专利名称：制备抗蓝耳病转基因猪的方法
技术领域：
本发明涉及动物转基因技术，具体涉及一种制备抗蓝耳病的转基因猪的方法。
背景技术：
ItMM^BfnS^'nSE (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)，俗称蓝耳病，是由猪繁殖与综合症病毒(PRRSV)所引起的一种传染性疾病。该病于 1987年在美国首次发现，2006年我国部分省市猪群暴发高致病性蓝耳病，且该病毒与经典 的蓝耳病病毒相比，基因发生了较大的变异，具有很强的致病性。在PRRSV的大流行中PRRS造成的经济损失早已经为人们所熟知。据估计PRRS给 美国养猪生产者造成的损失每年达5. 6亿美元(Cho and Dee，2006)。我国是养猪大国，几 乎占世界养猪总量的一半。随着猪集约化和规模化养殖的发展，猪的传染性疾病发病率增 高，特别是近几年爆发的“无名高热病”等带来的损失都是每年以亿元为计算单位，给养猪 业带来巨大损失，极大地挫伤了养猪者的积极性。同时，2007-2008年猪肉价格一涨再涨，以 至使猪肉价格创历史最高记录，极大地影响了人们生活。目前在病毒防治中主要采用疫苗，许多学者对PRRS病毒进行了较深入的研究，并 在此基础上研制了弱毒苗、灭活苗和基因工程疫苗，试图通过免疫途径控制该病，但是由于 蓝耳病病毒能导致猪持续感染、病毒血症及免疫性能低下，至今还没有能有效地控制PRRS 的技术和措施。此外，PRRSV感染可引起机体的细胞免疫功能低下，而体内高水平的病毒特 异性抗体又不足以清除病毒，造成病毒在猪体内的持续性感染(Pirzadeh and Dea, 1998), 这给PRRSV的防治带来很大的困难，也对现行的免疫策略和疫苗研制手段提出了严峻的挑 战。许多国家包括美国已将蓝耳病列为危害最大和控制最难的猪传染病。RNA干涉(RNAi)是指双链RNA特异性诱导同源靶基因表达沉默的现象，它具有高 度特异性，能快速引发转录后基因沉默。RNA干涉是由21 23个核苷酸组成的双链RNA引 发的，小干涉RNA(SiRNA)可以在体外化学合成，也可通过表达载体转录而成，它参与降解 同源靶基因、抵御病毒入侵、抑制转座子等，将是基因功能研究、病毒防治、疾病治疗和品种 改良等的有力工具。研究证实，RNAi能够抑制病毒基因的复制、阻止病毒粒子的装配及影响病毒与宿 主之间的相互作用，RNAi用于抗病毒研究的唯一前提是已知病毒基因组序列，且siRNA能 快速、高效、特异地降解同源mRNA而不产生任何副作用，从而成为抗病毒感染的有效手段。 并在抗病毒研究方面已经取得了显著成效。口蹄疫病毒(FMDV)是感染偶蹄动物的危险病毒。Kahana等针对所有FMDV的3个 保守区设计了 3个特殊的siRNA，细胞结果显示与对照相比，几乎显示了 100%的生长抑制 作用。Liu等针对FMDV基因组的保守区域5 ‘NCR，VP4，Vpg，P0L，3’ NCR设计了 siRNA，转 染后12h使BHK221细胞系FMDV的效价下降10倍，1000倍，且这种抑制作用可持续至转然 后第6d。针对FMDV基因组的保守区设计的siRNA能抑制FMDV病毒的复制，是治疗高基因 变化的FMDV病毒的新策略。
禽流感病毒H5m已经在人类和禽类中引起了广泛的呼吸系统疾病，但目前的疫 苗免疫和药物治疗都存在局限。Zhou等针对流感病毒基因组的保守区域设计了特异的 siRNA(pBabe-NP、pBabe-PA、pBabe_PBl)，受孕鸡卵和BALB/c小鼠中显示了明显抑制流感 病毒的复制增殖。其中PBabe-NP抑制禽流感病毒增殖的特异性最好。RNAi技术提供了预 防和治疗禽流感病毒在人类和禽类中传染的方法。近年来，由虹彩病毒弓I起的爬行动物、两栖动物和鱼类疾病已在美洲、欧洲、亚洲 和澳洲等地普遍流行，真鲷虹彩病毒(RSIV)能引起海洋鱼类产生疾病。Dang等构建了靶向 RSIV中编码病毒衣壳蛋白基因(MCP)的siRNA，在转染感染了病毒的细胞后的84h和94h 后，对病毒MCP基因表达的抑制达到55. 2%和97. 1%。同时，病毒的增殖也被抑制了，表明 针对MCP基因的siRNA干扰作用能特异和有效阻止RSIV的复制，是一种潜在的控制病毒感 染引起的疾病的方法。显示了 RNAi作为一种基因治疗的手段也可用于水生生物的病毒防 治。传染性法氏囊病(IBD)在鸡群中能引起严重的免疫抑制和高致死率，进而给家 禽业带来巨大的经济损失。为研究RNAi是否能有效抑制传染性法氏囊病毒(IBDV)的复 制，Gao等针对IBDV保守区域的VPl基因设计了 3个短干扰siRNA(siVP1618，siVP11115， 和siVP12571)，然后转染感染了 IBDV的VERO细胞系，结果显示，siVP12571是最有效的控 制IBDV复制的位点，并以该位点设计shRNA，并用鼠U6作为启动子构建了 shRNA表达载体 PEC2571-shRNA,转染感染了 IBDV的VERP细胞，结果显示，该载体对IBDV复制的抑制率达 到87. 4%，该结果表明DNA载体介导的RNAi能有效抑制IBDV的复制。猪瘟病是一种高度传染性疾病，已经在全世界范围引起了严重的经济损失。Xu 等构建了靶向猪瘟病毒(CSFV)Npro和NS5B基因的不同区域的siRNA。结果显示，转染了 siRNA的细胞能使病毒基因组的复制减少4-12倍，设计的3个特异的siRNA抑制病毒增殖 持续72h-84h之久。从当前的研究结果发现，RNAi针对不同基因序列都有效，而且特异性强、效率高， 操作方便。RNA干涉的出现为病毒防治提供了一种新的思路。RNAi在抵抗动物病毒，提高 动物抗病能力和畜牧业经济效益方面具有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备抗蓝耳病转基因猪的方法。为实现上述目的，本发明首先提供一种转基因细胞，其含有编码以蓝耳病病毒 ORFlb, 0RF5、0RF6或0RF7为干扰靶基因的shRNA的DNA。优选所述干扰靶基因为SEQ ID No. 1、2、3和/或4所示的序列。更优选，所述编码shRNA的DNA序列如序列表SEQ ID No. 6&7、SEQ ID No. 8&9、SEQ ID No. 10&11 或 SEQ ID No. 12&13 所示。通过上述编码shRNA的DNA序列克隆到带有重组酶识别序列的重组载体中，转化 宿主细胞，获得转基因细胞。在本发明实施例中，将上述编码shRNA的DNA接入到pPNTIII 载体中。上述细胞为哺乳动物体细胞，例如胎儿成纤维细胞。对于制备抗蓝耳病转基因猪 而言，优选选择猪胎儿成纤维细胞。进一步本发明提供一种制备克隆胚胎的方法，其以上述转基因细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎。进而，通过将上述方法制备的克隆胚胎通过非手术法移入家畜子宫内进行妊娠， 获得抗蓝耳病转基因家畜。本发明还提供一种优选地对蓝耳病病毒具有显著抑制作用的shRNA，编码该 shRNA 的 DNA 序列如序列表 SEQ ID No. 6&7, SEQ ID No. 8&9, SEQ IDNo. 10&11 或 SEQ ID No. 12&13所示。将所述DNA序列克隆到表达载体可以获得编码shRNA的重组载体，进而制 备得到转基因细胞。结果表明这些细胞具有显著的抗蓝耳病病毒能力。本发明通过筛选小干扰RNA，获得了对蓝耳病病毒具有显著抑制活性的shRNA ；通 过将编码所述shRNA的DNA导入表达载体，进而转化宿主细胞，获得了转基因细胞；以所述 转基因细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得 克隆胚胎；将该克隆胚胎通过非手术法移入家畜子宫内进行妊娠，获得转基因家畜。本发明 方法制得的转基因猪具有显著的抗蓝耳病能力。
图1为pSiCHECK -2载体的质粒图谱；图2为0RF1B、5，6和7连接入pMD19-T Simple载体的PCR鉴定结果，其中，M为 DNA分子量标准，泳道1为接入ORFlB的重组载体，泳道2、3为接入0RF5的重组载体，4、5 为接入0RF6的重组载体，6、7为接入0RF7的重组载体；图3为0RF1B、5，6和7连接入pMD19_T Simple载体的酶切鉴定结果；图4显示的是荧光标记的siRNA转染MARC-145细胞；图5显示的是siRNA干扰靶点对目标基因表达的抑制率；图6为pGenesil-Ι载体的质粒图谱；图7为将表2-1中的DNA克隆入pGenesil-l载体的酶切鉴定结果，M为DNA分子 量标准，1 4 分别是 0RF1B-135、0RF1B-372、ORF 6-135 和 ORF 6-169 ；图 8 为 pGenesil-1+2+3+4 载体图谱；图9为图8载体双酶切(BamHI+MluI)鉴定结果；图10为pPNTIII载体图谱；图11为接入hU6+lB-372/6-135的pPNTIII的双酶切鉴定结果；图12显示的是攻毒后72h细胞病变效应；图13每组接种病毒稀释液情况；图14显示的是shRNA在MARC-145细胞中干扰病毒生产情况；图15显示的是24_96h四个时间段的病毒基因的拷贝数；图16显示的是72h病毒基因的拷贝数；图 17 显示的是 pPNTIII lb_372 和 pPNTIII6_135 转染细胞后 24h 的 PKR和 0AS-1 的RT-PCR结果，其中0AS-1泳道组从左到右分别为转染浓度为50nM、100nM、150nM的 pPNTIII lb-372 和 50ηΜ、ΙΟΟηΜ、150nM 的 pPNTIII6_135 的 OAS-I 基因的 RT-PCR 结果，PKR 泳道组从左到右分别为转染浓度为50ηΜ、ΙΟΟηΜ、150nM的pPNTIII lb-372和50ηΜ、ΙΟΟηΜ、 150nM的ρΡΝΤΠΙ6-135的PKR基因的RT-PCR结果，β -actin泳道组从左到右分别为转染 浓度为 50ηΜ、ΙΟΟηΜ、150nM 的 pPNTIII lb-372 和 50ηΜ、ΙΟΟηΜ、150nM 的持家基因 β -actin的RT-PCR结果；图18显示的是M蛋白western blot的结果；图 19 是 pPNTIII-shRNAlB-372 和 pPNTIII-shRNA6_135，经 AatII 酶切图；泳道从 左到右分别pPNTIII-shRNAlB-372酶切后、酶切前的电泳结果，以及pPNTIII-shRNA6_135 酶切后、酶切前的电泳结果；图 20 为整合 pPNTIII-shRNAlB-372 和 pPNTIII-shRNA6_135 阳性细胞克隆的二次 PCR鉴定结果，各泳道为不同细胞克隆点的鉴定情况；图21为整合pPNTIII-4shRNA联合质粒的阳性细胞克隆的PCR鉴定结果，各泳道 为不同细胞克隆点的鉴定情况；图22为转基因克隆猪；图23转基因克隆猪PCR扩增结果，从左到右1_7泳道分别是1_7头克隆猪个体的 PCR鉴定情况。；图24为来自转基因猪个体的成纤维细胞攻毒后72h细胞病变效应，其中1号为转 基因阴性猪，3-7号为转基因阳性猪；图25为12_120h九个时间段的病毒基因Ib的表达水平，其中1号为转基因阴性 猪，3-7号为转基因阳性猪；图26为Ib蛋白western blot的结果，其中1号为转基因阴性猪，3-7号为转基因 阳性猪。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 所用试剂均可从商业途径获得。材料MARC-145细胞购于北京信得威特科技有限公司技术中心；双荧光素酶报告基因表达载体psiCHECK -2购于Promega公司(货号C8021)；Dual-Luciferase Reporter Assay System 购于 Promega 公司(货号 E1910)；DharmaFECT Duo 转染试剂购于 Thermo 公司(货号 T-2010-01)；pMD 19-T Simple Vector 购自 Takara 公司(D104)；shRNA表达载体pGenesile-Ι载体购于武汉晶赛生物工程技术有限公司；引物合成和序列测定由上海生工完成；T4DNA连接酶为Biolabs公司产品；Taq酶和核酸内切酶为Takara公司产品质粒纯化及回收试剂盒为Omega公司产品；酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规分子生物学实验操作步骤详见《分子克隆 (第三版)》。实施例1、RNAi载体的构建
1. siRNA干扰靶点的筛选
1. IRNA干扰靶基因的选择近五年来，在我国流行的蓝耳病病毒85%以上均属于JXwn毒株型，该毒株属于 高致病性毒株。本发明选择该病毒的主要结构蛋白基因(0RF5，6，7)及RNA聚合酶基因 (ORFlb)为干扰靶基因。1. 2siRNA序列的设计与合成虽然以JXwn毒株型为目标，但为实现所选干扰靶点利用的最大化，避免因不同毒 株间的序列差异而限制RNAi效应，因此，siRNA的靶序列尽量选择在不同毒株间较为保守 的区域。选择标准以不同毒株间完全一致的序列为最佳，如果达不到该要求，至少满足在不 同毒株中21个核苷酸只有至多1个的错配，所设计的siRNA与已知的任何宿主基因都没有 同源性。利用Invitrogen公司在线软件针对每个目标基因设计5条siRNA干扰序列，共20 条(如表1-1所示)，合成由上海吉玛制药技术有限公司完成。表I-IsiRNA 序列
siRNAs
sense
antisense
lb-1355' -GG ACAUGCUC A AGGUUCAAdtdt-3 ’
lb-3725'-CCACAUGAAGGCAAGUAAUdtdt-3'
lb-7615' -GCCCUCUAGAUGAGGUGUUdtdt-3'
1 b-9475' -CCUUGCUCCCUACUUGUAAdtdt-3'
lb-11535，-G CAGGUAC A ACGCUGCAAUdtdt-3'
5-2525，-GGUAUGUCUUGAGUAGCAUdtdt-3 ’
5-2895' -GGCUGCGCUGAUUUGCUUUdtdt-3'
5-2955 '-GCUGAUUUGCUUUGUCAUUdtdt-3'
5-3425' -GCUACUCUUGUACCAGAUAdtdt-3'
5-4635' -CCUCAAGAGAGUUGUGCUUdtdt-3 ’
6-955' -GCACUUUGAGAGCACAAAUdtdt-3' 6-1355' -GC AGUAGUUGC A CUUCUUUdtdt-3 ’ 6-1695' -CCAUAGAAACCUGGAAAUUdtdt-3 ’ 6-1965'-CCAGAUGCCGUUUGUGCUUdtdt-3'
6-2855'-GCAAAUGAUAACCACGCAUdtdt-3'
7-565 '-GCCAAAUGCUGGGUAAGAUdtdt-3' 7-665' -GGGUAAGAUCAUCGCCCA Adtdt-3' 7-1535'-CCCUCUAGCGACUGAAGAUdtdt-3' 7-2045' -GCAAUUGUGUCUGUCGUCGdtdt-3' 7-2225' -GAUCCAG ACUGCCUUCAAUdtdt-3' scrambled5 ’ -UUCUCCGAACGUGUCACGUdtdt-3' control
5，-UUG AACCUUG AGCAUGUCCdtdt-3' 5，-AUUACUUGCCUUCAUGUGGdtdt-3， 5' - A A C ACCUCAUCUAGAGGGCdtdt-3' 5 ’ -UUAC AAGUAGGGAGCAAGGdtdt-3， 5' -AUUGC AGCGUUGUACCUGCdtdt-3' 5 ’ - AUGCUACUCA AGACAUACCdtdt-3' 5，-AAAGCA AAUCAGCGCAGCCdtdt-3' 5 '-AAUGACAAAGCAAAUCAGCdtdt-3 5，-UAUCUGGUACAAGAGUAGCdtdt-3' 5，-AAGCACAACUCUCUUGAGGdtdt-3' 5'-AUUUGUGCUCUCAAAGUGCdtdt-3， 5'-AAAGAAGUGCAACUACUGCdtdt-3' 5，-AAUUUCCAGGUUUCUAUGGdtdt-3' 5' -AAGCACAAACGGCAUCUGGdtdt-3' 5'-AUGCGUGGUUAUCAUUUGCdtdt-3' 5，-AUCUUACCC AGCAUUUGGCdtdt-3， 5 '-UUGGGCGAUGAUCUUACCCdtdt-3， 5 '-AUCUUCAGUCGCUAGAGGGdtdt-3' 5，-CGACGACAGACACAAUUGCdtdt-3' 5 '-AUUGAAGGCAGUCUGGAUCdtdt-3， 5，-ACGUGACACGUUCGGAGAAdtdt-3，1. 3psiCHECK-2-lB, -5，-6，_7 载体的构建psiCHECK -2载体为起始优化RNAi提供定量而快速的工具。该载体可以监控与 报告基因(海肾萤光素酶)融合的靶基因的表达变化。所研究的基因要克隆在多克隆位点 上。针对所研究基因合成的siRNA起始的RNAi过程将导致融合mRNA的切断及其降解。通 过测量海肾萤光素酶活性的降低来监控RNAi的效果，该载体的图谱如图1所示。
选择pSiCHECK -2载体上的XhoI和NotI酶切位点，完成载体双酶切备用。克隆目标基因1B，5，6禾Π 7的引物设计如表1_2所示(这四个基因的PCR引物均 设计有XhoI和NotI酶切位点，表中斜体字母)，先将1Β，5，6和7连接入pMD19_T Simple 载体，经PCR和酶切鉴定(图2和3所示)，片段大小均与目标基因符合，测序。测序鉴定正确的阳性质粒，经Xho I和No11酶切，酶切产物亚克隆入经Xho I 和NotI酶切的psiCHECK-2载体，最后获得含有目标基因的四种质粒psiCHECK-2_lb， psiCHECK-2-5, psiCHECK-2-6 和 psiCHECK-2-7。表1-2引物序列
权利要求
1.一种转基因细胞，其含有编码以蓝耳病病毒ORFlb、0RF5、0RF6或0RF7为干扰靶基 因的shRNA的DNA。
2.根据权利要求1所述的转基因细胞，其特征在于所述干扰靶基因为SEQIDNo. 1,2,3 和/或4所示的序列。
3.根据权利要求2所述的转基因细胞，其特征在于所述编码shRNA的DNA序列为 Top :GATCCGGACATGCTCAAGGTTCAAttcaagagaTTGAACCTTGAGCATGTCCTTTTTA 0RF1B-135Bottom :AGCTTAAAAAGGACATGCTCAAGGTTCAAtctcttgaaTTGAACCTTGAGCATGTCCG 0RF1B-372 Top :GATCCCCACATGAAGGCAAGTAATttcaagagaATTACTTGCCTTCATGTGGTTTTTA Bottom :AGCTTAAAAACCACATGAAGGCAAGTAATtctcttgaaATTACTTGCCTTCATGTGGG 0RF6-135 Top :GATCCGCAGTAGTTGCACTTCTTTttcaagagaAAAGAAGTGCAACTACTGCTTTTTA Bottom :AGCTTAAAAAGCAGTAGTTGCACTTCTTTtctcttgaaAAAGAAGTGCAACTACTGCG 或0RF6-169 Top :GATCCCCATAGAAACCTGGAAATTttcaagagaAATTTCCAGGTTTCTATGGTTTTTA Bottom :AGCTTAAAAACCATAGAAACCTGGAAATTtctcttgaaAATTTCCAGGTTTCTATGGG。
4.根据权利要求1 3任一项所述的转基因细胞，其特征在于所述细胞为哺乳动物体 细胞。
5.根据权利要求4所述的转基因细胞，其特征在于所述细胞为胎儿成纤维细胞。
6.一种制备克隆胚胎的方法，其以权利要求1 5任一项所述的转基因细胞为核移植 供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得克隆胚胎。
7.一种制备抗蓝耳病转基因家畜的方法，其是将权利要求6所述方法制备的克隆胚胎 通过非手术法移入家畜子宫内进行妊娠，获得抗蓝耳病转基因家畜。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述家畜为猪。
9.一种编码shRNA的DNA，其核苷酸序列为Top :GATCCGGACATGCTCAAGGTTCAAttcaagagaTTGAACCTTGAGCATGTCCTTTTTA 0RF1B-135Bottom :AGCTTAAAAAGGACATGCTCAAGGTTCAAtctcttgaaTTGAACCTTGAGCATGTCCG 0RF1B-372 Top :GATCCCCACATGAAGGCAAGTMTttcaagagaATTACTTGCCTTCATGTGGTTTTTA BottOm :AGCTTAAAAACCACATGAAGGCAAGTAATtctcttgaaATTACTTGCCTTCATGTGGG 0RF6-135 Top :GATCCGCAGTAGTTGCACTTCTTTttcaagagaAAAGAAGTGCAACTACTGCTTTTTA Bottom :AGCTTAAAAAGCAGTAGTTGCACTTCTTTtctcttgaaAAAGAAGTGCAACTACTGCG 或0RF6-169 Top :GATCCCCATAGAAACCTGGAAATTttcaagagaAATTTCCAGGTTTCTATGGTTTTTA Bottom :AGCTTAAAAACCATAGAAACCTGGAAATTtctcttgaaAATTTCCAGGTTTCTATGGG。
全文摘要
本发明提供一种制备抗蓝耳病转基因猪的方法，该方法是通过制备含有编码以蓝耳病病毒ORF1b、ORF5、ORF6或ORF7为干扰靶基因的shRNA的DNA的转基因细胞；以所述的转基因细胞为核移植供体细胞，离体的卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得的克隆胚胎；将所述的克隆胚胎通过非手术法移入家畜子宫内进行妊娠，获得转基因猪。本发明的方法获得的转基因猪具有显著的抗蓝耳病的能力。
文档编号C12N15/11GK102115731SQ20101057646
公开日2011年7月6日 申请日期2010年12月1日 优先权日2010年12月1日
发明者李宁, 李秋燕, 汤波, 郭永臣, 鲍永华 申请人:北京济福霖生物技术有限公司