专利名称：：一种普鲁兰酶产生菌及其所产生的耐热普鲁兰酶及编码基因的制作方法
技术领域：
：本发明公开了一种普鲁兰酶产生菌及其所产生的耐热普鲁兰酶。
背景技术：
：自上世纪70年代起，酶制剂工业逐渐成为一个重要的产业，目前世界酶制剂总产值达100亿美元，我国的产值约为100亿人民币。随着应用领域的不断扩大和新酶种的开发，酶制剂市场迅速发展。淀粉水解酶作为第二大类酶制剂，在我国乃至世界上都拥有巨大的应用价值，尤其是近年来随着生物质能源开发的兴起，淀粉已成为生产乙醇的重要原料，淀粉水解相关的酶类显示出更加巨大的市场前景(AranoffSL,PearsonDR,OkunDT,LaneCR,WilliamsonIAandPinkertDA.Industrialbiotechnology:DevelopmentandadoptionbytheU.S.Chemicalandbiofuelindustries.U.S.InternationalTradeCommission.Washington,DC.)淀粉酶的研究已经有很长的历史，开发相对也比较完善，在淀粉加工中扮演了重要的角色，但是常用的淀粉酶难作用于淀粉中的α-1，6分支，限制了淀粉的水解效率[3]。普鲁兰酶(Pullulanase,EC.3.2.1.41)，又称去分枝酶，可以特异地水解普鲁兰糖、枝链淀粉等各种分枝多糖分子内的α-1，6-糖苷键，生成相应的麦芽三糖和直链多糖，与糖化酶协同使用，能够显著提高淀粉的水解程度和利用率。在淀粉加工中，普鲁兰酶与糖化酶合用，不仅降低糖化酶的用量一半以上，而且可提高淀粉的转化率，大大降低了生产成本(Deweer,Philippe，Amory,Antoine·Pullulanaseproducingmicroorganisms.(Oct.6，1998)USPatent,5817498)ο与淀粉酶相比，国际上有关普鲁兰酶的研究较少，从1961年Bender和Wallenfels率先从Klebsiellapneumoniae发现普鲁兰酶(Hustedt，H.，K.H.Kroner，W.Stach&M.R.Kula,(1978)Procedureforthesimultaneouslarge-scaleisolationofpullulanaseandl,4-alpha-glucanphosphorylasefromKlebsiellapneumoniaeinvolvingliquid-liquidseparations.BiotechnolBioeng20:1989-2005)，一直到1979年，普鲁兰酶的研究一直停留在产酶微生物的发现和酶学^^±(Mercier,C.,B.M.Frantz&W.J.Whelan,(1972)Animprovedpurificationofeel1-boundpullulanasefromAerobacteraerogenes.EurJBiochem26:1—9;Nakamura,N.,K.Watanabe&K.Horikoshi,(1975)PurificationandsomepropertiesofalkalinepullulanasefromastrainofBacillusno.202-1,analkalophilicmicroorganism.BiochimBiophysActa397:188—193)。上世乡己乂V十年代初，丹麦Novo公司分离到可分解普鲁兰多糖的嗜酸性芽抱杆菌(Bacillusacidopullulyticus)，其产生的普鲁兰酶具有耐热耐酸(60°C，pH4.5)的性质，比较适合淀粉工业生产的需要(Stefanova,Μ.Ε.，R.Schwerdtfeger,G.Antranikian&R.Scandurra，(1999)Heat-stablepullulanasefromBacillusacidopullulyticus:characterizationandrefoldingafterguanidiniumchloride-inducedunfolding.Extremophiles3147-152)。经过投入巨资幵发研究，1983年在日本和欧洲市场同时商业化销售，商品名为ftOmozyme，是如今产量最大、应用最广的普鲁兰酶。1995年杰能科公司利用地衣芽孢杆菌异源表达Bacillusderamificans的普鲁兰酶，并申请了相关专利(Modderman，J.P.&H.H.Foley,(1995)SafetyevaluationofpullulanaseenzymepreparationderivedfromBacilluslicheniformiscontainingthepullulanasegenefromBacillusderamificans.RegulToxicolPharmacol21:375-381)，其酶学特性与Novo公司相似，从而成为普鲁兰酶第二大生产商。由于淀粉工业需要更高的温度来降低底物粘度、提高反应速率和减少污染，相应地需要具有更高的热稳定性和在高温条件下的高活力的普鲁兰酶，因此近年来的研究几乎全部集中在耐热普鲁兰酶的发现和高效表达。2008年Gomes等人报道的来自GeobacillusthermoIeovorans的普鲁兰酶由于在85°C半衰期达到3小时，成为淀粉工业关注的一个新热点(ZouariAyadi，D.，M.BenAli,S.Jemli，S.BenMabrouk,M.Mezghani,E.BenMessaoud&S.Bejar,(2008)Heterologousexpression,secretionandcharacterizationoftheGeobacillusthermoleovoransUS105typeIpullulanase.ApplMicrobiolBiotechnol78:473-481)。同时近年来也涌现了一些相关专利(PhilippeDandAntoineA.Pullulanase.(Jun.1,1995).USpatent5721127；BrianS.M.andJayaramaK.S.Truncatedformsofpullulanase.(Nov.11,2008).USI^tent7449320)，但是总体上由于研究相对较少，研究菌种单一，获得的普鲁兰酶在热稳定性和酶活力上仍然不能满足淀粉糖化工艺的各项要求。目前，我国在普鲁兰酶的研究上距离欧美国家有很大的差距，工业用普鲁兰酶完全依赖进口，定价权掌握在少数外国公司手中，近乎垄断的市场供应导致了国内普鲁兰酶高昂的销售价格，极大的限制了国内相关产业的发展。因此，开发并大量生产具有自主知识产权的耐热普鲁兰酶对我国淀粉工业以及相关产业的发展，摆脱普鲁兰酶对进口的依赖，具有重要的经济和战略意义。
发明内容本发明的目的是提供一种普鲁兰酶产生菌及其所产生的普鲁兰酶及其编码基因。本发明所提供的普鲁兰酶产生菌是分离自云南腾冲地区的栖热菌，为厌氧芽孢杆菌属的一个新菌株(Anoxybacillussp.LM18—11)。本发明所提供的普鲁兰酶是具有下述氨基酸序列特征之一的蛋白质1)具有序列表中的SEQIDNo.2所标示的氨基酸序列。2)将上述氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基插入和/或缺失和/或取代等方式所产生的新序列。序列表SEQIDNo.2所述的蛋白质由707氨基酸残基组成，位于96688位的氨基酸残基序列为典型的I型普鲁兰酶结构域，其中108204位的氨基酸序列为普鲁兰酶N-terminus结构域，263572位的氨基酸序列为α-淀粉酶的催化结构域。上述的蛋白质特异水解α-1，6_糖苷键，是一种I型普鲁兰酶。本发明提供了编码上述普鲁兰酶的基因，是具有下列特征之一的核苷酸序列1)具有序列表SEQIDNo.3所示的DNA序列2)可编码序列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的DNA序列3)在高严谨条件下，可与序列表SEQIDNo.3所限定的DNA序列杂交，且编码上述氨基酸序列的核苷酸序列。上述的高严谨条件可为在5XSSC，5XDenhardt，S溶液，0.05mg/ml鲑鱼精DNA，50%去离子甲酰胺溶液中，65°C下杂交，然后在室温2XSSC,0.1%SDS，在60V下0.5XSSC，0.1%SDS的溶液中，洗膜15分钟，各两次。本发明提供的普鲁兰酶可有效水解普鲁兰糖、枝链淀粉等分子内的α-1，6_糖苷键，在食品、医药、造纸、洗涤等领域有广阔的应用前景。图1质粒pET28a::apulA物理图谱图2普鲁兰糖水解产物液相色谱图A葡萄糖标准品液相色谱图，保留时间约为4.2分钟B麦芽糖标准品液相色谱图，保留时间约为5.8分钟C麦芽三糖标准品液相色谱图，保留时间约为8.1分钟D普鲁兰糖经ApulA水解30分钟后，水解产物的液相色谱3=ApulA的最适反应温度图4=ApulA的最适pH具体实施办法除非有特殊说明，本发明中的实验方法均为常规方法，具体可参见“MolecularCloning:ALaboratoryManual”(SambrookandRussell，ed.2001)。DNA片段回收采用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)，按说明书方法操作；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，按说明书方法操作；限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司；寡核苷酸引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；DNA序列测定由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。25μ1常规PCR反应体系为0.1μg模板DNA、1.5mMMgCl2,20mMTris-HCl(pH8.4)、50mMKC1、0.2mMdNTP混合物、0.2μM正向引物和0.2μM反向引物，以及IUpfu高保真DNA聚合酶(北京全式金生物技术有限公司)。在PCR-热循环仪(Eppendorf，德国)中进行PCR循环反应。1.普鲁兰酶产生菌的分离及鉴定样品采自中国云南腾冲地区轮马温泉下游的淤泥，采样点位于北纬25°25.357、东经98°16.442。实验中，称取Ig土样加入IOOml无菌水，经充分混勻静置30分钟后，取上清液1ml，做适当的梯度稀释，涂布于Thermus固体平板，置于恒温培养箱60°C培养4872小时。待长出Imm左右大小的菌落后，再分别接种至普鲁兰酶筛选培养基，60°C培养48小时后，在平板表面滴加鲁格式碘液，挑选出其中一株有明显普鲁兰水解圈的菌株进行进一步的分析、鉴定。利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取该水解普鲁兰糖菌株的基因组DNA。合成16SrRNA扩增引物5'-AGRGTTTGATCMTGGCTCAG-3‘和5'-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3‘，以上述菌株基因组DNA为模板，按照下列方案进行PCR反应，94°C预变性4分钟后，再94°C变性30秒、55°C复性45秒、72°C延伸1分钟，反应30个循环，最后72°C10分钟。扩增得到一个约1.4kb的DNA片段，对该DNA片段进行序列测定(SEQIDNo.1)，序列分析的结果表明该序列5为16SrRNA片段，经16SrRNA比对分析，结果显示该菌株为厌氧芽孢杆菌属菌株，将其命名为Anoxybacillussp.LM18-11，该菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(登记号CGMCCNo.4320，保藏日期2010年11月10日)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。上述实验中所用的培养基及试剂组成1)Thermus培养基(1000ml):lgtryptone,Igyeastextract,IOOmgNitrilotriaceticacid,60mgCaSO4‘2H20,IOOmgMg2SO4‘7H20,8mgNaCl,103mgKNO3,689mgNaNO3,140mgNa2HPO4‘2H20,0.47mgFeCl3·6H20，2.2mgMnSO4‘H2O,0.5mgZnSO4·7H20,0.5mgH3BO3,25μgCuSO4·5H20,25μgNa2MoO4·2H20,46μgCoCl2·6H20,1.5%agar,pH7.8。2)普鲁兰酶筛选培养基(1000ml):5gtryptone,Igyeastextract,0.7gNaNO3,0.IgNa2HPO4,0.2gMgSO4·7H20，0.IgCaCl2,5gpullulan,1.5%agar。3)鲁格式碘液(300ml):lgI2,2gKI2.厌氧芽孢杆菌普鲁兰酶基因的克隆通过在Genbank数据库中检索，获知在厌氧芽孢杆菌属中，菌株AnoxybacillusflavithermusWKl已完成了全基因组的测序(GenbankAccessionNo.CP000922)，基因组序列预测分析显示，其中编码一个I型的普鲁兰酶，该基因座位被命名为"Aflv_0438"。根据I型普鲁兰酶保守区进行分析，同时参照该序列，合成普鲁兰酶的保守序列引物5，-AGAAGCGGTGGATCCTTAT-3，和5，-CATTTCCAACTCCTGTTCC-3，，以Anoxybacillussp.LM18-11基因组DNA为模板，按照下列方案进行PCR反应，94°C预变性4分钟后，再94°C变性30秒、50°C复性45秒、72°C延伸1分钟，反应30个循环；最后72°C10分钟，扩增得到0.6kb的DNA片段，并对插入片段进行了测序分析(SEQIDNo.3的6731274bp)。以该片段为基础，采用基因组步移技术(GenomeWalkingKit，宝生物工程(大连)有限公司)，最终扩增得到包含一个完整阅读框序列的DNA片段，并测序(SEQIDNo.3)，其中的1402263bp为编码区，被命名为apulA。apulA编码一个由707个氨基酸残基组成的蛋白质(SEQIDNo.2)，被命名为ApulA。功能分析的结果预测ApulA为一个可能的I型普鲁兰酶，位于96677位的氨基酸残基序列为典型的I型普鲁兰酶结构域，其中108204位的氨基酸序列为普鲁兰酶N-terminus结构域，571位的氨基酸序列为α-淀粉酶的催化结构域。3.ApulA的酶学功能及活性分析3.1普鲁兰酶ApulA表达载体的构建以Anoxybacillussp.LM18-11基因组DNA为模板，合成如下引物5，-CCCCCAAAACAACAGTCGT和5，caactcgagACATTGAATTAATACCCACG，按照下列方案进行PCR反应，94°C预变性4分钟后，再94°C变性30秒、60°C复性45秒、72°C延伸2分钟，反应30个循环；最后72°C10分钟，扩增得到2.11Λ的DNA片段，将该片段经)(h0I()酶切回收后，插入到经过NcoI-XhoKNcoI酶切端经Klenow平滑化处理)的大肠杆菌表达载体pET-28a(Novagen公司)上，该重组质粒被命名为pET-28a::apulA(图1)，apulA的3，端融合了6XHis编码序列，表达产物ApulA的3’端会带有一个由6个组氨酸残基组成的His-Tag，可方便用于ApulA的纯化。3.2ApulA的表达及酶活分析将质粒pET18a::apulA转化入大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)，获得ApulA表达菌株BL21/apulA。挑取BL21/apulA单克隆至LB液体培养基(卡那霉素50mg/L)，经370C，220rpm过夜培养，按1%的接菌量加入到新鲜的LB培养基中，37°C，220rpm培养23小时至0D_达到0.6后，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为0.8mmol/L，18°C,160rpm继续培养20小时后，4°C，4000rpm离心10分钟收集菌体，菌体用等体积的0.02mol/LTris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷，pH8.0)悬浮后，4°C，4000rpm离心10分钟收集，用0.05体积的0.02mol/LTris缓冲液(pH8.0)悬浮，超声破碎后，12000g离心5分钟，上清液经0.22μm无菌滤膜过滤，于4°C保存，即获得含有ApulA的粗酶液。ApulA的活性分析是以0.5%普鲁兰糖为底物，加入适量的经适当稀释的粗酶液，在不同的温度和PH条件下酶解20分钟，水解产物经安捷伦高效液相色谱系统鉴定，水解产物为麦芽三糖(图幻，证明ApulA为I型普鲁兰酶；同时水解产生的还原糖经DNS法测定，测定OD54tl光吸收；经计算分析确定ApulA的最适反应pH和最适反应温度，结果显示ApulA的最适反应温度在5560°C之间(表1，图3)，最适反应pH为6.5(表2，图4)，热稳定性分析的结果显示，在PH6.5、60°C的条件下处理80小时，ApulA仍具有50%以上的活性(表3)。表IApulA的最适反应温度权利要求1.本发明提供了一个普鲁兰酶产生菌，在分类上属于厌氧芽孢杆菌属的一个种，其16SrRNA的序列特征为序列表SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。2.本发明提供了一个上述权利要求中提到的产生菌所产生的蛋白质，其序列特征为具有序列表SEQIDNo.2所示的氨基酸序列，或者将该序列经一个或几个氨基酸残基插入和/或缺失和/或取代等方式所产生的氨基酸序列。3.本发明提供了一个可编码上述权利要求中所述蛋白质的核酸序列。4.在上述权利要求中提到的核酸序列，其序列特征具有下述核苷酸序列之一1)具有序列表SEQIDNo.3所示的DNA序列2)编码序列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的DNA序列3)在高严谨条件下，可与序列表SEQIDNo.3所限定的DNA序列杂交，且编码上述权利要求中所限定的氨基酸序列的核苷酸序列。5.权利要求2中所述的蛋白质可以特异水解普鲁兰糖、枝链淀粉等的α-1，6-糖苷键，是一种I型普鲁兰酶(Rillulanase)。全文摘要本发明描述了一个新分离的普鲁兰酶产生菌，16SrRNA(SEQIDNo.1)结果分析表明该菌为厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillussp.)，由该菌所分泌的一种蛋白质，其序列特征为序列表所示的氨基酸序列，编码该蛋白的核酸序列为序列表SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，该蛋白质特异水解普鲁兰糖分子内的α-1，6-糖苷键，生成麦芽三糖，是一个I型普鲁兰酶(Pullulanase)，该酶的最适反应温度为60℃，最适pH6.5，在60℃、pH6.5条件下80小时，仍具有50％以上的活性。文档编号C12N1/20GK102120971SQ20101057683公开日2011年7月13日申请日期2010年12月2日优先权日2010年12月2日发明者宋诙,徐健勇,李丽,谭明,郑雯申请人:天津工业生物技术研究所