提高纤维素酶回收再用制备生物乙醇的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提高纤维素酶回收再用制备生物乙醇的方法，属于工业生物技术领域。
【背景技术】
[0002]木质纤维素制备生物乙醇是发展绿色、可持续能源最具潜力的生产路线之一，也是解决资源、环境和能源问题最为行之有效的方法之一。然而，纤维素酶因其活力低、耗量大和成本高的特点，已成为纤维素乙醇商业化进程的主要障碍。目前，通过菌种改造、酶定向进化、改进酶的稳定性和耐受性等手段，纤维素酶活性和产量得以提高，纤维素乙醇生产过程的纤维素酶成本有所降低，但仍然无法满足木质纤维素乙醇生产的经济性要求。因此，为大幅降低纤维素酶成本，纤维素酶高效回收再用工艺的开发强化已成为解决这一问题的重要途径。
[0003]纤维素酶回收再用主要包括外切β -1, 4-葡聚糖酶(CBH)、内切β -1, 4_葡聚糖酶(EG)和纤维二糖酶(CB)三类酶的回收。其中，重吸附法回收纤维素酶工艺简单、设备要求低，适于大规模操作，具有广阔的工业化前景。木质纤维素糖化发酵过程之后溶液中的CBH和EG可以通过重新吸附在新鲜纤维素底物上实现回收再用；而08由于缺乏吸附端无法通过重吸附法回收。因此，重吸附法回收纤维素酶时通常需要重新补加葡萄糖苷酶以获得高乙醇产量。然而，在工业上常用黑曲霉菌株生产葡萄糖苷酶，价格昂贵，其在重吸附回收过程的补加显著增加了纤维素乙醇生产的酶成本。目前，在纤维素乙醇工业化生产工艺中尚缺乏经济可行、简单实用的方法实现纤维素酶回收再用。
【发明内容】
[0004]本发明目的是针对在木质纤维素生产燃料乙醇过程中，通过重吸附法实现纤维素酶回收再用时，需要额外补加β -葡萄糖苷酶的不足，提供一种提高纤维素酶回收再用制备生物乙醇的方法。
[0005]本发明的技术方案概述如下:
[0006]一种提高纤维素酶回收再用制备生物乙醇的方法，包括以下步骤:
[0007]I)原料预处理:将粉碎后的木质纤维素预处理，低温烘干；
[0008]2)配制混合物:按比例将2.5-10g步骤I)得到的木质纤维素与50mL的营养液混合得到混合物I ;
[0009]3)同步糖化发酵:将混合物I置于反应器中，在45_50°C下，按木质纤维素中纤维素的量计算，每g纤维素添加10-50FPU纤维素酶，预酶解12-24小时；降温至30-37°C，添加能分泌β -葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌使浓度为lg/L-5g/L，在30-37°C发酵72-168小时，固液分离，得到发酵液和发酵残渣；
[0010]4)纤维素酶回收再用:在发酵液中加入与步骤2)相同质量的预处理后的木质纤维素，4-250C下吸附60-120min，固液分离，得到液体和固体，所述液体经精馏分离得到乙醇，固体与步骤2)营养液相同体积的营养液混合，得混合物；
[0011]5)再次同步糖化发酵:将步骤(4)获得的混合物置于反应器中，在45-50°C下，添加葡萄糖苷酶，按木质纤维素中纤维素的量计算，每g纤维素添加葡萄糖苷酶0-35CBU，使得β -葡萄糖苷酶加入量与步骤3)加入纤维素酶量的比值< 0.7，在45-50°C下，反应12-24小时；降温至30-37°C，添加能分泌β -葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌使浓度为lg/L-5g/L，在30-37°C发酵72-168小时，固液分离，得到发酵液和发酵残渣；
[0012]6)重复步骤 4)-5)。
[0013]木质纤维素优选粉碎后的玉米芯、甘蔗渣、玉米秸杆、麦杆、稻草、木肩、废纸或柳枝稷。
[0014]步骤(I)预处理的方法优选:稀酸预处理、碱法预处理、机械预处理、生物预处理、氨浸预处理、硫酸-氢氧化钠耦合预处理或硫酸-氨水耦合预处理，最佳选择为:硫酸-氨水耦合预处理。
[0015]本发明的优点:
[0016](I)本发明的方法由于采用了分泌葡萄糖苷酶重组酵母菌，在相同纤维素酶使用量下，可以提高乙醇产量；
[0017](2)本发明的方法可以减少甚至避免补加价格昂贵的葡萄糖苷酶，极大地降低了酶用量和成本；
[0018](3)本发明的方法工艺简单、操作方便、成本低廉，在乙醇工业化生产中有非常重要的应用前景。
【附图说明】
[0019]图1为实施例1中纤维素酶回收再用效果图。
[0020]图2为实施例2中纤维素酶回收再用效果图。
[0021]具体实施方法
[0022]下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0023]下面的实施例是为了使本领域技术人员能够更好地理解本发明，但并不对权利要求作任何限定。
[0024]本发明各实施例采用的能分泌葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌是以中国专利号201110034926.9，发明名称为:编码β -葡萄糖苷酶的基因及重组表达载体及重组酿酒酵母表达菌株及应用公开的“重组酿酒酵母”为例，但并不以此为限定，凡是能分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌均可用于本发明。
[0025]各实施例中用于可以分泌编码葡萄糖苷酶的重组酵母菌的扩大培养的培养基为YPD培养基:
[0026]营养液:在pH = 4.9，50mM柠檬酸钠缓冲液中添加了终浓度为0.5g/L的(NH4)2HPO4,0.025g/L 的 MgSO4.7H20，1.0g/L 的酵母膏，40mg/L 的四环素。
[0027]实施例1
[0028]一种提高纤维素酶回收再用制备生物乙醇的方法，包括以下步骤:
[0029]I)原料预处理:将粉碎后的玉米芯(木质纤维素)通过硫酸-氨水耦合的方法预处理，低温烘干；
[0030]2)配制混合物:将2.5g步骤I)得到木质纤维素与50mL营养液混合得到混合物I ;
[0031]3)同步糖化发酵:将混合物I置于摇瓶中，在50°C下，在摇瓶中添加纤维素酶，按木质纤维素中纤维素的量计算，每g纤维素添加纤维素酶10FPU (纤维素占木质纤维素的质量比为70% )，预酶解12小时；降温至30°C，添加扩大培养后的能分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌使浓度为5g/L，在30°C发酵168小时，固液分离，得到发酵液和发酵残渣；
[0032]4)纤维素酶回收再用:在发酵液中加入2.5g预处理后的木质纤维素，25°C下吸附60min，固液分离，得到液体和固体，所述液体经精馏分离得到乙醇，固体与50mL营养液混合，得混合物；
[0033]5)再次同步糖化发酵:将步骤4)获得的混合物置于摇瓶中，在50°C下，反应12小时；降温至30°C，添加扩大培养后的能分泌β-葡萄糖苷酶的重组酿酒酵母表达菌使浓度为5g/L，在30°C发酵168小时，固液分离，得到发酵液和发酵残渣。
[0034]以乙醇浓度和纤维素酶生产能力为考察指标，评价纤维素酶回收及利用效率，如图1所示。
[0035]第一次同步糖化发酵，即步骤I)-3)，从步骤3)获得的发酵液取微量检测乙醇浓度；
[0036]第二次同步糖化发酵，即步骤5)，从步骤5)获得的发酵液取微量检测乙醇浓度。
[0037]测发酵液中乙醇的浓度:乙醇浓度依次为16.57g/L和13.36g/L，产醇能力回收率分别为80.6%。
[0038]实验证明，用甘蔗渣、稻草、木肩、废纸或柳枝稷替代本实施例的玉米芯，其它同本实施例，其效果与本实施例的效果相似。
[0039]实验证明，用酸预处理、碱法预处理、机械预处理、生物预处理替代本实施例的硫酸-氨水耦合预处理其它同本实施例，其效果与本实施例的效果相似。