专利名称：一种同时纯化和固定化亚油酸异构酶的方法
技术领域：
本发明属于酶纯化和固定化领域，具体涉及一种同时纯化和固定化亚油酸异构酶 的方法。
背景技术：
亚油酸异构酶通常用于将亚油酸转化为共轭亚油酸，而共轭亚油酸具有许多重要 生理作用抗癌；抗氧化；降低胆固醇；抑制脂肪积累；防治糖尿病；抗粥状动脉硬化；改善 骨组织代谢等作用；目前，人体必需脂肪酸共轭亚油酸在医药保健、食品、饲料等方面的应 用潜力受到越来越多的关注。
目前共轭亚油酸生产主要采用化学法，如亚油酸的碱法异构化，但化学法得到的产物 为一系列具有共轭双键的所有位置和几何异构体的CLA混合物，同时还有副产物存在，而 要分离获得单一异构体非常困难；故生物法尤其是酶法合成共轭亚油酸受到了越来越多的 关注，酶法生产目前大多采用游离亚油酸异构酶，但游离酶性质不稳定，反应后游离酶难以 回收再利用，不利于产品的后续分离纯化且获得游离酶的纯化步骤多，收率较低。孙琪所述 东北林业大学硕士论文乳杆菌亚油酸异构酶转化沙棘共轭亚油酸工艺的研究一文报道了 乳酸杆菌的亚油酸异构酶的固定化工艺研究，该工艺可制备固定化亚油酸异构酶，但是其 首先要对发酵液进行离心，收集菌体，超声结合溶菌酶破壁后二次超声处理，Tritron-IOO 提取，离心，硫酸铵分级盐析、酶液透析、浓缩等多步分离手段获得粗酶液，再采用海藻酸 钠-氯化钙包埋法固定，该方法的特点是先初步纯化酶液、再应用载体进行固定化，而分步 实施具有成本高、能耗大、操作繁琐、步骤多等诸多缺点。专利申请号为200610039833. 4的 专利公开了一种固定化脂肪酶凹凸棒土的制备方法，该专利以纯化过的商品脂肪纯酶制成 酶液，然后采用的是适合脂肪酶固定化的凹凸棒土改性方法，该方法的缺点是必须首先得 到纯酶，然后才能固定化。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时纯化和固定化亚油酸异构酶的方法，应用改性凹 凸棒土作为原料和载体，操作简便，成本低廉，同时纯化和固定化。本发明的技术解决方案是该纯化和固定化方法包括以下步骤
(1)按安徽农业科学2010年15期所述文章“德氏乳杆菌保加利亚亚种产亚油酸异构 酶研究制备”的记载制备亚油酸异构酶发酵液，SOOOrpm离心lOmin，收集菌体，按发酵液 缓冲液为5:2的体积比将菌体悬浮于0. lmol/L pH=6. 0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中得 缓冲液，同时添加质量占缓冲液体积0. 5%的溶菌酶及质量占缓冲液体积0.洲的蜗牛酶，搅 拌60min，离心lOmin，得上清粗酶液，在粗酶液中添加质量占缓冲液体积0. 0 的阳离子聚 丙烯酰胺絮凝剂，搅拌10-15min，过滤，收集滤液；
(2)按滤液与改性凹凸棒土以质量比4:1比例向依据步骤1获得的滤液中加入改性凹 凸棒土，室温搅拌10-1 ，真空过滤，得纯化和固定化亚油酸异构酶。
其中，所述改性凹凸棒土的制备包括以下步骤将一定量的凹凸棒土加入到带有 搅拌和冷凝装置的三颈瓶中，按1 12的质量/体积比加入2mol/L的盐酸，搅拌回流l_3h， 用3mol/L的氢氧化钠溶液调节pH3. 5，搅拌均勻，过滤，干燥，得酸改性凹凸棒土 ；将酸改性 凹凸棒土按1:1的质量体积比加入2mol/L的硫酸镁溶液，室温搅拌池，过滤，干燥，得硫酸 镁处理凹凸棒土 ；硫酸镁处理凹凸棒土中按1:1:1:2-3的质量比加入Y-(甲基丙烯酰氧) 丙基三甲氧基硅、水、二甲苯，充分搅拌混合M_30h，过滤，水洗，干燥，得改性凹凸棒土。其中，所述阳离子型聚丙烯酰胺絮凝剂的分子量600万-800万。本发明的有益效果是
1.纯化和固定化亚油酸异构酶的原料是改性凹凸棒土，而我国凹凸棒土资源丰富，利 用凹凸棒土作为原料，不仅成本低廉，而且扩大了凹凸棒土的应用范围。2.本发明提供的亚油酸异构酶的纯化和固定化仅需一步，省去了多步，不仅降低 了生产成本，更有效缩短了步骤和时间，并且该方法稳定可靠，易于大规模生产。3.采用分子量为600万-800万阳离子型聚丙烯酰胺絮凝剂处理发酵液，不仅可除 去菌体，还可除去大部分的杂蛋白和离子，同时省去离心、层析等多步操作，大大降低了生 产成本和能耗。4.本发明方法操作简便可靠，条件温和，固定化效率高，且省却了游离酶的纯化过 程，大大降低了生产成本。5.本发明将酶的纯化过程和固定化过程有机结合起来，在固定化的同时实现酶的 高效纯化，在纯化的同时实现酶的固定化，将多步反应集成在一步反应中，实现了酶的廉价 高效生产，属于原创性工作。6.固定化酶具有较好的pH适应性、温度稳定性及操作稳定性，在pH5. 5-8. 5之间 具有较好的适应性，重复使用13次，酶活仍可保留60%以上。7.凹凸棒土作为载体，质量可靠，生物稳定性和生物相容性较好。8.本发明利用改性凹凸棒土将亚油酸异构酶的纯化过程和固定化结合起来，在 纯化的过程中将酶同时实现固定化，将纯化过程和固定化过程一步高度耦合，实现酶的高 效低成本生产，该方法具有低成本、低能耗、操作简便等优点。
图1游离酶与纯化和固定化酶的最适温度比较。图2游离酶与纯化和固定化酶的最适pH比较。图3游离酶与纯化和固定化酶的温度稳定性比较。图4纯化和固定化酶的重复使用效果图。
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明的技术解决 方案并不限于下述的实施例。实施例1
将5g凹凸棒土加入到带有搅拌和冷凝装置的三颈瓶中，加入2mol/L的盐酸60ml，搅拌 回流lh，用3mol/L的氢氧化钠溶液调节pH3. 5，搅拌均勻，过滤，干燥，得酸改性凹凸棒土 ；将酸改性凹凸棒土加入到5ml的2mol/L的硫酸镁溶液，室温搅拌池，过滤，干燥，得硫酸镁 处理的凹凸棒土 ；硫酸镁处理的凹凸棒土中分别加入5ml γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧 基硅、5ml水和IOml 二甲苯，充分搅拌混合Mh，过滤，水洗，干燥，得改性凹凸棒土。按安徽农业科学2010年15期所述文章“德氏乳杆菌保加利亚亚种产亚油酸异构 酶研究制备”的记载制备亚油酸异构酶发酵液，取50ml亚油酸异构酶发酵液，SOOOrpm离心 IOmin,收集菌体，将菌体悬浮于20ml的0. lmol/L pH6. 0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中， 同时添加0. Ig溶菌酶及0. 04g蜗牛酶，搅拌40min，6000rpm离心lOmin，得上清粗酶液，在 粗酶液中添加0. 004g分子量600万聚丙烯酰胺絮凝剂，搅拌lOmin，过滤，收集滤液；将5g 改性凹凸棒土加入到滤液中，室温搅拌10h，真空过滤，得固定化亚油酸异构酶。实施例2
将20g凹凸棒土加入到带有搅拌和冷凝装置的三颈瓶中，加入2mol/L的盐酸MOml， 搅拌回流池，用3mol/L的氢氧化钠溶液调节pH3. 5，搅拌均勻，过滤，干燥，得酸改性凹凸棒 土 ；将酸改性凹凸棒土加入到20ml的2mol/L的硫酸镁溶液，室温搅拌池，过滤，干燥，得硫 酸镁处理的凹凸棒土 ；硫酸镁处理的凹凸棒土中分别加入20ml 甲基丙烯酰氧)丙基三 甲氧基硅、20ml水和50ml 二甲苯，充分搅拌混合27h，过滤，水洗，干燥，得改性凹凸棒土。按安徽农业科学2010年15期所述文章“德氏乳杆菌保加利亚亚种产亚油酸异构 酶研究制备”的记载制备亚油酸异构酶发酵液，取200ml亚油酸异构酶发酵液，SOOOrpm离 心lOmin，收集菌体，将菌体悬浮于80ml的0. lmol/L pH6. 0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液 中，同时添加0. 4g溶菌酶及0. 16g蜗牛酶，搅拌40min，6000rpm离心lOmin，得上清粗酶液， 在粗酶液中添加0. 016g分子量为700万聚丙烯酰胺絮凝剂，搅拌12min，过滤，收集滤液； 将20g改性凹凸棒土加入到滤液中，室温搅拌13h，真空过滤，得固定化亚油酸异构酶。实施例3
将50g凹凸棒土加入到带有搅拌和冷凝装置的三颈瓶中，加入2mol/L的盐酸600ml， 搅拌回流池，用3mol/L的氢氧化钠溶液调节pH3. 5，搅拌均勻，过滤，干燥，得酸改性凹凸棒 土 ；将酸改性凹凸棒土加入到50ml的2mol/L的硫酸镁溶液，室温搅拌池，过滤，干燥，得硫 酸镁处理的凹凸棒土 ；硫酸镁处理的凹凸棒土中分别加入50ml 甲基丙烯酰氧)丙基三 甲氧基硅、水和150ml 二甲苯，充分搅拌混合30h，过滤，水洗，干燥，得改性凹凸棒土。按安徽农业科学2010年15期所述文章“德氏乳杆菌保加利亚亚种产亚油酸异构 酶研究制备”的记载制备亚油酸异构酶发酵液，取500ml亚油酸异构酶发酵液，SOOOrpm离 心lOmin，收集菌体，将菌体悬浮于200ml的0. lmol/L pH6. 0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶 液中，同时添加Ig溶菌酶及0. 4g蜗牛酶，搅拌40min，6000rpm离心lOmin，得上清粗酶液， 在粗酶液中添加0. 04g分子量为800万聚丙烯酰胺絮凝剂，搅拌15min，过滤，收集滤液；将 50g改性凹凸棒土加入到滤液中，室温搅拌15h，真空过滤，得固定化亚油酸异构酶。酶吸附量的测定采用Bradford法，牛血清蛋白作为标准品，测定固定化酶水洗 液中亚油酸异构酶的浓度和经过改性凹凸棒土纯化和固定化后残留亚油酸异构酶的浓度 及酶液浓度，计算亚油酸异构酶在改性凹凸棒土上固定化量。酶活力定义游离酶酶活定义参见“德氏乳杆菌保加利亚亚种产亚油酸异构酶研 究制备”，安徽农业科学2010年15期所述文章。固定化酶酶活测定取胡麻油lml，2ml吐温80定容到100ml，充分搅拌乳化lh，
50. 22um滤膜过滤备用；取凹凸棒土纯化和固定化酶3g放入20ml试管，加入0. Imo 1/L pH=6. 0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液5ml，底物0. 2ml,200rpm恒温30度震荡反应4h后，加 入10%三氯乙酸终止反应，向试管中加入8ml正己烷，针对萃取共轭亚油酸，离心破乳取有 机相，应用分光光度法测定其中233nm的吸光值，以不加凹凸棒土固定化酶为空白补加等 量缓冲液，样品的吸光值减去空白的吸光值即为自定义固定化酶活。
实施例1得到的纯化和固定化酶与游离酶的最适温度比较如图1所示；实施例2 得到的纯化和固定化酶与游离酶的最适PH比较如图2所示；实施例3得到的纯化和固定化 酶与游离酶的温度稳定性比较如图3所示；实施例3得到的纯化和固定化酶的重复使用效 果如图4所示。
权利要求
1.一种同时纯化和固定化亚油酸异构酶的方法，其特征在于该纯化和固定化方法包括 以下步骤(1)按安徽农业科学2010年15期所述文章“德氏乳杆菌保加利亚亚种产亚油酸异构 酶研究制备”的记载制备亚油酸异构酶发酵液，SOOOrpm离心lOmin，收集菌体，按发酵液 缓冲液为5:2的体积比将菌体悬浮于0. lmol/L pH=6. 0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液中得 缓冲液，同时添加质量占缓冲液体积0. 5%的溶菌酶及质量占缓冲液体积0.洲的蜗牛酶，搅 拌60min，离心lOmin，得上清粗酶液，在粗酶液中添加质量占缓冲液体积0. 0 的阳离子聚 丙烯酰胺絮凝剂，搅拌10-15min，过滤，收集滤液；(2)按滤液与改性凹凸棒土以质量比4:1向依据步骤(1)获得的滤液中加入改性凹凸 棒土，室温搅拌10-1 ，真空过滤，得纯化和固定化亚油酸异构酶。
2.根据权利要求1所述的同时纯化和固定化亚油酸异构酶的方法，其特征在于所述改 性凹凸棒土的制备包括以下步骤将一定量的凹凸棒土加入到带有搅拌和冷凝装置的三颈 瓶中，按1 12的质量/体积比加入2mol/L的盐酸，搅拌回流l_3h，用3mol/L的氢氧化钠溶 液调节PH3. 5，搅拌均勻，过滤，干燥，得酸改性凹凸棒土 ；将酸改性凹凸棒土按1:1的质量 体积比加入2mol/L的硫酸镁溶液，室温搅拌3h，过滤，干燥，得硫酸镁处理凹凸棒土 ；硫酸 镁处理凹凸棒土中按1:1:1:2-3的质量比加入Y-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅、水、 二甲苯，充分搅拌混合M_30h，过滤，水洗，干燥，得改性凹凸棒土。
3.根据权利要求1所述的同时纯化和固定化亚油酸异构酶的方法，其特征在于阳离 子型聚丙烯酰胺絮凝剂的分子量600万-800万。
全文摘要
本发明公开了一种同时纯化和固定化亚油酸异构酶的方法，凹凸棒土盐酸处理，氢氧化钠溶液调节pH，搅拌均匀，过滤，水洗，干燥，得酸改性凹凸棒土；酸改性凹凸棒土与硫酸镁溶液混合，搅拌，过滤，干燥得硫酸镁处理凹凸棒土；硫酸镁处理凹凸棒土与γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅、水、二甲苯搅拌混合，过滤，水洗，干燥，得改性凹凸棒土；产自德氏乳杆菌保加利亚亚种亚油酸异构酶酶液和改性凹凸棒土混合，搅拌，过滤，干燥，得纯化固定化亚油酸异构酶。该酶纯化和固定化方法简便，步骤少，成本低，纯化效果好，固定化效率高，纯化过程酶活回收率达60%以上，固定化酶具有较好的pH适应性、热稳定性及操作稳定性。
文档编号C12N9/90GK102093994SQ201010576488
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月7日 优先权日2010年12月7日
发明者固旭, 尹秀莲, 游庆红, 贾建波 申请人:淮阴工学院