一种纤维素酶生产菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学领域，具体涉及一种纤维素酶生产菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的多组分酶的总称，在饲料、酒精、纺织和食品 等领域具有巨大的市场潜力，纤维索酶的来源非常广泛，昆虫、软体动物、原生动物、细菌、 放线菌和真菌等都能产生纤维素酶。长久以来，人们对真菌产酸性纤维索酶研究得最为深 入和广泛，但随着纤维素酶应用领域范围的扩大，传统的真菌产酸性纤维素酶并不能够适 用于所有行业，而细菌产的中性、碱性纤维素酶却在纺织、洗涤剂、造纸，处理环境污染等行 业日益显现出它特有的优势。但是目前国内对于中性、碱性纤维素酶的报道仍很少，大多是 由于细菌产生的纤维素酶活力不高所致，筛选出一株高产中性纤维素酶产生苗及确定其培 养方法显得至关重要。
[0003] 就动物饲料而言，真菌生产的酸性纤维素在上世纪80年代早期就被添加到奶牛， 肉鸡，家猪等畜禽类饲料中，并能显著的提高饲料的利用率及增加畜禽的免疫力。但是酸性 纤维素并不适合水产动物饲料添加及水生环境污染的处理。水产动物和畜禽差别很大，饲 料酶制剂在水产饲料中的应用与畜禽酶制剂的应用有很大的差别。水产动物适宜的生长温 度一般较畜禽低，为15_32°C;鱼类的消化道pH值与畜禽也不一样，很多鱼没有胃，肠道的 pH值为6. 8-7. 3,基本为中性，而畜禽的消化道pH多为酸性；养殖水体一般都处于中性环 境。目前，在现代的水产集约化养殖中广泛存在大量纤维素成分降解不完全的问题，这些问 题一方面造成了动物饲养成本居高不下，另一方面带来大量的环境污染，因此一种适合水 生中性环境的高效表达中性纤维素酶的菌种和体系对水产行业拥有巨大的潜在意义。
【发明内容】
[0004] 发明目的：为了解决现有技术存在的不足，本发明所要解决的第一个技术问题是 提供了一种纤维素酶生产菌。
[0005] 本发明所要解决的第二个技术问题是提供了一种纤维素酶。
[0006] 本发明所要解决的第三个技术问题是提供了 一种纤维素酶的生产方法。
[0007] 本发明所要解决的第四个技术问题是提供了上述纤维素酶在制备水产饲料方面 的应用。
[0008] 技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供了一种纤维素酶生产菌，其特征在 于，其分类命名为巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium)，该菌株已于2015年5月21号 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2015320,保藏地址：湖北省武汉市 武昌区武汉大学保藏中心（武汉大学第一附属小学对面）。该巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium)CCTCCM2015320 的简称命名为SMY0001。
[0009] 该巨大芽孢杆菌系发明人从草鱼肠道中分离筛选得到的。该菌株具有如下特性： SMY0001菌株既可以在酵母膏、LB合成培养基上生长，其主要代谢产物为纤维素酶。生长 pH值范围为5. 5-10. 0,生长温度范围为25-42°C。SMY0001菌体细胞杆状，末端方，成短或 长链。产芽孢，芽孢椭圆形或柱形，中生或近中生。好氧型，革兰氏阳性。SMY0001在细菌培 养基平板（牛肉膏59,蛋白胨109,氯化钠59,琼脂209,蒸馏水1000ml，调pH7. 8-8.2)上的 菌落特征是：形态为圆形，表面粗糙不透明，污白色或微黄色，该菌株鉴定为该巨大芽孢杆 菌（Bacillusmegaterium)〇
[0010] -种纤维素酶，所述纤维素酶来源于所述的纤维素酶生产菌。
[0011] -种纤维素酶的生产方法，通过以所述的纤维素酶生产菌经过诱导培养基振荡培 养高效表达而得到纤维素酶。
[0012] 其中，上述诱导培养基按照质量百分比计算，包括以下组分：羧甲基纤维素钠 1 %、尿素1 %，无机盐1. 5%，水96. 5%。
[0013] 其中，上述振荡培养的温度为28°C，培养时间4天，振荡培养的装置转速为 120-200r/min。
[0014] 其中，上述无机盐为氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸 酶中的一种或一种以上。
[0015] 上述的纤维素酶在制备水产饲料方面的应用。
[0016] 有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：
[0017] 1)本发明提出的方法得到的是在pH中性下适用的纤维素酶，而国内现在一般生 产的都是酸性条件下适用的纤维素酶，中性及碱性纤维素酶在水产养殖应用方面明显优于 酸性纤维素酶；
[0018] 2)使用的菌种为巨大芽孢杆菌，和目前国内一般采用木霉菌作为纤维素酶生产菌 种不同。该方法所使用的巨大芽孢杆菌是一种易于保存、扩增、繁殖快、适合大规模生产的 菌种，可以缩短生产周期；
[0019]3)该方法所制备的纤维素酶活力高、对pH适用范围广稳定性好；
[0020] 4)本发明的巨大芽孢杆菌SMY0001具有很高的产酶能力，可作为饲料添加剂应用 于水产饲料中，能有效提高养殖鱼类的生产性能，应用前景广阔。
【具体实施方式】
[0021] 下面列举实施例对本发明进一步说明，但不因此限制本发明的内容。
[0022] 实施例1巨大芽孢杆菌SMY0001分离筛选及鉴定
[0023] 菌株初筛：采集健康草鱼后肠内容物6份，分别称取0.5g样品，加入4. 5mL无菌 水，制备成悬液，经80°C水浴处理杀死非芽孢营养体后，涂布于羧甲基纤维素钠筛选平板 上，37°C培养48小时，获得18株细菌。
[0024] 实施例2 18株纤维素分解菌的鉴定：
[0025] 将18株纤维素分解菌培养液收集后，提取基因组DNA，作为模板进行PCR，扩增细 菌的16S全长，PCR产物回收克隆后进行测序，采用BLAST(BasicLocalAlignmentSearch Tool)软件将测序结果在GenBank数据库中进行序列相似性搜索，确定菌种信息。结果表 明，18株细菌中有12株为芽孢杆菌。
[0026] 实施例3、筛选酶活最高的菌种SMY0001:
[0027]制备粗酶液：分别将12株芽孢杆菌接种于羧甲基纤维素的培养基（成分为羧甲基 纤维素钠1%、酵母提取物1%，无机盐1.5% ,96.5%的水，pH7.0)中，55°C培养7天，将 培养液8000r/min离心20min，获得粗酶液。
[0028] CMC酶活的测定：底物使用1 %羧甲基纤维素钠（CMC)，加入适当稀释倍数的酶液， 在50°C、80r/min、pH4-10下反应30分钟，测定酶解产生的葡萄糖量。一个CMC酶活力单位 定义为：标准反应条件下每小时每毫升酶液生成一毫克葡萄糖的酶量，以u/ml表示，从检 测结果中选取出高效表达纤维素酶的巨大芽孢杆菌菌株SMY0001，该菌株保藏于中国典型 培养物保藏中心，该巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium)保藏编号为CCTCCM2015320。
[0029] 实施例4优化诱导条件：
[0030] 不同培养温度和不同诱导时间下SMY0001产酶活力检测
[0031] 设置三个温度梯度，25°C，32°C，40°C，诱导时间为0天，4天，7天，10天，14天，21 天，28天，SMY0001产酶结果如下表：
[0032]
[0033] 可见最适温度为25 °C。
[0034] 设置诱导温度为25°C，不同pH条件下，SMY0001产酶活力检测结果如下表：
[0035]
[0036] 可见最适诱导pH值为7. 0.
[0037]设置诱导温度为25°C，pH值为7. 0,不同氮源条件下SMY0001产酶活力检测；
[0038] 配制5种不同氮源的培养基，不同pH值及不同诱导时间下SMY0001的产酶活 性检测，配置5种不同氮源的培养基：羧甲基纤维素钠0. 8-1 %、氮源0. 8-1 %，无机盐 1. 5-1. 8%，95-97%的水，所用的氮源分别为尿素、蛋白胨、酵母提取物、NH4CL，NaN02。
[0039] 三个不同pH值分别为：4. 0, 5. 5, 7. 0
[0040] 诱导时间为：4天，7天，10天，14天，21天，28天
[0041] 不同诱导条件下SMY0001产酶结果如下表：
[0042]
[0044] 结果表明在氮源为尿素，诱导温度为25°C，pH值为7. 0,诱导时间为4天时， SMY0001的纤维素酶活性达到最高。
[0045] 实施例5三角瓶发酵制备纤维素酶
[0046] 1、斜面培养：在无菌操作条件下，将SMY0001菌株用接种环（内径2. 5mm，取量10 微升，下同）挑一环接入试管斜面培养基中，37°C培养3天；斜面培养基中各成分的质量百 分比为：蛋白胨1. 0%，酵母粉1. 0%，氯化钠0. 5%，磷酸氢二钾0. 1 %，琼脂2. 0%，其余为 水。
[0047] 2、振荡培养：在无菌条件下，将斜面菌种用接种环挑两环接入5ml的试管中，置摇 床上振荡培养8-12小时，培养温度37°C，摇床转速为150r/min。液体培养基中各成分的质 量百分比为：蛋白胨1.0%，酵母粉1.0%，氯化钠0.5%，磷酸氢二钾0. 1%，其余为水。
[0048] 3、然后再在装液量为100ml的500ml三角瓶中用芽孢杆菌做菌种发酵生产中性纤 维素酶，接种量为〇. 1 %体积比，发酵温度为28°C，摇床转速为120-200r/min。其中发酵培 养基中各成分的质量百分比为：羧甲基纤维素钠1%、酵母提取物1%，无机盐1. 5%，其 余为水，pH为7. 0。
[0049] 4、酶活力测定：测定结果表明，pH7. 0时，28°C，培养4天后，该纤维素酶活力达到 420. 5u/ml.实验结果表明，本发明制备得到的纤维素酶在中性和条件下均有很高活力。
[0050] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种纤维素酶生产菌，其特征在于，其分类命名为巨大芽孢杆菌（ aze^ateri?)，该菌株已于2015年5月21号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC M 2015320。2. -种纤维素酶，其特征在于，所述纤维素酶来源于权利要求1所述的纤维素酶生产 菌。3. 权利要求2所述的一种纤维素酶的生产方法，其特征在于，通过以权利要求1所述的 纤维素酶生产菌经过诱导培养基振荡培养高效表达而得到纤维素酶。4. 根据权利要求3所述的一种纤维素酶的生产方法，其特征在于，所述诱导培养基按 照质量百分比计算，包括以下组分：羧甲基纤维素钠1%、尿素1%，无机盐1.5%，水96. 5%。5. 根据权利要求3所述的一种纤维素酶的生产方法，其特征在于，所述振荡培养的温 度为28°C，培养时间4天，振荡培养的装置转速为120-200r/min。6. 根据权利要求4所述的一种纤维素酶的生产方法，其特征在于，所述无机盐为氯化 钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸酶中的一种或一种以上。7. 权利要求2所述的纤维素酶在制备水产饲料方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种纤维素酶生产菌，其分类命名为巨大芽孢杆菌（<i>Bacillus？megaterium</i>），该菌株已于2015年5月21号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？M？2015320。本发明得到的是在pH中性下高活性的纤维素酶，在水洗酶应用方面明显优于酸性纤维素酶，本发明的方法采用的羧甲基纤维素钠作为碳源，其在运输、投料、消毒等方面都优于纤维类原料；以尿素作为可溶性氮源，成本低、制作及使用方便。本发明的方法所制备的纤维素酶活力高、对pH适用范围宽稳定性好、生产周期短。CCTCCM201532020150520
【IPC分类】C12N1/20, A23K1/18, C12R1/11, A23K1/165, C12N9/42
【公开号】CN105039195
【申请号】CN201510267129
【发明人】王桂堂, 熊凡, 吴山功, 邹红, 李文祥
【申请人】中国科学院水生生物研究所, 武汉水梦源生物科技有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年5月22日