一种产高温纤维素酶及木聚糖酶的微细正青霉及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体设及一种产高温纤维素酶及木聚糖酶的微细正青 霉及应用。
【背景技术】
[0002] 纤维素酶是能将纤维素降解为葡萄糖单体的一组酶的总称，通常包括内切葡聚糖 酶、外切葡聚糖酶和0-葡萄糖巧酶。木聚糖酶则是一类能降解木聚糖类半纤维素为寡糖 或低聚糖的酶系总称。纤维素酶和木聚糖酶是可持续利用生物质资源的重要工具，其在生 物能源，饲料、洗漆、造纸及植物源活性物质制备等领域具有重要应用价值。当前，已报道 的纤维素酶及木聚糖酶资源仍然存在活性低、作用温度或抑范围窄及生产成本高等问题， 难W全面达到工业化应用的要求。
[0003] 丝状真菌是重要的纤维素酶及木聚糖酶产生菌，设及到的类群主要为木霉 属（Trichoderma)、曲霉属（Aspergillus)、青霉属（Penicillium)及枝顶抱霉属 (Acremonium)菌株。该些种类的菌株所产纤维素酶或木聚糖酶具有较好的活性，但耐高温 性能通常不好。耐高温酶具有使用成本低、易于保存和运输等优势，利于工业应用，因此开 发耐高温纤维素酶和木聚糖酶具有重要价值。
【发明内容】
[0004] 发明目的；本发明的第一个目的是提供一种±壤真菌微细正青霉。
[0005] 本发明的第二个目的是提供上述的±壤真菌微细正青霉在生产高温纤维素酶和 木聚糖酶方面的应用。
[0006] 本发明的第=个目的是提供一种发酵生产高温纤维素酶和木聚糖酶的方法。
[0007] 技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种±壤真菌微细正青霉，其分 类命名为微细正青霉4-14巧upenicilliumparvum4-14)，保藏于中国典型培养物保藏中 屯、，保藏日期为2015年6月25日，保藏地址；湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中屯、（武 汉大学第一附属小学对面），保藏号为CCTCCNo;M2015404。
[000引其中，上述±壤真菌微细正青霉菌株的生长温度为28°C~45°C。
[0009] 其中，上述±壤真菌微细正青霉菌株的最适生长温度为37°C。
[0010] 上述的±壤真菌微细正青霉在生产高温纤维素酶和木聚糖酶方面的应用。
[0011] 其中，上述±壤真菌微细正青霉菌株能够W小麦杆和款皮为基料发酵产生高温纤 维素酶和木聚糖酶。
[0012] 一种发酵生产高温纤维素酶和木聚糖酶的方法，包括W下步骤：
[0013] 1)取少量微细正青霉4-14真菌菌块接种于50mLPDA培养液，37°C、200巧m下振 荡培养7d得到菌悬液；
[0014] 2)取ImL菌悬液接入固态发酵培养基中，并于37°C、70%湿度条件下黑暗发酵培 养9d;
[0015] 3)发酵结束后，按每发酵瓶加入30mL无菌水，揽拌均匀，并于28°C、120巧m振荡 浸提化，继续W7000巧m离屯、20min得到粗酶液，将粗酶液转入新的离屯、管中，加入终浓度 0. 1%叠氮钢，于4°C冰箱保存。
[0016] 其中，上述固态发酵培养基包括脱木素后的麦杆1.5g，款皮1.5g，不含駿甲基纤 维素钢的lOXMandels培养基5血。
[0017] 其中，上述麦杆的脱木素方法；按每lOg麦杆加入20mL4%化OH溶液，混匀后， 12rC、20min处理，并W流水去除褐色物质，处理后的麦杆惊干即可。
[001引其中，上述发酵粗酶液的SDS-PAGE分析图谱中，主要胞外蛋白分布于35-130kDa分子量范围，其中，駿甲基纤维素钢的降解酶（CMC酶）条带处于50-55kDa之间，而木聚糖 酶条带处于60-70kDa之间。
[0019] 其中，上述CMC酶最适反应温度为70°C，80°C仍有70%W上的活性；0 -葡萄糖巧 酶的最适反应温度为70°C，75°C活性仍达95% ;木聚糖酶的最适反应温度为75°C，在85°C 时仍然有70%的活性，温度稳定性为；CMC酶在50°C和60°C下分别处理化残余酶活达85% 和80%;木聚糖酶60°C处理化，残余酶活接近70%; 0 -葡萄糖巧酶在40°C时热稳定性好， 处理化，残余酶活高于80%
[0020] 有益效果；本发明具有W下优点；本发明从±壤中分离获得了一株微细正青霉 巧upenicilliumparvum)，该菌株可W利用天然基质发酵获得高活性、低成本、耐高温的纤 维素酶和木聚糖酶。本发明对获取新的纤维素和木聚糖酶资源，促进生物炼制产业的发展 具有重要价值。
【附图说明】
[0021] 图1微细正青霉4-14的培养特征；A在不同温度下的菌落生长的比较；B在PDA、 MEA、Yro和CYA平板上37°C培养6d的菌落特征；
[0022] 图2邻位法构建菌株微细正青霉4-14及相关菌株ITS(A)和0 -Tubulin炬）序列 系统进化树；
[0023] 图3微细正青霉4-14固态发酵阶段产滤纸酶、CMC酶、0 -葡萄糖巧酶及木聚糖酶 的情况；
[0024] 图4温度对微细正青霉4-14发酵液CMC酶、0 -葡萄糖巧酶及木聚糖酶的影响， A、最适反应温度的测定；B、CMC酶的温度稳定性；C、0 -葡萄糖巧酶的温度稳定性；D、木聚 糖酶的温度稳定性；
[0025] 图5微细正青霉4-14发酵液CMC酶、0 -葡萄糖巧酶及木聚糖酶的最适抑(A)及 抑稳定性做测定；
[0026] 图6微细正青霉4-14发酵液SDS-PAGE图谱分析；A、1和2为胞外蛋白图谱巧、1 为CMC酶图谱，2为木聚糖酶图谱；M蛋白分子量。
【具体实施方式】
[0027]下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案，W下结合实例进一步说明本 发明，但该些实例并不用来限制本发明。
[002引下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0029] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0030] 实施例1微细正青霉的培养和生长特点
[0031] 菌株W稀释涂布法从上壤中分离获得，分离培养基为Mandels培养基（KH2P〇42g， (NH4) SO4I. 4g，化ea 0. 3g，M拆〇4?7&0 0. 3g，微量元素浓缩液1血，lOg駿甲基纤维素钢 (CMC-Na)和0.3g Yeast Extract,琼脂粉15g，蒸馈水定容至1000血。微量元素浓缩液每升 含；C0CI2?6&0 3. 7g, ZnS〇4?7&01. 4g, MnSO化0 1.6g，FeS〇4?7&0 5. Og。分离步骤；称取 Ig采集于南京市紫金山的上壤样品，悬浮于20mL无菌蒸馈水中，120巧m、28°C振荡30min， 静置30min。吸取上清液1血，W无菌蒸馈水稀释10倍，取0.1血涂布Mandels分离平板， 并置于28°C暗培养5d。挑取长出的真菌菌落，转接于同样的Mandels平板，28°C暗培养5山 W0.1%的刚果红溶液染色平板，并用1M化C1脱色。从中获得透明圈较大的菌株，编号为 4-14。取该菌株接种于PDA斜面培养，定期转管并于4°C保存。
[0032] 为确定菌株的最佳生长温度，将预先于PDA平板上培养的菌株4-14打孔（直径 0.8畑1)，取菌饼接种于口04平板（直径6畑1)中央，并于281：、321：、371：、421：和45°。目温 条件下培养，并每天测量菌落直径。结果；菌株在37°C下生长最快（图1-A)。
[003引将菌株分别接种于PDA、MEA、YTO和CYA(查氏）平板，37°C暗培养6-7山观察菌 丝及产抱等情况。在PDA平板，菌落由外至内的菌丝颜色为白、黄和粉红色，产生大量楠圆 或不规则形的子囊果和球状子囊抱子，菌落中央产生褐色色素；在MEA平板上为外周白色 中央黄褐色的菌落，形成大量的子囊果和子囊抱子；在YTO板上则呈现白色菌落，只见菌丝 而未见抱子产生；在CYA板上培养，形成主要为白色略带黄褐色的菌落，能形成少量褐色 分泌物，并形成子囊果和子囊抱子。该菌株的ITS及0 -tubulin序列与NCBI基因数据中 的化penicilliumparvum存在99%的序列一致性，系统进化分析证明其属于微细正青霉 Eupenicilliumparvum。所述培养特征见图1-B。
[0034] WPDA培养获得微细正青霉4-14菌体，W植物基因组提取试剂盒（TransGen，北 京）提取获得总DNA。通过常规PCR，分别W引物对口S1^TS4和Bt2a/化化扩增获得口S和P-tubulin序列。
[00 巧]ITS1 ; 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'
[0036]ITS4;5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'
[0037] Bt2a ;5' -GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3'
[00%]化化；5' -ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'
[0039] 扩增获得目标DNA送上海英駿生物技术公司测序，并对获得序列进行NCBI在线 BLAST化ttp://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast)比对分析。同时，W clustalxl. 83对相关序 列进行列队后W MGA6. 0软件构建序列进化树，确定目标菌株的分类地位。
[0040] 获得的微细正青霉4-14ITS序列（参见序列表SEQIDNO. 5)和0 -tubulin序列 (参见序列表SEQIDNO. 6)，两序列与NCBI基因数据库中的化penicilliumparvum存在 99%的序列一致性，系统进化分析证明其与微细正青霉Eupenici11iumparvum处于同一进 化分支（图2)。进而确定菌株4-14分类地位为微细正青霉化penicilliumparvum。
[0041] 实施例2微细正青霉固态发酵产酶及酶量测定
[004引取少量微细正青霉4-14菌块接种于50血PDA培养液（250-mLS角瓶），37°C、200rpm下振荡培养7d。取ImL菌悬液接入固态发酵培养基中，并于37°C、70%湿度条件下