一种转几丁质酶基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程和生物防治技术领域，特别是一种转几了质酶基因的粉红螺 旋聚抱霉工程菌株及其在植物病害防治中的应用。
【背景技术】
[000引 粉红螺旋聚抱霉Clonostachysrosea,原名；粉红粘靑霉，Gliocladiumroseum， 是一类重要的植病生防括抗微生物。它可W寄生核盘菌、丝核菌、镶刀菌、灰霉病菌等多种 植物病原真菌，通过产生抑菌物质、竞争、诱导植物抗性等多种作用方式抑制真菌病害。但 现有技术中缺乏高致病力菌株、缺少优良菌株规模化培养关键技术、产品稳定性不足，从而 制约了该类生防制剂在植物病害防治领域的广泛应用。
[0003] 菌寄生菌在寄生过程中分泌一系列细胞壁降解酶，如几了质酶、葡聚糖酶、纤维素 酶和蛋白酶等。其中几了质酶能降解真菌细胞壁的主要成分几了质，从而破坏真菌的细胞 壁，使病原菌细胞生长受阻，另外还可W破坏病原菌菌丝尖端新合成的几了质，从而使菌丝 停止生长、鎌缩崎形甚至消解等。现有技术中几了质酶基因已在植物病害防治中得到应用， 但利用来源于粘靑霉的几了质酶基因转化菌寄生菌至今还未见报导。
[0004] 粉红螺旋聚抱霉HLD-1是一株高效菌寄生菌，中国微生物菌种保藏中屯、保藏编号 为CGMCCNo. 1037,该菌对严重危害农作物生产的核盘菌、灰霉病菌、立枯丝核菌有明显的 抑制作用，表现出良好的生防潜力。但粉红螺旋聚抱霉HLD-1在单独使用时的抗病性能有 限，防效不稳定。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于提供一种转几了质酶基因的粉红螺旋聚抱霉工程菌株，解决现有 粉红螺旋聚抱霉抗病性能有限和防效不稳定的问题。
[0006] 一种转几了质酶基因的粉红螺旋聚抱霉工程菌株，命名为&-chi32,其特征在于， 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、保藏的保藏登记号为CGMCCNo. 10027， 地址；北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期；2014年11月28日，分类命名为：粉红 螺旋聚抱霉Clonostachysrosea。
[0007] 上述工程菌株化-Chi32中的几了质酶基因具有SEQ ID NO ;1所示的核巧酸序列。 [000引上述工程菌株&-chi32的培养特征为；该菌在PDA培养基上生长较快，26°C下培 养7d菌落直径可达7~8cm。菌落拉状，初始为白色，产抱后逐渐变成灰绿色、墨绿色。该 菌适宜的生长、产抱温度为24~28°C，最适抑值为6~7,且对光照较为敏感。镜检形态 为：菌丝无色、分隔，分生抱子梗直立，可产生2~3级靑状分枝，瓶梗顶端产生大量分生抱 子，聚集成球状。抱子卵形或圆柱形，直径3~Sum。
[0009] 上述工程菌株化-Chi32的构建方法为；
[0010] 1)对PAN7-1载体通过酶切获取线性化PAN7-1载体，将线性化PAN7-1载体与几了 质酶目的基因融合拼接，获得过表达载体；
[0011] 2)将粉红螺旋聚抱霉HLD-1菌株进行培养，筛选收集幼龄菌丝，将幼龄菌丝与蜗 牛酶进行混合酶解，过滤并离屯、，收集原生质体沉淀物，用STC溶液溶解后获取原生质体溶 液；
[0012] 3)将过表达载体与原生质体溶液混合静置，通过液体培养基TB3进行复苏，振荡 培养，离屯、去除上清，通过STC溶液悬浮沉淀后，与TB3培养基混合、倒板培养，挑取转化子。
[0013] 上述方法中的TB3培养基的组成为；0. 7%低烙点琼脂糖、100yg/ml氨节青霉素 和300yg/ml潮霉素。
[0014] 上述工程菌株&-chi32在植物病害防治中的应用。
[0015] 上述工程菌株化-chi32在制备植物病害防治药物中的应用。
[0016] 一种菌剂，该菌剂中包含工程菌株&-chi32。
[0017] 上述菌剂的制备方法为；将重组菌株化-chi32接种于PDA平板上培养7~lOd， 从平板上切取菌块，接入PD培养液中，振荡培养，最后向培养液中加入悬浮剂和展着剂，获 得菌剂。
[0018] 上述菌剂在植物病害防治中的应用。
[0019] 本技术通过构建全新的转几了质酶基因的粉红螺旋聚抱霉工程菌株，增强了粉红 螺旋聚抱霉的抗病性能，提高了防效稳定性，该工程菌株能够有效应用于植物病害的防治， 尤其是可W用来防治农作物菌核病、灰霉病，同时对枯萎病、根腐病等多种植物真菌病害也 有较好的防治作用。
【具体实施方式】[0020] 实施例1
[0021] 几了质酶目的基因的分离与鉴定
[0022] 将粉红螺旋聚抱霉HLD-1菌株转接至PDA培养基，PDA培养基的组成为；马铃馨 200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂20g/l，放置在恒温培养箱下26°C培养7山使用刮伊收集菌丝， 分别用CTAB法提取DNA、Trizol法提取RNA。WRNA为模板，采用cDNA反转录试剂盒得到 cDNA。
[002引 WDNA和cDNA序列为模板，设计几了质酶目的基因两端引物，cMF巧'-3'): TTCAGAGTAGGCTTTTGGATTGGT，chiR;ACCCCATATTTGCTCATAATCACA，PCR分别扩增几了质酶DNA和cDNA。PCR条件为；94°C预变性4min，按W下步骤进行30个循环；94°C变性30s，55°C 退火lmin，72°C延伸2min。最后在72°C下保持lOmin，结束扩增反应。
[0024] 将扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，并将测序结果在NCBI库 Blast中进行比对分析，确定扩增序列为几了质酶目的基因。
[002引其中粉红螺旋聚抱霉HLD-1几了质酶目的基因DNA序列为SEQIDNO;1，cDNA序 列为SEQIDNO;2,CDS序列为SEQIDNO;3。
[0026] 实施例2
[0027] 几了质酶过表达载体的构建与验证
[002引从目标PAN7-1载体中扩增启动子和终止子片段，琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回 收。采用祀ASY Uni Seamless Cloning and Assemby Kit将线性化pAN7-l载体与几了 质酶目的基因片段融合拼接，构建过表达载体。将构建的载体转入大肠杆菌感受态细胞中， 37°C过夜培养，随机挑选克隆提取质粒，Hindlll酶切验证。
[0029] 实施例3
[0030] 工程菌株&-chi32的制备与筛选
[0031] 将粉红螺旋聚抱霉HLD-1接种到PDA培养基上培养7d至产抱，用无菌双蒸水洗脱 抱子，取1ml接种于PD液体培养基中，26°C下培养12h。将菌液过500目网筛，收集菌丝，用 无菌水洗漆3次，然后用0. 7M氯化钢渗透压稳定剂冲洗使其平衡，收集菌丝。
[003引使用无菌Tip头将菌丝挑入含有40mg/ml蜗牛酶的酶解液中，充分祸旋振荡，28°C摇床中l(K)r/min酶解化，每隔Ih检查原生质体释放量。酶解结束后加入等体积渗透压稳 定剂稀释W免酶解过度。使用micracloth过滤细胞碎片，将滤液转移至50ml离屯、管中， 4000r/min离屯、lOmin，弃去上清，沉淀悬浮于10mlSTC中，STC组成为：庶糖200g/L、lM Tris-肥1 50ml/L和氯化巧5. 55g/l，同样转速和时间，弃去上清悬浮于2mlSTC中，并用 STC调整浓度至107原生质体/ml。
[003引 20yg过表达载体加入100y1原生质体中混合冰浴20min，加入1. 25mlPTC溶液， PTC溶液组成为；PEG4000 400g/L、1MTris-肥 1lOml/L和 2. 5M氯化巧 20ml/L，室温静止 20min。将原生质体转入15ml离屯、管，并加入5mlTB3液体培养基和终浓度为100yg