段。在Bioanalyser中允许少量等分试样通过，确认发生了分解。为了确认RNA的质量，然后将来自一个样品的少量片段化cRNA与TeStArray3杂交。过程与针对ATHl芯片的过程相同。对于ATHlGeneChipJf15μg片段化cRNA的每个样品在45°C过夜(16小时)旋转杂交。然后使用FluidicsSatation400，用非严紧洗涤方式洗涤GeneChip。然后用链霉亲和素藻红蛋白(SAPE)将GeneChip染色，SAPE可与生物素标记的cRNA结合。然后通过加入可以结合SAPE的一抗而放大信号。然后加入可以结合一抗的生物素化二抗，并最后加入可以结合二抗的SAPE。藻红蛋白在570nm发荧光，所以在这个波长扫描GeneChip。然后分析结果。在上述步骤中加入很多对照。在第一链合成过程中加入四个polyARNA对照，以确保有效产生标记的cRNA。这些对照来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的四个基因，其不存在于真核细胞中。还以不同浓度加入，以确保过程对于低、中和高丰度转录本有效。在阵列的最终分析中，这些基因的强度读数应与它们的初始浓度成线性关系。在杂交前向片段化cRNA加入一组杂交对照。这些也以一定浓度范围加入，确保杂交和信号强度成线性关系。一些对照来自大肠杆菌，并且还有一个对照来自Pi噬菌体。最后，还向杂交混合物中加入生物素化B2寡核苷酸。这些可以以交错的方式结合在阵列外部附近，允许自动对其格线来鉴别探针组。如前所述(Rossel等(2007)，ThePlantCell,10.1105/tpc.1106.045898)进行分析，包括MAS5归一化，统计学分析和错误发现改正率。形态和生理学测量叶片测量使用订制的热电偶干湿计测量总水势(Morgan，(1991)，AustralianJournalofPlantPhysiology，18，249-257)。将叶盘在22°C置于平衡室中4小时。将珀尔帖冷却电流通过热电偶并在微伏计(HR33DewPoint,Wescor,www.wescor.com/environmental)中根据指针的偏向读出电动势(emf)。通过将emf插入标准曲线而计算叶片水势(MPa)。使用压力盘设备测定土壤水势(Klute(1986),MethodsofSoilAnalysis,Part!,PhysicalandMineralogicalMethods-AgronomyMonographno.9(Klute,A.，ed.Madison,WI,USAAmericanSocietyofAgronomy-SoilScienceSocietyofAmerica，pp.635-662)0还对叶片样品进行了多种生理学测量。记录叶片的厚度和表面积。在早期实验中，通过记录鲜重，在纸袋中在60°C干燥3天，然后记录干重，从而测量叶片样品的相对水含量。然后使用下式计算它们的相对水含量(RWC)RffC(%)=(Fff-Dff)/Fff在后期实验中，从相同的植物切下莲座叶，记录鲜重(Fw)并在4°C在水中黑暗培养至少4小时。印迹叶片并测定膨胀重量(Dw)。如(Jones,(2007),JournalofExperimentalBotany,58,119-130)计算相对水含量RffC=(Fw-Dw)/(Tw-Dw)气体交换在白昼光照生长12小时的植物上进行气体交换测定，促进生长并因此得到较大的叶片。唯一的例外是在干旱实验中的植物，其在白昼生长16小时。用Li-6400(Li-Cor，Lincoln,NE,USA)，按照生产商的说明进行气体交换。这个设备使叶片附着于植物上，植物固定在腔室中，并测定多个参数。在腔室中，可以控制光强度、波谱、温度、湿度和C02浓度。通过比较进入腔室的和离开腔室的C02和水蒸气量，可以推断光合作用的量和气孔的通透性。通过改变条件如光强度和C02浓度，我们能看到气孔如何通过安排叶片的平均导度而作出响应。腔室为2cm2，所以如果拟南芥叶片不完全覆盖这个区域，则导度将针对腔室内部的叶片区域而调整。高效液相色谱(HPLC)通过HPLC分析叶片材料的类胡萝卜素谱。总而言之，在500yL丙酮/乙酸乙酯的60/40(体积百分比)混合物中研磨叶片材料。用400yLdH20稀释，并在台式离心机中以最大速度离心3分钟。分级提取类胡萝卜素，并如(Pogson，B.J.，Niyogi，K.K.，Bjorkman,0.禾口DelIaPerma，D.(1998),"AlteredxanthophyllscompositionsadverselyaffectchlorophyllaccumulationandnonphotochemicalquenchinginArabidopsismutants，，，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9513324-13329)所述使用AgilentHPLC和光电二极管阵列检测器分析。通过与标准品比较波谱和保留时间而鉴别类胡萝卜素，并使用极性消光系数记录峰面积用于定量。C-13测量叶片组织中13C的量可以指示植物生命过程中的平均气孔大小，因为当气孔打开时，将更倾向于12C而不是13C。称重叶片样品，得到鲜重，并于60°C在纸袋中干燥3天。然后使用研钵和杵研磨干燥样品，并使用粉末测定样品中12C对13C的比例。叶绿素含量通过测定光吸收而测量总叶绿素含量，其中在647nm处测量叶绿素a，在663nm处测量叶绿素b。为了提取叶绿素，用滚珠和700μL提取缓冲液(80%丙酮，2.5mM磷酸钠缓冲液pH7.8)在组织研磨仪中研磨10-20μg叶片组织。然后在台式离心机中以最大速度将样品离心5分钟。然后在647nm、663nm和750nm处测量提取物的吸收值。在750nm处的吸收是背景吸收，因此从647nm和663nm处的吸收值减去背景吸收值。为了计算总叶绿素含量，使用下述等式总叶绿素<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>花青素含量由530nm处的吸收值测定总花青素含量。在组织研磨仪中使用滚珠在300μL酸化的乙醇(1%HC1)中研磨约30mg组织。为了提取花青素，加入250yL氯仿和200yLMilliQH2O并漩涡震荡。然后在台式离心机中以最大速度将混合物离心5分钟。然后去除200yL水相并在530nm和657nm处的吸收值。使用96孔板在读板仪中或在单独的比色杯中测定吸收值。然后通过从530nm处的吸收值减去样品雾化产生的吸收值(657nm处)而计算花青素的吸收值。通过下述等式测定花青素的浓度C=A/εLX体积/1000XMWX1/重量XDX106其中C是浓度(μg/g)；A是吸收值；ε为269000，对于最丰富的花青素即矢车菊素-3-葡萄糖苷是常数；L是比色杯的通路长度；体积是提取物的总体积(mL)；丽是449，矢车菊素-3-葡萄糖苷的分子量；重量是初始的样品重量(g)；并且D是稀释因子(如果使用的话)。抗坏血酸实验测定冷冻叶片组织的抗坏血酸含量和抗坏血酸池的氧化还原状态。使用研钵和杵在液氮中研磨组织，然后称出约50mg粉末放在冷冻的1.5mLEppendorf管中。加入四倍体积的提取缓冲液(2%w/v偏磷酸的milliQH2O溶液；SigmaUltra，SigmaAldrich,St.Louis,MT,USA)，并将样品漩涡震荡以彻底混合。然后在台式离心机中以最大速度(16.Ixg)将样品在4°C离心4分钟。然后向485μL实验缓冲液(67.5mMKH2PO4,32.9mMK2HPO4,1.27mMEDTA)中加入50μL提取物，并轻拍以混合。然后通过在265nm和415nm处的吸收值测定还原的抗坏血酸含量。然后通过加入33.3U抗坏血酸氧化酶的实验缓冲液(5μL6.67υ/μL,CalzymeLaboratories,SanLuisObispo,CA,USA)WMMW^Mi^M.酸池，并测定吸收值。用5yL0.2M二硫苏糖醇的实验缓冲液溶液将另一个样品还原20分钟，并测量吸收值。使用合适的空白。还计算了提取物的总体积。为了确定存在的抗坏血酸的量，将265nm处的吸收值针对背景吸收和在415nm处的吸收值归一化。这样得到的抗坏血酸浓度能用来计算mg/100gFW组织。可以用初始样品浓度减去氧化的样品浓度计算还原的抗坏血酸池的量。可以用还原的样品浓度减去氧化的样品浓度测量存在的抗坏血酸的总量。氧自由基吸收能力(ORAC)实验ORAC实验测量物质的抗氧化能力，并且广泛用于确定食品的抗氧化能力。对于拟南芥，测试植物材料的提取物。这个提取物可以是膜结合的；来自质膜、叶绿体类囊体和其它内膜上；或者可溶；来自胞液、液泡、叶绿体气孔等。实验测量抗氧化敏感荧光分子藻红蛋白(R-PE;Sigma)的荧光。向R-PE加入自由基产生剂AAPH(Sapphire，BioScience)，结果使荧光缓慢下降。然后加入植物提取物，或者降低下降速率，或者增加下降速率，依赖于是否分别具有更大的抗氧化能力或氧化能力。抗氧化剂Tr0I0x(Fluka)用作标准，替代植物提取物。Trolox是维生素E衍生物。然后可以通过比较每条曲线的面积而以微摩尔Trolox当量/g鲜重组织将提取物的抗氧化能力定量。为了产生提取物，将20_100mg成熟但未开始衰老的叶片在液氮中冷冻，并在预先称重的Eppendorf管中测定它们的鲜重。然后将冷冻的组织研磨成细粉，并重新悬浮于40(^1^无菌时1110H2O中。在台式离心机中以最大速度在4°C离心30分钟，使不溶于水的材料成球。去除上清液并用PBS(磷酸缓冲盐；75mM，pH7.0)中稀释至浓度为IOmg初始鲜重/mL。对于脂溶性提取物，在dH20中洗涤上述小球两次，然后重新悬浮于400μL丙酮中。然后在台式离心机中以最大速度在室温离心10分钟使固体材料成球。去除上清液并用PBS稀释至浓度为IOmg鲜重/mL。对于实验本身，使用Eclipse分光光度计(Cary)，其能使用小搅拌棒在比色杯中混合样品，并且能同时测定四个样品的荧光。因此可以同时运行空白、标准和两个样品。这些由下述组成1.空白-2738μL3.38mg/LR-PE+150μLlXPBS+150μL320mMAAPH2.标准-2738μL3.38mg/LR-PE+150yL20μMTrolox+δθμL320mMAAPH3.样品-2738μL3.38mg/LR-PEPBS+150μL样品+150μL320mMAAPH首先，向搅拌的比色杯加入R-PE和样品/Trolox/PBS，并将荧光稳定在800超过大约20分钟。然后向所有比色杯快速加入AAPH并测定荧光强度的下降直至到达零。将每条曲线下的面积积分，针对稀释因子调整并计算抗氧化能力。ABA测量使用基于PhytodetekEliza的实验(Agdia，Elkhart,Indiana,USA)测量叶片中的ABA含量。对于ABA提取物，富集约IOOmg叶片组织，并立即在液氮中冷冻。使用Qiagen组织研磨仪和滚珠将组织研磨成细粉。将冷冻的粉末悬浮于ImL提取溶液(80%HPLC级甲醇，100mg/L丁羟甲苯，500mg/L柠檬酸一水合物)中，然后在暗处在4。C旋转24小时。然后在IOOOXg将样品离心20分钟，然后将上清液转移至新管中。将上清液在暗处使用SpeediVac以中热去除甲醇，干燥至约50μL。然后用TBS缓冲液(3.03g/LTris碱，5.84g/L氯化钠，0.2g/L七水合硫酸镁，0.2g/L叠氮化钠，pH7.5)将剩余的液体稀释至lmL。使用每个样品的1100的TBS缓冲液稀释液进行实验。按照生产商的说明进行实验。在读板仪中在405nm处读板。试验了很多不同的提取操作规程，包括在重新悬浮前彻底干燥样品，过滤提取物和离心提取物。还试验了20、100和200mg的组织重量和110和1100的稀释度。成像扫描电子显微镜^tDr.ChengHuang,ANUElectronMicroscopyUnit白勺禾呈。使用冷冻扫描电子显微镜将叶侧表面成像。概述之，将小片成熟叶片用组织冷冻培养基和碳糊的混合物固定粘附，帮助导电。然后在真空下将样品在液氮中冷冻，以快速冷冻并防止形成水晶体。然后在真空中将样品加热至-90°C至腐蚀，即除去样品表面的水晶体。然后使样品回到_160°C，之后包被金颗粒。然后在CambridgeS360(SEM；1987；Leica/Cambridge,Wetzlar,Germany)中将样品成像。使用相同的过程查看花苞和成熟叶片的横截面。然而这些样品冷冻后断裂。概述之，一旦固定并在真空中冷冻，敲打样品顶部，使样品断裂并露出横截面。透射式电子显微镜固定叶片样品将小片成熟叶片嵌入树脂中，用电子显微镜观察叶片横截面。首先用由0.IMcacolydehyde,4%甲醛和2.5%戊二醛组成的缓冲液在弱真空中将3mmX3mm的样品洗涤2小时。然后去除缓冲液并用0.IMcacolydehyde将样品洗涤三次共15分钟。然后用0.IMoacicacid和0.05Mcacolydehyde缓冲液将样品固定90分钟。然后用水洗涤样品三次共15分钟。然后使样品通过甲醇梯度，开始为70%甲醇，然后通过80%，90%，95%和三批100%甲醇。每次洗涤保持至少15分钟。然后用100%丙酮洗涤样品15分钟以替代甲醇。然后使样品接触水平不断升高的树脂(环氧树脂醛)中，所述树脂用丙酮稀释。首先为1/3树脂2/3丙酮，然后是1/2树脂1/2丙酮，然后2/3树脂1/3丙酮。每次至少30分钟，并且旋转以混合。然后使样品接触纯树脂三次，超过2小时，去除任何酮。然后将样品和新树脂载于样品模子中，在60°C过夜烘焙。切片和染色将嵌入的叶片材料切成薄片进行TEM并使用UltracutsUltramicrotome(Reichert,Depew,NY,USA)光学显微镜观察。制作玻璃刀将切片切下放在水上。在挑取至标本支撑格上之前用热使切片变平。然后将样品过夜放置干燥，然后在暗处用6%(体积百分比)乙酸铀酰的水溶液染色20分钟。用dH20冲洗样品几次，然后在柠檬酸铅中染色10分钟。在干燥前通过用dH20冲洗而去除染料。成像使用附着于SISMegaviewIIIWidefieldCCD照相机(1300X1024像素，12字节；SoftImagingSystemsCorporations,Lakewood,CO,USA)的HitachiH7100FA(125kVTEM；1995；Tokyo,Japan)摄取图像。光学显微镜在LilyShen，ANUElectronMicroscopyUnit的帮助下进行过程。用ultramicrotome切开的叶片横截面在玻片上干燥并用甲苯胺蓝染色，然后用dH20冲洗。使用配备SPOTCCD照相机(1300X1240,36字节色彩；SpotImagesCorporation,Chantilly,VA,USA)的ZeissAxioskop(CarlZeisslnc.,Oberkochen,Germany)从下面获得固定玻片狭缝的图像。然后用SPOT高级软件处理图像。荧光素酶成像使用冷CCD照相机在体内检测转基因植物的荧光素酶活性。用0.5mM荧光素(Biosynth，Switzerland)喷灌植物，所述荧光素为水溶液，并且包含几滴Tween-80(LaboratorySupply，Australia)，均处理15分钟并立即成像。将植物置于暗处几分钟直至叶绿体荧光下降，然后曝光2至10秒的不同时间。然后将这些整合，以增加图像强度。使用冷CCD照相机(AndorTechnology,Japan)并使用ImageProPlus4.5.1(MediaCybernetics,USA)处理图像。代谢物/溶质的提取和分析提取约50mg鲜重的叶片组织并基本如Roessner-Tunali等(2003)，PlantPhysiology,133:84_99所述通过GC-MS分析。概述之，在液氮中将组织冷冻，然后在Retsch球磨中以15次振动/秒钟研磨3分钟。然后在70°C用0.5mL85%(体积百分比)Me0H/H20提取组织粉末(约50mg)15分钟，所述提取液中包含0.2mg/mL核糖醇作为内标。然后通过在20，OOOg离心10分钟而使不溶材料成球。然后在真空下将100μL上清液等分试样干燥，并通过用20μL20mg/mL盐酸甲氧胺的无水吡啶溶液通过甲氧化而衍生干燥的代谢物提取物(30°C，90分钟)。为了将包含活性氢的活性功能团转化成它们的三甲基硅炕基(TMS)衍生物，向反应混合物加入30μLMSTFA，并在37。C反应30分钟。然后将反应平衡至少4小时，之后进行GC-MS分析。向GC-MS中注入1μL，并且使用45分钟温度程序在配备IOm整合保护柱的30mVarianFactorFour5msGC柱上分离分析物。用从40至600m/ζ的扫描范围中，以全扫描模式获得四极柱-MS数据。通过使用免费提供的AMDIS软件自动去卷积和整合峰，进行数据分析，所述软件可以与真正的质谱和保留指数的内部数据库相竞争。使用定制的PHP脚本自动处理AMDIS批次报告并在MicrosoftExcel中可视化，从而进行统计学分析。实施例2-结果在EMS诱变拟南芥种子后，鉴别了APX2=LUC表达改变的几株突变体，包括APX2LUC表达增加的突变体alx8。三株植物表现出抗旱性增加-保水9天后，alx8突变体的叶片保持膨胀、绿色并且有活力，而野生型叶片已枯萎死亡(参见图7)。发现ABA水平在alx8中更高，尽管在相同时间，ABA-依赖和ABA-无关途径中的组分都上调了(Rossel，J.B.,P.B.Walterφ(2006),Plant,CellandEnvironment29(2):269_281)。例如高光响应基因，ZATlO和APX2，在alx8中均上调。然而，认为ZAT10存在于ABA-无关途径中(Zhang,J.Ζ.等(2004),"FromLaboratorytoField.UsingInformationfromArabidopsistoEngineerSalt,Cold,andDroughtToleranceinCrops",PlantPhysiol.135(2):615_621)，而APX2为ABA依赖的(Rossel等，2006)。胁迫抗性基因的上调与先前的fryl突变体一致，尽管每个突变体中上调的胁迫抗性基因不同，例如RD29A4在fryl-Ι中上调(Xiong,L.Μ.等(2001),"FIERY1encodinganinositolpolyphosphate1-phosphataseisanegativeregulatorofabscisicacidandstresssignalinginArabidopsis"Genes&Development15(15):1971_1984)，但是在alx8中则没有(Rossel等，2006)。相似地，在alx8中观察到的胁迫抗性提高是新线索。alx8还具有不寻常的莴笋样叶形。Fl和F2植物的研究表明，APX2:LUC表达增加和其它胁迫基因上调，抗旱性和叶形改变共分离。alx8是SALl中的点突变通过定位克隆和测序鉴别alx8点突变的位置。通过将Col_0背景中的alx8野生型Landsbergerecta杂交，产生定位群体。Fl的叶形、发育和APX2表达为野生型(未给出数据)，证明为隐性突变。Fl个体自体繁殖，并且将分离的F2代播种在土壤上。通过叶形从F2代鉴别alx8突变均一的个体，其表现为与抗旱性分离并且APX2表达增加(Rossel等，2006)。用400个突变F2个体，用遍布与拟南芥基因组中的22条引物进行第一次通过定位。这说明突变与染色体5的下半部相关。在这个区域用更多的标记进行深入的连接分析，得到617kb的目的区域。用617kb区域侧翼的两个标记物MUB3和匪19，对约4000个F2个体进行精确定位。为了确认alx8突变的位置，使用SALl基因和启动子的野生型拷贝补充突变体表型。两个确认的单独alx8转化体均具有野生型叶形和发育。互补的alx8的后代与alx8突变体表型有明显区别，并且表现为正常的野生型叶形(参见图2)。这确认了SALl中的突变的确负责突变体表型。还用这个构建体转化野生型植物，但是叶形、APX2表达或发育没有变化。alx8基因和2kb启动子的测序表明在At5g63980.1基因组序列(TAIR序列4010730406(2007年4月17日)，登录号NM_125794.4；SEQIDNO1；图3)的第1226个碱基对存在鸟嘌呤到腺嘌呤的单个核苷酸多态性。这在编码序列(TAIR登录号4010745380(2007年8月16日)；SEQIDNO:2，图4)的第217个氨基酸处产生了甘氨酸到天冬氨酸的氨基酸变化。通过对多个突变植物的启动子和基因组序列的进一步测序，确认这个突变为SALl中的唯一突变。还通过使用衍生的裂解多态序列(dCAPS)标记物，在四代逆交中筛选突变，确认突变体继承叶形(参见图1A)。即，植物中没有其它突变导致突变体表型。先前已鉴别了多个SALl中的突变体，包括温度敏感突变、渗透压胁迫调节基因表达2的高表达(hos2；Xiong等，2004)和firey1突变体(fryl；Xiong等，2001)。fryl-1突变导致第341个氨基酸从色氨酸变为终止密码子，产生缺失α5螺旋的截短蛋白质，所述螺旋为酶活性所必需的(Xiong等，2001)。使用针对酵母相似物HAL2的已知结构进行模拟蛋白质建模，将alx8突变定位于蛋白质内部的保守β-折叠。这个域没有已知的功能。Salk_020882突变体在alx8突变体的基因分型过程中，对重组体的进一步基因分型和表型分型使目的区域缩小至BAC克隆MBM17和七个基因。为了确定alx8表型，针对这些基因订购了很多T-DNA插入系。一个系，SALK_020882，模拟alx8叶形改变和发育延迟的表型(参见图10)。这个系在AT5G63980基因中包含插入，已知为SALl(FRY1/H0S2)。为了确认等位性，在alx8和SALK_020882之间杂交。所有后代都具有和两个亲本相同的叶形变化和同样延迟的发育，表明两个突变体为等位的。还发现SALK_020882植物(本文研究了两个特定系，称为salkl和salk2)比Col-O野生型植物更能耐受干旱(图12和15)。这些突变体在获得自拟南芥生物资源中心(ABRC)的Col-O生态型中包含T-DNA插入系。同源植物具有改变的卷心菜样叶形，如alx8(参见图10)，并且具有卡那霉素抗性。突变与alx8是等位的，并且这些突变体表现出抗旱性(参见图11、12和15)。Northern印迹表明与Col-O野生型相比，在SALK_020882系中仍然存在SALlmRNA，但是存在多个拼接变体，并且alx8变体只有一个。由拟南芥信息资源(TAIR)给出的插入位点如图9A所示。通过从T-DNA插入的LB单次传递测序而建立。给出了互补序列，即朝向基因的5’末端。为了确认插入的位置，从来自一株植物的DNA上插入的LB进行TailPCR。这导致如图9B所示的插入位点。由两侧获得的序列表明可能发生双插入。获得的序列还表明在插入位点附近缺失Ilbp(参见图9B，与图9A相比较)。在alx8和fryl-Ι中不存在SALl蛋白质由融合至多组氨酸标签泛素而为野生型SALl和突变的ALX8产生重组蛋白质。在大肠杆菌中成功地产生两个融合蛋白质，并且它们计算所得质量(约52kD)对应于氨基酸序列加14kD标签的期望大小(未给出数据)。尽管尝试了很多不同的诱导条件，但是只有SALl(野生型)融合基因成功地从可溶组分中纯化得到。这个蛋白质还表现出与先前报道相似的PAP磷酸酶活性(16.6士SE3.65微摩尔PAPPmg蛋白质，η=3)(Xiong等，2001)。进行Western印迹分析，确定野生型和突变植物中SALl蛋白质的丰度。在裂解使多肽具有基于氨基酸序列的期望分子量(37kD)的标签后，回收真实的SALl重组蛋白质(图11A，泳道10)。使用这个蛋白质增加多克隆抗体，其针对SALl免疫亲和纯化。单一的37kD条带，其大小对应于重组蛋白质，在野生型植物的总可溶蛋白质提取物中检测得到，但是在突变体中则检测不到(图11A)。此外，SALl蛋白质不存在于alx8的总蛋白质提取物中，但是存在于野生型Col-O中(图11B)。alx8、salk_020882和fryl-1抗干旱fryl-1突变体是突变拟南芥系，其在正常条件下和低温、盐和渗透压和ABA处理后，胁迫抗性基因RD29A的表达增加。发现这是由于SALl蛋白质(At5g63980)的第六个外显子中的终止密码子中产生点突变。这产生了不包含保守α-螺旋的截短型蛋白质，其中所述螺旋包含金属离子和磷酸盐的协调以及亲核水活化所需的WD-X11-GG基序。结果蛋白质对于IP3或PAP无活性。已报道fryl-Ι突变体对于盐、低温和渗透压的胁迫敏感增加(XiongL.M.等，(2001)，Genes&Development15(15)1971-1984)。这个突变体还与alx8和salk_020882突变体显示的叶形变化相似。在本研究中，发现fryl-Ι植物同alx8和salk_020882突变体相似，在相似的发育阶段(参见图7)或实龄(图8A)接受干旱处理时，与野生型植物比较，具有相似的抗旱性。图8A显示，当Col-O和C24野生型植物在脱水21天后表现出萎黄病并且叶片枯萎时，alx8和fryl-Ι植物在25天后仅表现出枯萎的迹象，并且图15A显示，alx8、salk_020882和fryl-Ι植物在18天后未出现枯萎或变色迹象，但是野生型植物(Col-O和Col-24植物)在18天后表现出枯萎和变色。如图15A所示，图中表示了18天脱水，然后再重新浇灌3天的结果，alx8、salk_020882和fryl-1植物在3天内恢复活力，同时Col-O和C24野生型即使有恢复迹象也很少，大多数叶片变白并枯萎。这种模式在超过10次不同的实验中重现，每次实验至少有四株植物。alx8、salk_020882和fryl-1和抗旱性除了alx8和fryl_l丢失功能等位基因(并且推测salk_020882丢失功能等位基因)之外，已经描述了fryl-Ι的幼苗期对干旱敏感(Xiong等，2001)，同时在土壤上生长的成熟alx8植物可耐受干旱(Rossel等，2006)，如salk_020882植物一样。对fryl-Ι的描述基于从1周龄幼苗的离子泄漏向包含PEG溶液中浸入增加。然而未见到fryl-Ι和C24野生型的独立嫩枝的蒸发率有差别，表明气孔控制没有变化。为了研究fryl-Ι和alx8在这方面的差别，通过水分损失而监控alx8、fryl-1、Col-O野生型和C24野生型独立莲座的蒸发。在初始阶段或二级阶段，四种类型之间均未看到显著差异，表明表皮相似。然后通过成熟植物保水28天而测试fryl-Ι突变体基于土壤的抗旱性。在多次实验中，fryl-Ι比C24野生型更能耐受干旱(参见，例如，图7、8A和15A)。为了确保两组植物都接触相同的胁迫条件，通过将盆重量计算为初始盆重量的百分比而近似计算土壤的相对水含量。在实验过程中，fryl-Ι和C24野生型植物之间土壤水含量没有显著差异(图8B)。将这转化为土壤水势，并且土壤水势之间仍然没有显著差异。类似地，在多次实验中未见到alx8或salk-020882植物和Col-O野生型的土壤水含量之间有显著差异(图8B、15B和21C)。为了确保和alx8的耐受结果不仅仅是发育延迟或尺寸更小的结果，测试了在多个发育阶段的alx8的抗旱性。在2、4、6和8周龄，alx8比Col-O野生型更耐干旱。当两种植物类型都具有六片叶子；都是成熟植物时；和当两者处于相同发育阶段，刚刚开始结花苞时，alx8也比Col-O野生型更耐干旱(图21)。当植物刚刚开始开花时(图21A)，植物基本具有相同的莲座区域和大小，但是在保水9天后，alx8和salk-020882比野生型Col-O更膨胀并呈现绿色，尽管水损失率相似(图21C)。类似地，生长至发育的相同成熟绿色阶段的alx8和fryl-Ι植物更耐干旱，在这个阶段野生型植物为8周龄，alx8植物为4周龄(图21B)。测定四种基因型的独立莲座水损失，以确定叶片和莲座形状是否会改变损失率或水损失，或者它们是否有区别地调节通过气孔控制的水量(水损失的初始阶段)和蒸发(水损失的第二阶段)。在任何阶段，四系植物之间未见到显著差异(图21E)。因此，叶形和莲座形状的改变不影响水从独立植物损失的速率。最后，评价相同年龄植物的抗旱性，其中将1株Col-O植物每盆与2株alx8植物每盆比较，使植物大小之间的差异相等，并且alx8比Col-O更耐干旱，可保水。这表明不是alx8的发育延迟或土壤水含量的差异导致alx8的抗旱性。此外，从切下莲座蒸发不总是与土壤中生长的植物的抗旱性相关。为了将alx8植物的耐干旱程度定量，使用叶绿素荧光测定植物活力。alx8植物表现出的干旱存活时间比Col-O长40-50%(未给出数据)。在不同的实验中，在无胁迫条件下和干旱12天后测定叶片相对水含量(RWC)(图16A)。如同期望的，alx8的叶片RWC在干旱期间未显著改变，而野生型的叶片RWC显著下降。针对相同的植物，使用热电偶湿度计计算叶片水势，或者用水的化学势除以偏摩尔体积(图16B)。在干旱条件下生长的psychrometer植物的水势更高，与保持的膨胀性相对应，而水胁迫的野生型植物的叶片水势显著降低。最后，针对fryl-Ι和alx8突变体和它们各自野生型(C24和Col-O)测定独立莲座的水损失，以确定是否差异性调节通过气孔控制的水量，即初始阶段水损失，或蒸发，即第二阶段水损失。在任何阶段均未见到显著的差异(数据未给出)。SALl是高度保守的蛋白质SALl在所有生物体之间高度保守。因此同源性存在于所有作物种类中，这些作物种类的基本序列信息可获得。理想的是，SALl及其同源物存在于所有植物种类中。这可通过植物中已测序的同源蛋白质的图5中的比对而阐释。搜索其它植物种类的表达序列标签(EST)，查找SALlmRNA，并且发现了很多同源序列(图6A-6C)。拟南芥基因组中也存在几个同SALl同源的基因。alx8突变的分子效应在fryl-Ι和alx8中测定了13个胁迫响应基因的表达。这些基因中只有有限数量的基因在正常条件下在突变体中的表达增加fryl-l中的C0R47；和alx8中的APX2、RAP2.6、ZAT10、ZAT12和DREB2A。RD29A在fryl_l中的表达增加，但是在alx8中没有增加。在正常条件下，在fryl-Ι中，胁迫响应基因HSP70、KIN1、C0R15A和ADH基本未上调(Xiong等，2001)。类似地，在正常条件下，在alx8中，胁迫响应基因sHSP、GST6和APXl基本未上调。这令人惊讶地在这些突变体中得到了IP3更高的组成水平，并且表明IP3信号传导可以仅涉及部分胁迫响应途径。为了进一步研究胁迫响应途径的上调，以及其它非胁迫相关途径，通过微阵列测定了全局表达。在ATHIGeneChip(Affymetrix,SantaClara,Ca,USA)上定量的约24，000个基因产物中，相对于在Col-O野生型中的表达，1414个基因在alx8叶片组织中显著上调超过2倍。1033个基因显著下调超过2倍。在正常生长条件系，在fryl-Ι中，相对于C24野生型，1099个基因显著上调，并且745个下调，超过2倍。这种对上调的偏向性符合SALl作为信号传导通路的负调节子的推测目的。alx8和fryl-Ι中表达变化之间的重叠令人惊讶地限于上调基因，两个突变体之间仅有727个基因相同，在下调基因中，仅有395个相同。调节的这些差异不同于C24和Col-O野生型之间的差异。因此，这证明相似突变能在不同生态型中引起多大程度的不同表达模式。alx8中很多胁迫响应基因上调，包括ABA-依赖型途径中涉及的那些基因，例如-液泡膜水通道蛋白(TIP5；1)的上调，其通常由蔗糖、盐和H2O2下调，但是由ABA上调；和-开花的负调节子C0NSTANS-LIKE9(C0L9)在alx8中高度上调。C0L9的过量表达导致CO和FTP的下调，和延迟开花，而T-DNA敲除使开花较早(Xiao-FeiCheng,Zeng-YuWang(2005),"OverexpressionofC0L9,aCONSTANS-LIKEgene,delaysfloweringbyreducingexpressionofCOandFTinArabidopsisthaiiana，，ThePlantJournal43(5)=758-768)。这个结果与在这些研究过程中的观察相对应，表明研究的SALl突变体中开花与野生型植物相比延迟了四到五周。图15表示在2、3、5和8周龄时的alx8和其相应的Col-O野生型植物。在&118中六乂2(倍数变化=9.3，？值=0.003)；ZATlO(倍数变化=5.00，ρ值=0.028)和RAP2.6(倍数变化=3.1，但是标准偏差较大)的表达增加。有趣的是，在alx8或fryl-Ι中，C0R47和RD29A的表达都没有显著增加。通过实时RT-PCR确认了缺乏RD29A的诱导。因此可能是实验操作过程中环境中生长或干扰的差异诱导了fryl-Ι中的这两个基因。在水分充足条件下alx8中针对NCED3、GST6、APXl、RD29A和DREB2A的阵列中没有任何变化，这与已发表的结果一致(Rossel等，2006)。alx8中很多胁迫响应基因上调，包括转录因子如ZAT10、ZAT12、MYC2和HB6。上调的其它胁迫响应因子包括几个早期光诱导蛋白质，ELIP；水通道蛋白TIP5；1；胁迫信号激酶SnRK2.2；胁迫诱导蛋白质，VSPl和VSP2；和抗氧化酶CSDl和CSD2。为了进一步研究在alx8中组成型上调的途径的类型，使用Genevestigator，将表达量上调超过25倍的基因与公共数据库中保存的在其它阵列中的表达比较。除了alx8的ABA含量增加之外，alx8的表达模式和胁迫ABA之间没有较强的关联。只有10%的基因也由ABA上调，数目与通常由ABA下调的数目相似。在任何激素处理之间没有较强的关联。在alx8的表达模式和对非生物胁迫比如渗透、创伤、热、氧化、低温和盐之间有一些关联，但不强。alx8中百分之二十的上调基因为ABA诱导的，但是数目和由ABA下调的基因数目相似。相似地，其它激素处理之间没有较强的关联，除了与茉莉酸处理之间存在轻微的关联。SALl对气孔的作用先前，alx8表现出相对于Col-O野生型在不同的光强度范围具有较低的气孔导度(Rossel等，2006)。这种降低可能由多个因素导致，包括植物的形态、生理和分子谱的变化。导度下降可能由于alx8气孔的密度、大小和/或形态改变。因此用冷冻扫描电子显微镜(SEM)观察气孔。气孔外观正常，并且不像气孔发育出现突变的其它突变体中见到的聚集现象。气孔不是位于凹陷中，这会由于边界层效应而增加阻力，从而降低导度。alx8的大小与Col-O野生型中相似。使用SEM，计算叶侧表面上的气孔密度，发现在alx8中略高于Col-O野生型植物。与突变体如气孔密度和分布l(ssdl；AT1G04110)相比，这种增加小得多，ssdl叶侧气孔密度提高2.5倍(Schluter等，2003)。此外，alx8和Col-O野生型中表皮细胞数目增加，导致出现相似的气孔指数。这进一步由不同实验中生长的alx8和Col-O野生型植物中气孔的表皮而确认。此时Col-O野生型和alx8之间的气孔密度没有显著差异。再次比较了两种植物类型之间的气孔指数。这里强调了气孔指数作为气孔数目的度量值在比较发育发生变化的植物组织中的作用。除了叶片具有相似年龄外，它们的扩展阶段可能不同，导致细胞密度更高。如果气孔数目是alx8耐干旱性的因子，可以期望alx8比Col-O野生型的气孔指数低。事实并非如此，并且因此气孔的功能可能改变。通过降低气孔开度也可以降低导度。使用碳-13歧视(discrimination)了解植物生命过程中平均气孔开度是否有差异。当气孔打开并且气体自由地在气孔内外交换时，由于RUBISC0的区别，植物优先固定12CO2,而不是13CO2。然而当气孔关闭时，气体路径受限，并且植物被迫使用13CO2。因此可以使用植物中13CO2对12CO2的比例表明植物的平均气孔导度。在正常生长条件下，发现在野生型和alx8之间的13CO2利用上没有差异。这表明在正常生长条件下，野生型和alx8之间的平均气孔开度可比。通过历时九小时的叶片表皮剥落而测定气孔开度，从而确认了这一结果。同样地，在这个时间段，alx8和Col-O野生型之间未见到开度有显著差异。为了了解对于干旱的响应，气孔开度是否有任何显著差异，对于已经在干旱胁迫下20天的植物进行了13CO2歧视研究。只富集了干旱处理过程中发育的组织。受干旱影响的植物的S13C高于对照植物，对照植物为Col-O野生型和alx8，表明气孔开度降低。受干旱影响的alx8的δ13C未高于受干旱影响的Col-O野生型，表明在干旱过程中alx8的气孔开度未减小。因此可以看出对于alx8，观察到的导度减小是由于气孔开度以外的因素引起的。叶形已经确认，形态变化，比如多汁、叶毛增加，能改变抗旱性。alx8的叶形改变成Col-O野生型植物的叶形。叶子更短、更圆，并且浅裂叶缘更多。叶片表面经常有起伏，并且叶柄长度降低，得到莴笋样外观的莲座。SALK_020882突变体的叶形与fryl_l突变体相似(参见，例如，图7和8A)。叶片表明起伏度增加能增加边界层效应，减小蒸发。测量了叶片厚度，发现alx8中的叶片厚度显著大于Col_0野生型植物(图18A和B)。这个厚度意味着水蒸气到达气孔开放处的距离更长，并且可以抑制叶片的水分丢失。叶片厚度的增加还导致表面积对体积的比例下降，这可以降低表皮上的水分丢失。通过光学显微镜观察的叶片横截面也表明alx8中叶片内部结构有很多变化，包括无序的维管束、细胞形状改变和叶绿粒更小(图18B)。表皮是另一个水分从叶片损失的来源。然而与Col-O野生型相比，alx8中的表皮厚度或结构没有可见的差异。此外，相对于Col-O野生型，在alx8中的表皮合成基因如WAX2(At5g57800)、CUT1/CER6(Atlg68530)和CERl(Atlg02205)没有显著变化。尽管发育延迟并且由于叶片和莲座形态的变化看起来更小，但是alx8植物和野生型通过八周的生长积累了相似的莲座鲜重和干重(未给出数据)。细胞形态和渗透势通过透射式电子显微镜更近地观察了Col-O野生型和alx8的叶绿粒，并且发现alx8叶绿粒缺乏淀粉颗粒。这种淀粉积累的抑制进一步通过碘染色在alx8以及fryl_l中得到确认(图19)。植物通常在白昼在叶片中积累暂时性淀粉，并在夜间将其分解。如同期望的，野生型叶片在夜晚比早晨的淀粉多。相似地，alx8和fryl-Ι叶片在夜间比早晨积累更多的淀粉。然而，在水分充足的条件下，野生型植物中存在的量基本较少。淀粉的减少与alx8中β-淀粉酶，BMYl和ΒΜΥ8的表达增加有关。这些酶将暂时性淀粉水解成麦芽糖和β-限糊精，其可以增加植物细胞的胞内渗透势。通过GC-MS分析了alx8、fryl-l和它们各自的野生型在水分充足的生长条件下的代谢谱。所有四个系具有不同的谱，如由主成份分析(PCA)所表明的，C24和Col-O之间有一定程度的重叠(图20)。两种突变体由第一主成份(PCl；占总变异的47.2%)而明显区别于它们各自的野生型，第一主成份代表由PCA可见的最大分类别。有趣的是，第二主成份(PC2;占总变异的25.1%)清晰地将alx8和fryl-1区别开来，而两种野生型则没有。在SALl突变体中，alx8和fryl-Ι中的多胺、腐胺的水平明显增加(表2)。这与限速多胺生物合成基因精氨酸羧化酶ADC2表达增加(6.43倍)和可将亚精胺转化成精胺的酶ACL5的表达下降(-3.90倍)有关。相对于Col-Ο，除了脯氨酸生物合成基因，吡咯啉-5-羧化还原酶增加(3.61倍)外，alx8中的脯氨酸丰度没有显著差异。在alx8和fryl_l中，大量糖的丰度有变化，包括果糖、半乳糖、葡萄糖纤维二糖和大量未知糖和糖衍生物的水平极大下降；和大量未知糖/糖衍生物的加大积累，所述未知糖/糖衍生物在野生型植物中的水平检测不到或几乎检测不到(表2)。还令人吃惊的是，有机酸柠檬酸、异柠檬酸、延胡索酸和苹果酸的极大下降和大量未知类别代谢物的极大增加，其中一些与吲哚相关化合物有特别的同源性(表2)。表2-SAL1突变体的特色代谢谱<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>给出了alx8和fryl-1共有的主要(最大的)代谢物差异的倍数差异和p_值(η=5)。根据质谱与MST05质谱库中参照谱的相似性对未知代谢物(方括号中的内容)进行了注释。为未知的代谢物给出了保留指数。RI=“保留指数”。讨论alx8突变体的抗旱性表现出是由于在胁迫条件下蒸发的减少，导致叶片和土壤中相对水含量更高。然而，蒸发的减少似乎不是由于干旱诱导的气孔关闭引起的。碳歧视和切下莲座脱水实验都表明在干旱条件下，与Col-O野生型相比，alx8中气孔关闭较少。因此水分损失的减少是由于alx8中其它形态、生理或分子变化，或者它们的组合。alx8的结构形态变化能引起干旱胁迫下水分损失的减少。叶片厚度增加和无序的维管束可以使水在植物中移动和水蒸气在气孔下的扩散减慢。相似地，alx8的根形态发生变化，在水胁迫条件下改变水分摄取和移动。除了缺乏对已知胁迫响应基因的诱导之外，在alx8的代谢谱中仍然有很多变化，这些变化与胁迫响应有关，包括多胺、海藻糖和甘油的增加。alx8和fryl_l中渗透压保护剂的积累可能是导致它们的抗旱性的因素。alx8中的多胺，腐胺的水平比其相应的野生型Col-O高15.2倍(ρ-值=0.008)。相应地，alx8中多胺生物合成酶ADC2的表达更高，所述酶通常上调而响应渗透压胁迫(Perez-Amador，Μ.Α.等(2002),PlantPhysiology，130，1454-1463)。在多种耐干旱小麦和耐氧化胁迫的各种杂草，香丝草中已经报道了组成型的高腐胺水平(Ye等，(1997),PlantPysiology,15,1443-1451)。先前，通过过表达生物合成基因而增加多胺水平已经显示出可诱导对于各种非生物胁迫的耐受性，包括干旱(Kur印a等，(1998),PlantCellPhysiology，39，987-992；Kasukabe等，(2004),PlantandCellPhysiology，45，712-722)。尽管腐胺在耐受性中的确切作用尚不确定，已经报道可能的作用是直接或间接的抗氧化防御(Ye等，1997)和作为干旱过程中精胺和亚精胺合成的调控子，以全植物水平提供抗衰老作用，得到表型正常的才直·(Capellφ,(2004),ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA,101,9909-9914)。在alx8叶片组织中很多糖的水平也发生了改变，包括很多未鉴别的糖的大幅增加(表2)。这些变化与alx8的叶绿粒中暂时性淀粉的积累下降(图19)负相关。糖在渗透胁迫响应中可能具有重要作用，作为渗透压保护剂，保护大分子和防止膜融合(Bartels和Sunkar，(2005),CriticalReviewsinPlantSciences，24，23-58)。因此，alx8叶片组织中糖组分的变化可能与其抗旱性有关。对干旱条件的预适应和alx8的发育改变不影响植物在水分充足条件下的水分平衡。然而，这可以解释alx8的暂时生长延迟，因为资源分配给胁迫抗性机制，不能进入生长。这种影响是暂时性的，因为到发育后期，alx8和fryl-Ι的莲座干重与其相应的野生型相似。对于alx8和fryl_l突变体，在代谢物中观察到的差异在正常生长条件下已经存在，表明对干旱的预适应。突变体的这种预适应不影响植物在水分充足条件下的水分平衡。在叶片水势或相对水含量上未见到差异。alx8和Col-O野生型之间在这些条件下还存在相似的气孔开度，如碳歧视和表皮叶片剥落所示。因为在这些条件下alx8和Col_0野生型之间的光合作用速率相似，所以alx8的发育延迟可能是由于资源的重新分配和生长抑制途径的活化，而不是资源匮乏。SALl中丧失功能的突变导致与野生型植物相比，在无胁迫生长条件下，>1000个基因上调和500-1000个基因下调。SALl作为胁迫和发育中的基因表达调控子的作用再次由其在翻译后基因沉默中的负作用(Gy等，(2007),PlantCell,tpc.107.055319)和SALl突变体的形态和开花时间变化而得到证实。事实上，在alx8中受到差异调控的2447个基因中只有7.6%划分为胁迫响应基因(未给出数据)，并且其中大部分都不受ABA的诱导。这表明不是所有的胁迫响应途径在无胁迫生长条件下在alx8中都是组成型活化的。例如，在无胁迫叶片中，APX2、RAP2.6、sHSP和DREB2A诱导倍数在2和20倍之间，但是高光胁迫(HL)导致相同基因的25至700倍诱导，证明调控这些基因的其它途径为胁迫诱导型(Rossel等，2006)。第二，脱水响应的RD22的表达由ABA上调(Yamaguchi-Shinozaki等，(1992)，PlantandCellPhysiology，33，217-224)，并且这种诱导部分依赖于转录因子MYC2，其过量表达时会导致RD22的组成型诱导(Abe等，(1997)，PlantCell，9，1859-1868；Abe等，(2003),PlantCell，15，63-78)。然而在alx8中，除了MYC2表达增加8.2倍之外，RD22的表达下调3.7倍。相似地，没有ADHl或KIN2/COR6.6的显著诱导，其已经表现为ABA响应型和受MYC2调节(Abe等，2003)。这表明为完全活化胁迫响应，除了alx8和fryl中组成型活化的与ABA无关的途径之外，还需要多个途径之间的互相作用。在已知的胁迫响应转录因子中，在无胁迫条件下alx8中一个小子集显著上调，包括两个锌指转录因子，ZATlO和ZAT12。ZATlO和ZAT12都参与非生物胁迫响应途径比如干旱和高光(Sakamoto等，(2004)，PlantPhysiology，136，2734-2746;Davletova等，(2005),PlantPhysiology，139，847-856;Rossel等，(2007)，ThePlantCell,10.1105/tpc.1106.045898)。ZAT10的过量表达诱导的APX2表达，并且使HL中18%的基因上调(Rossel等，2007)。相应地，alx8中24.6%的基因也由HL诱导上调，进一步突出了干旱和HL胁迫响应网络之间存在重叠。SALl在维管组织中的高水平表达(Xiong等，2001)，表明其在干旱胁迫过程中具有信号转导的作用。这种定位和在维管束鞘所见到的H2O2生产与抗氧化酶表达的增加以应对其它非生物胁迫如HL有关(Karpinski等，(1999),Science,284,654-657；Rossel等，2007)。此外，APX2和ZAT10表达主要集中在维管，这可以说明SALl在相似的ROS介导的响应调控中的作用。干旱诱导ABA的增加，并且通常限速ABA生物合成酶NCED3和NCEDl表达相应增加(Iuchi等，(2001)，PlantJournal，27，325-333)。然而这些基因在alx8中未上调，基因的下调也和ABA分解代谢无关，事实上分解代谢酶CYP707A1-4上调(未给出数据)。因此，alx8中ABA含量的增加(Rossel等2006)未表现出受转录调节。与野生型相比，fryl-Ι中大多数上调(66%)和下调(53%)基因在alx8中共表达。然而，alx8和fryl-Ι之间的基因表达和代谢谱有差异，它们都在相同的基因中发生功能丧失的突变，因此这个结果很有趣。C24和Col-O具有独特尽管相似的代谢谱，并且因此生态型差异微妙地改变SALl的作用和其丧失对每个生态型的影响。在这些研究中另一个有趣的观察结果是研究的SALl突变体相对于野生型植物的开花时间延迟，并且这与开花的负调控子C0NSTANS-LIKE9(C0L9)的强烈上调相关联。这可以用于农业的很多方面中，包括牧场植物开花延迟(并且因此，通常衰老)，产生生长期延长的植物，其可以获得更高产量或者更大的部位(比如花、茎、叶、块茎等)。增加植物中SALl的表达可以具有相反的作用。结论SALl突变体在长时间干旱后的存活率比野生型植物高40-50%，并且虽然发育发生了改变，但是完全成熟的植物中叶片和茎的生物量未变。不希望受到理论的束缚，我们假设SALl蛋白质在调控形态、生理和分子变化的途径中有负调控作用，其获得导致胁迫网络诱导加强。结果增强了对干旱的耐受性而不是不做响应。这可以由一定程度的预适应说明，比如胁迫响应基因如抗氧化APX2的组成型上调，渗透压保护剂如多胺和糖的积累，和无胁迫条件下脱落酸的积累。因此，SALl表现出可负调节抗旱性并且因此，突变体在水胁迫下保持完全的膨胀和水势。应理解的是，尽管本文为阐述目的而描述了本发明的特定实施方式，但是在不偏离如下述权利要求所定义的本发明的精神和范围的情况下可以作出各种修正。权利要求用于获得相对于野生型植物胁迫抗性提高的植物的方法，其包括(a)将至少一个突变或外源性核酸导入一个或多个植物细胞的基因组中，所述至少一个突变或外源性核酸使所述一个或多个植物细胞中与SAL1或其同源物有关的活性降低；(b)从所述一个或多个植物细胞再生一个或多个植物；和(c)选择相对于野生型植物胁迫抗性提高的一个或多个植物。2.如权利要求1所述的方法，其中通过使所述一个或多个植物细胞受化学或物理诱变方法或插入突变方法如转座子或T-DNA的作用而导入所述至少一个突变。3.如权利要求1所述的方法，其中通过重组方法导入所述至少一个突变。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法包括向SALl基因或其同源物中导入至少一个突变，或者抑制或阻抑SALl基因或其同源物的表达。5.如权利要求4所述的方法，其包括向所述一个或多个植物细胞中编码SALl或其同源物的核苷酸序列中导入突变。6.如权利要求5所述的方法，其中所述突变包括一个或多个核苷酸的插入、缺失或替代。7.如权利要求5所述的方法，其中所述突变包括在SEQIDNO1的核苷酸731至745、1226、1518、1519和1690的区域中，或在SEQIDNO:1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置处的一个或多个核苷酸的插入、缺失或替代。8.如权利要求5或6所述的方法，其中所述突变包括在SEQIDNO=I的位置1226处，或在SEQIDNO:1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置处的由鸟嘌呤至腺嘌呤的突变。9.如权利要求8所述的方法，其中所述突变导致SEQIDNO2的位置217处发生由甘氨酸至天门冬氨酸的氨基酸变化。10.如权利要求5或6所述的方法，其中所述突变包括在SEQIDNO:1的位置734和735之间，或在SEQIDNO=I的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置处插入一个或多个核苷酸。11.如权利要求5或6的方法，其中所述突变包括用一个或多个核苷酸替代SEQIDNO1的核苷酸735-745，或SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同的核苷酸。12.如权利要求5或6的方法，其中所述突变包括在SEQIDNO=I的位置1518和1519之间或包含位置1518和1519，或在SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置处插入一个或多个核苷酸。13.如权利要求10至12中任一项的方法，其中所述一个或多个插入或替代的核苷酸包括T-DNA插入。14.如权利要求5或6所述的方法，其中所述突变包括在SEQIDNO=I的位置731处，或在SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置处由胞嘧啶至胸腺嘧啶的突变。15.如权利要求5或6所述的方法，其中所述突变包括在SEQIDNO=I的位置736处，或在SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置处由鸟嘌呤至腺嘌呤的突变。16.如权利要求5或6所述的方法，其中所述突变包括在SEQIDNO1的位置1690处，或在SEQIDNO1的至少核苷酸191-1991的同源物中等同位置处由鸟嘌呤至腺嘌呤的突变。17.如权利要求5或6所述的方法，其中所述突变是SALl无效突变。18.如权利要求4所述的方法，其包括向所述一个或多个植物细胞导入阻抑内源性SALl蛋白质或其同源物的表达的外源性核酸。19.如权利要求18所述的方法，其中所述外源性核酸包括与内源性SALl-编码序列或其同源物的至少一部分同源或互补的核酸序列。20.如权利要求18或19的方法，其中所述外源性核酸与胁迫诱导启动子可操作地连接。21.如权利要求4所述的方法，其包括向所述一个或多个植物细胞导入用外源蛋白质的表达替代内源性SALl蛋白质或其同源物的表达的外源性核酸。22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所得到的植物相对于野生型植物对干旱、盐、温度胁迫或光胁迫、或它们的组合的抗性提高。23.如权利要求22所述的方法，其中所得到的植物相对于野生型植物至少抗旱性提高。24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述植物选自伞形科、紫菀科、十字花科、藜科/苋科、菊科、葫芦科、蝶形花科、禾本科、豆科、早熟禾科、蔷薇科或茄科。25.如权利要求24所述的方法，其中所述植物是十字花科的成员。26.由权利要求1至25中任一项所述的方法获得的相对于野生型植物胁迫抗性提高的植物。27.如权利要求26所述的植物，其相对于野生型植物对干旱、盐、温度胁迫或光胁迫、或它们的任何组合的抗性提高。28.如权利要求27所述的植物，其相对于野生型植物至少抗旱性提高。29.如权利要求26至28中任一项所述的植物，其中所述植物选自伞形科、紫菀科、十字花科、藜科/苋科、菊科、葫芦科、蝶形花科、禾本科、豆科、早熟禾科、蔷薇科或茄科。30.如权利要求29所述的植物，其中所述植物是十字花科的成员。31.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中得到的植物开花时间延迟。32.用于获得相对于野生型植物开花时间改变的植物的方法，所述方法包括(a)将至少一个突变或外源性核酸导入一个或多个植物细胞的基因组中，所述至少一个突变或外源性核酸使所述一个或多个植物细胞中与SALl或其同源物有关的活性改变；(b)从所述一个或多个植物细胞再生一个或多个植物；和(c)选择相对于野生型植物开花时间改变的一个或多个植物。33.如权利要求33的方法，其中所述至少一个突变或外源性核酸导致与SALl或其同源物有关的活性降低，并且所述方法导致植物开花时间延迟。34.如权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述开花时间延迟约7天至约100天。35.由权利要求31至34中任一项所述的方法获得的相对于野生型植物开花时间改变的植物。36.由权利要求31至34中任一项所述的方法获得的相对于野生型植物开花时间延迟的植物。37.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所得到的植物叶片表型发生变化。38.用于获得相对于野生型植物叶片表型变化的植物的方法，所述方法包括(a)将至少一个突变或外源性核酸导入一个或多个植物细胞的基因组中，所述至少一个突变或外源性核酸使所述一个或多个植物细胞中与SALl或其同源物有关的活性降低；(b)从所述一个或多个植物细胞再生一个或多个植物；和(c)选择相对于野生型植物叶片表型改变的一个或多个植物。39.如权利要求37或38所述的方法，其中所述改变的叶片表型包括更厚叶、更短叶、更圆叶、具有更多浅裂叶缘的叶子，或具有选自下组的两种或多种改变的表型变化的叶片更厚叶、更短叶、更圆叶和浅裂叶缘叶。40.如根据权利要求37至39中任一项所述的方法获得的相对于野生型植物叶片表型发生变化的植物。41.如权利要求26至30、36或40中任一项所述的植物中得到的植物部位或突变/转基因种子。42.用于筛选植物的方法，所述植物中存在编码SALl或其同源物的核苷酸序列的至少一个突变等位基因，所述方法包括使用至少一个适合作为探针或引物的核酸分子分析植物DNA，所述探针或引物能在严格条件下与SALl基因或其同源物杂交。43.如权利要求42所述的方法，包括使用适于扩增SALl基因或其同源物的区域的至少一个寡核苷酸引物对，所述引物对包括检测所述区域中是否存在突变的正向引物和反向引物。44.如权利要求43所述的方法，其中所述区域包含完整的SALl基因或其同源物。45.如权利要求43所述的方法，其中所述区域包含SALl基因或其同源物的一部分。46.如权利要求45所述的方法，其中所述区域包含外显子3、外显子3和4之间的内含子、外显子5、外显子5和6之间的内含子和外显子6和7之间的内含子、或它们的任何组I=Iο全文摘要本发明提供用于获得植物的方法，所述植物相对于野生型植物具有更高的胁迫抗性，方法包括(a)将至少一个突变或外源性核酸导入一个或多个植物细胞的基因组中，所述至少一个突变或外源性核酸使所述一个或多个植物细胞中与SAL1或其同源物有关的活性降低；(b)从所述一个或多个植物细胞再生一个或多个植物；和(c)选择相对于野生型植物的胁迫抗性提高的一个或多个植物。文档编号C12N15/00GK101802190SQ200880103295公开日2010年8月11日申请日期2008年6月19日优先权日2007年6月20日发明者巴里·J·波格森,简·B·罗塞尔,菲利帕·B·威尔逊申请人:澳大利亚国立大学