专利名称：一种提取鱼类粘孢子虫基因组dna方法
技术领域：
本发明涉及一种提取鱼类粘孢子虫基因组DNA方法。
背景技术：
粘孢子虫指粘孢子纲(Myxosporea)的一大类原虫，是在海水及淡水鱼类寄生虫 中种类最多、最为常见的一类孢子虫。粘孢子虫在发育过程中，无例外地产生种种形状和不 同大小的孢子，故称为粘孢子虫。国内外，粘孢子虫病的流行相当普遍和严重，至今仍未有比较有效的控制方法。常 见的防治方法多采用生石灰和石灰氮作器具消毒。在中国各养鱼地区，流行着多种粘孢子 虫病，例如鲢碘孢虫流行于浙江杭州地区以及江苏、湖北、湖南等省，它侵入白鲢的神经系 统和感觉器官，使病鱼体瘦，尾巴上翘，上下打转，不久即死亡；饼型碘泡虫常大量侵袭草鱼 苗的内脏组织和鳃，主要是肠道，严重危害草鱼苗的生产，这种病在中国以广东最为严重; 流行于广东和广西的“埋坎病”，其主要病原体是野鲤碘泡虫。常出现在鲤、鲫鱼皮肤上的鲮 单极虫，往往使鱼体布满白色点状或块状孢囊，严重影响鱼的生长发育，甚至引起死亡。每一种粘孢子虫在寄主中有它的寄生部位。在淡水鱼类中，鳃、肠和胆囊是最常被 侵袭的器官；海洋鱼类的胆囊和膀胱往往寄生1种或多种粘孢子虫。当粘孢子虫感染鱼体 时会形成滋养体，滋养体继续发育，胞核反复多次分裂，形成几个孢母体(sporonts)。孢母 体继续生长发育，其胞核也进行几次分裂，形成6 18个子核，最后形成孢子。滋养体继续 生长，形成的孢子数目也随之增多。在滋养体周围的寄主组织，因不断受刺激而发生退化和 改变，产生一层膜将滋养体包围，出现肉眼可见的白色粘孢子虫孢囊。粘孢子虫的生活史还不完全清楚。对整个生活周期中核的变化、感染方法以及有 无中间寄主等方面，也存在着较多的争论。有研究表明MyxoboIus cerebral is、Ceratomyxa shasta的孢子不能直接感染鲑鱼，需要颤蚓科的蠕虫作为中间宿主，但是也存在鱼与鱼之 间能够直接感染的粘孢子虫种类，如Enteromyxum等。从鱼类宿主中分离粘孢子虫孢子并提取纯化基因组DNA是对粘孢子虫分类鉴定 研究的基础；同时也是防治孢子虫感染的重要研究基础和发展方向。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种提取粘孢子虫基因组DNA方法。本发明提供的提取粘孢子虫基因组DNA方法，包括如下步骤1)将粘孢子虫孢子研磨成粉，加入提取液混勻，得到混合液；2)向步骤1)的混合液中加入氯仿异戊醇混合液混勻、离心，收集上清液；3)向步骤2、得到的上清液中加入氯仿异戊醇混合液混勻，离心，收集上清液；4)向步骤幻得到的上清液中加入异丙醇混勻，静置，收集沉淀；5)将步骤4)得到的沉淀依次进行漂洗、干燥、溶解、RNA消化，得到消化产物；6)将步骤幻得到的消化产物依次用酚氯仿异戊醇混合液和氯仿异戊醇混合液进行抽提，离心、收集上清液；7)向步骤6)得到的上清液中加入3MNaAc水溶液和无水乙醇混勻，静置，离心，收 集沉淀，得到DNA。步骤1)中，所述提取液与所述粘孢子虫孢子的配比为(10ml-50ml) (1. 5g_2g)， 所述提取液与所述粘孢子虫孢子的配比具体为(10ml、40ml或50ml) (1. 5g、1. 8g或2g)；步骤2)中，所述步骤1)的混合液和所述氯仿异戊醇混合液的体积比为 1 (1-2)，所述步骤1)的混合液和所述氯仿异戊醇混合液的体积比具体为1 1、1 1.5 或1 2，步骤3)中，所述步骤2)的上清液和所述氯仿异戊醇混合液的体积比为 1 (1-2)，所述步骤幻的上清液和所述氯仿异戊醇混合液的体积比具体为1 1、1 1.5 或1 2，步骤4)中，所述步骤3)得到的上清液和所述异丙醇的体积比为(1-3) (1-2)； 所述步骤幻得到的上清液和所述异丙醇的体积比具体为1 1、3 2或3 1;所述异丙 醇的温度为-20°C ；步骤幻中，所述漂洗为依次用75% (体积百分含量)乙醇水溶液、75% (体积百 分含量)乙醇水溶液和无水乙醇进行漂洗；所述溶解的方法为用TE缓冲液溶解所述沉淀得到溶液A，TE缓冲液由溶质和溶剂组成，所述溶质为Tris碱、EDTA，所述溶剂为水，所述Tris 碱在所述TE缓冲液中的浓度为10mM，所述EDTA在所述TE缓冲液中的浓度为ImM，用盐酸 调PH值至8.0。所述消化的方法为向所述溶液A中加入RNaseA得到消化产物，RNaseA加入量为 20mg/l 溶液 A ；步骤6)包括如下步骤A)将步骤幻得到的消化产物和是其1倍-3倍体积的酚氯仿异戊醇混合液混勻， 离心，收集上清液A，所述将步骤幻得到的消化产物和是其1倍-3倍体积的酚氯仿异戊醇混合液具体 为将步骤幻得到的消化产物和是其1倍、2倍或3倍体积的酚氯仿异戊醇混合液；B)将步骤A得到的上清液A和是其1倍-3倍体积的氯仿异戊醇混合液混勻，离 心，收集上清液，所述将步骤A)得到的上清液A和是其1倍-3倍体积的氯仿异戊醇混合液具体为 将步骤A)得到的上清液A和是其1倍、2倍或3倍体积的氯仿异戊醇混合液；步骤7)中，所述步骤6)得到的上清液、所述3MNaAc水溶液和所述无水乙醇的体 积比为1 (0.05-0.2) (2-3)，具体为 1 (0·005、0· 1 或 0.2) (2、2.5 或 3)。步骤1)中，所述提取液由溶质和溶剂组成，所述溶质为NaCl、EDTA、SDS、Tris，所 述溶剂为水，所述iTris在所述提取液中的浓度为0. 1M-0. 5M，所述NaCl在所述提取液中的 浓度为0. 4M-0. 6M，所述EDTA在所述提取液中的浓度为0. 005M-0. 015M，；所述SDS在所述 提取液中的浓度为10g/l-20g/l ；所述Tri s在所述提取液中的浓度具体为0. 1M、0. 2M或0. 5M，所述NaCl在所述提 取液中的浓度具体为0. 4M、0. 5M或0. 6M，所述EDTA在所述提取液中的浓度具体为0. 005M、0.0说或0.01511;所述SDS在所述提取液中的浓度具体为10g/l、15g/l或20g/l ；所述提取液的PH值为7. 5 ；步骤2、、步骤幻和步骤6)中，所述氯仿异戊醇混合液均由氯仿和异戊醇组成，所 述氯仿和异戊醇的体积比均为M 1 ；步骤4)中，所述静置时间为20min-40min，所述静置时间具体为20min、30min或 40min ；所述静置的温度为-20°C -4°C，所述静置的温度具体为-20°C、0°C或4°C ；步骤5)中，所述消化的温度为35°C _38°C，所述消化的温度具体为35°C、37°C或 38°C，所述消化的时间为0. 5h-l. 5h，所述消化时间具体为0. 5hUh或1.证；步骤6)中，所述离心的温度为0°C -4°C，所述离心的温度具体为0°C、1°C或4°C， 所述离心的离心力为10000g-13000g，所述离心的离心力具体为10000g、12000g或13000g， 所述离心的时间为5min-15min，所述离心的时间具体为5min、IOmin或15min ；所述酚氯仿异戊醇混合液由酚、氯仿和异戊醇组成，所述酚、氯仿和异戊醇的体积 比为25 24 1 ；所述酚氯仿异戊醇混合液的PH值为8.0 ；步骤7)中，所述离心的温度为0°C -4°C，所述离心的温度具体为0°C、1°C或4°C， 所述离心的离心力为10000g-13000g，所述离心的离心力具体为10000g、12000g或13000g， 所述离心的时间为5min-15min，所述离心的时间具体为5min、IOmin或15min。步骤1)中，所述研磨为在液氮中研磨；步骤2)和步骤3)中，所述离心的温度均为0°C -4°C，所述离心的温度均具体 为0 °C、1°C或4 °C，所述离心的离心力均为IOOOOg-13000g，所述离心的离心力均具体为 IOOOOg, 12000g或13000g,所述离心的时间均为5min_15min，所述离心的时间均具体为 5min、IOmin 或 15min ；步骤7)中，所述静置时间为20min-60min，所述静置时间具体为20min、30min或 60min ；所述静置温度为_70°C _20°C，所述静置温度具体为-70°C、0°C、20°C。所述粘孢子虫为单极虫属、吉陶单极虫CThelohanellus kitauei)。本发明的另一个目的是提供一种分离粘孢子虫孢子的方法。本发明提供的分离粘孢子虫孢子的方法，包括如下步骤a)用PBS缓冲液冲洗粘孢子虫孢子囊，得到粘孢子虫孢子溶液；b)将步骤a)得到的粘孢子虫孢子溶液离心、收集沉淀；c)向步骤b)得到的沉淀中加入PBS缓冲液和SDS水溶液，混合，离心，收集沉淀；d)向步骤c)得到的沉淀中加入PBS缓冲液和SDS水溶液，混合，离心，收集沉淀， 即为粘孢子虫孢子。步骤b)中，所述离心的离心力为5000g-8000g，具体为5000g、6000g或8000g，所 述离心的时间为5min-15min，具体为5min、10min或15min， 步骤c)和步骤d)中，所述PBS缓冲液与所述SDS水溶液的体积比为10 0.5。步骤a)、c)和d)中，所述PBS缓冲液按照如下方法配制将NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4 和水混合得到PBS缓冲液，NaCl在PBS缓冲液中的浓度为8g/l，Na2HPO4在PBS缓冲液的浓 度为2. 2g/l，Na2HPO4在PBS缓冲液的浓度为0. 4g/l ；所述PBS缓冲液的PH值均为7. 0 ；步骤c)和d)中，所述混合的温度均为M°d8°C，所述混合的温度均具体为
7M °C、25 °C或观°C，所述混合的时间均为5min-l5min，所述混合的时间均具体为5min、 IOmin或15min，所述混合的方式均为颠倒混合；所述SDS水溶液的浓度均为200g/l。步骤c)和d)中，所述离心的离心力均为6000g-10000g，所述离心的离心力均具 体为6000g、8000g或10000g，所述离心的时间均为5min_15min，所述离心的时间均具体为 5min、IOmin 或 15min。所述粘孢子虫为单极虫属、吉陶单极虫(Thelohanellus kitauei)。所述的方法在粘孢子虫分类鉴定中的应用也是本发明保护的范围。本发明的实验证明，用本方法提取的基因组，经过检测，基因组DNA的纯度高，不 含有宿主的基因，而且提取量多，因此可以用来鉴定粘孢子虫孢子。
图1为DM3粘孢子虫基因组样品PCR扩增结果图2为尾孢虫属孢子形态特征图3为碘泡虫属孢子形态特征图4为单极虫属孢子形态特征图5为染色后单极虫属孢子形态特征
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、提取粘孢子虫基因组DNA方法一一、粘孢子虫基因组DNA提取1、从感染粘孢子虫宿主分离孢子囊粘孢子虫的感染和孢子囊的生长部位具有很高的特异性，因此在取样时只取同一 部位生长的孢子囊。从感染粘孢子虫的死的鲫鱼(Cyprinus carpio)肠道部位中解剖分离出6个粘孢 子虫孢子囊，分别编号为DM1-DM6。 2、从孢子囊中分离粘孢子虫孢子颗粒用灭菌的PH值为7. 0的PBS小心将孢子颗粒从1个孢子囊(DMl)中冲洗出，操作 中尽量细致，防止孢子囊壁的组织细胞混入孢子颗粒中，即得到含有粘孢子虫孢子的样品。将样品转移至50ml离心管4°C保存。PBS缓冲液按照如下方法配制将NaCl、Na2HP04、NaH2PO4和水混合，NaCl在PBS缓 冲液中的浓度为8g/l，Na2HPO4在PBS缓冲液的浓度为2. 2g/l，Na2HPO4在PBS缓冲液的浓 度为 0. 4g/l。3、去除粘孢子虫混有的宿主细胞将得到的含有粘孢子虫孢子的样品以6000 X g离心lOmin，小心倒掉上清液；向沉 淀中加入IOml灭菌PH值为7. 0的PBS，再加入0. 5ml浓度为200g/l的SDS水溶液，至其终 浓度达到10g/l，在25°C处理IOmin期间颠倒混勻，再以8000X g离心IOmin小心倒掉上清液；向离心管中加入灭菌PBS，重悬孢子，再重复SDS处理操作两次；操作过程中不断进行镜 检，观察孢子沉淀情况及孢子纯度，将得到的粘孢子虫孢子沉淀置于_20°C保存。4、应用液氮研磨的方法提取基因组DNA取上述2. Og粘孢子虫孢子沉淀在液氮中迅速研磨成粉；加入IOmL提取液，快速 振荡混勻；加入等体积的的氯仿异戊醇混合液(氯仿异戊醇的体积比为M 1)混勻，以 ( ，^， (^，离心川！^!!。上清液再用等体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿异戊醇的体积比 为对1)抽提一次。以4°C，12，000g，离心lOmin。取上清液，加入2/3倍体积的_20°C预 冷的异丙醇沉淀，混勻，静置约30min。用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75%乙醇反复漂洗数 次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ulTE中，加入1μ lRNaseA(10mg/mL)，37°C下 处理lh，得到的消化产物和是其1倍体积酚氯仿异戊醇混合液(pH8. 0，酚氯仿、异戊醇的体 积比为25 24 1)混合，以4°C，12，000g，离心lOmin。取上清液A，将上清液A和是其1 倍体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿异戊醇的体积比为M 1混勻，以41，12，00(^，离心 IOmin0取上清液，加入1/10倍体积的3MNaAc水溶液，2. 5倍体积的无水乙醇，_70°C静置沉 淀30min。沉淀用75%乙醇漂洗，风干，溶于200ulTE中，得到DNA样品，命名为DM1，_20°C 保存。DNA提取液由溶质和溶剂组成，所述溶质为NaCl、EDTA、SDS、Tris，所述溶剂为水， 所述Tris在所述提取液中的浓度为0. 2M，所述NaCl在所述提取液中的浓度为0. 5M，所述 EDTA在所述提取液中的浓度为0. OlM ；所述SDS在所述提取液中的浓度为15g/l ；DNA提取 液的PH值为7.5。TE缓冲液由溶质和溶剂组成，所述溶质为Tris碱、EDTA，所述溶剂为水，所述Tris 碱在所述Tris碱中的浓度为10mM，所述EDTA在所述TE缓冲液中的浓度为ImM，用盐酸调 PH值至8. O。方法二一、粘孢子虫基因组DNA提取1、从感染粘孢子虫宿主分离孢子囊粘孢子虫的感染和孢子囊的生长部位具有很高的特异性，因此在取样时只取同一 部位生长的孢子囊。从感染粘孢子虫的死的鲫鱼(Cyprinus carpio)肠道部位中分离出粘孢子虫孢子囊。2、从孢子囊中分离粘孢子虫孢子颗粒用灭菌的PH值为7. 0的PBS小心将孢子颗粒从1个孢子囊中冲洗出，操作中尽量 细致，防止孢子囊壁的组织细胞混入孢子颗粒中，即得到含有粘孢子虫孢子的样品。将样品转移至50ml离心管4°C保存。PBS缓冲液按照如下方法配制将NaCl、Na2HP04、NaH2PO4和水混合，NaCl在PBS缓 冲液中的浓度为8g/l，Na2HPO4在PBS缓冲液的浓度为2. 2g/l，Na2HPO4在PBS缓冲液的浓 度为 0. 4g/l。3、去除粘孢子虫混有的宿主细胞将得到的含有粘孢子虫孢子的样品以5000Xg离心5min，小心倒掉上清液；向沉 淀中加入IOml灭菌PBS，再加入0. 5ml浓度为200g/l的SDS水溶液，至其终浓度达到IOg/L，在24°C处理5min期间颠倒混勻，再以6000Xg离心5min小心倒掉上清液；向离心管中 加入灭菌PBS，重悬孢子，再重复SDS处理操作两次；操作过程中不断进行镜检，观察孢子沉 淀情况及孢子纯度，将得到的粘孢子虫孢子沉淀置于_20°C保存。4、应用液氮研磨的方法提取基因组DNA取上述1. 5g粘孢子虫孢子沉淀在液氮中迅速研磨成粉；加入40mL提取液，快速 振荡混勻；加入1.5倍体积氯仿异戊醇混合液(氯仿异戊醇的体积比为M 1)混勻，以 !^ ， (^，离心日！^!!。上清液再用1.5倍体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿异戊醇的体 积比为M 1)抽提一次。以0°C，10，000g，离心5min。取上清液，加入等体积的_20°C预 冷的异丙醇沉淀，混勻，静置约20min。用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75%乙醇反复漂洗数 次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ulTE中，加入1 μ IRNaseA (10mg/mL)，下处 理0. ！。得到的消化产物和是其2倍体积酚氯仿异戊醇混合液(pH8.0，酚氯仿、异戊醇的 体积比为25 24 1)混合，以0°C，10，000g，离心5min。取上清液A，将上清液A和是其 2倍体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿异戊醇的体积比为M 1混勻，以0°C，10，000g，离心 5min。取上清液，加入0. 005倍体积的3MNaAc水溶液，2倍体积的无水乙醇，0°C静置沉淀 20min。沉淀用75%乙醇漂洗，风干，溶于200ulTE中，得到DNA样品，命名为DMl，-20°C保 存。DNA提取液由溶质和溶剂组成，所述溶质为NaCl、EDTA、SDS、Tris，所述溶剂为水， 所述Tris在所述提取液中的浓度为0. 1M，所述NaCl在所述提取液中的浓度为0. 4M，所述 EDTA在所述提取液中的浓度为0. 005M ；所述SDS在所述提取液中的浓度为10g/l ；DNA提取 液的PH值为7.5。TE缓冲液由溶质和溶剂组成，所述溶质为Tris碱、EDTA，所述溶剂为水，所述Tris 碱在所述Tris碱中的浓度为10mM，所述EDTA在所述TE缓冲液中的浓度为ImM，用盐酸调 PH值至8. O。方法三一、粘孢子虫基因组DNA提取1、从感染粘孢子虫宿主分离孢子囊粘孢子虫的感染和孢子囊的生长部位具有很高的特异性，因此在取样时只取同一 部位生长的孢子囊。从感染粘孢子虫的死的鲫鱼(Cyprinus carpio)肠道部位中分离出粘孢子虫孢子果。2、从孢子囊中分离粘孢子虫孢子颗粒用灭菌的PH值为7. 0的PBS小心将孢子颗粒从1个孢子囊中冲洗出，操作中尽量 细致，防止孢子囊壁的组织细胞混入孢子颗粒中，即得到含有粘孢子虫孢子的样品。将样品转移至50ml离心管4°C保存。PBS缓冲液按照如下方法配制将NaCl、Na2HP04、NaH2PO4和水混合，NaCl在PBS缓 冲液中的浓度为8g/l，Na2HPO4在PBS缓冲液的浓度为2. 2g/l，Na2HPO4在PBS缓冲液的浓 度为 0. 4g/l。3、去除粘孢子虫混有的宿主细胞将得到的含有粘孢子虫孢子的样品以SOOOXg离心15min，小心倒掉上清液；向沉淀中加入IOml灭菌PBS，再加入0. 5ml浓度为200g/l的SDS水溶液，至其终浓度达到IOg/ 1，在处理15min期间颠倒混勻，再以IOOOOXg离心15min小心倒掉上清液；向离心管 中加入灭菌PBS，重悬孢子，再重复SDS处理操作两次；操作过程中不断进行镜检，观察孢子 沉淀情况及孢子纯度，将得到的粘孢子虫孢子沉淀置于_20°C保存。4、应用液氮研磨的方法提取基因组DNA取上述1.8g粘孢子虫孢子沉淀在液氮中迅速研磨成粉；加入50mL提取液，快速振 荡混勻；加入2倍体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿异戊醇的体积比为M 1)混勻，以1°C， 13，000g，离心15min。上清液再用2倍体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿异戊醇的体积比为 24 1)抽提一次。以l°C，13，000g，离心15min。取上清液，加入1/3倍体积的_20°C预冷 的异丙醇沉淀，混勻，静置约40min。用毛细玻棒挑出絮状沉淀，用75%乙醇反复漂洗数次， 再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500ulTE中，加入1 μ IRNaseA (10mg/mL)，38°C下处理 1. 5h，得到的消化产物和是其3倍体积酚氯仿异戊醇混合液(pH8. 0，酚氯仿、异戊醇的体积 比为25 24 1)混合，以l°C，13，000g，离心15min。取上清液A，将上清液A和是其3 倍体积的氯仿异戊醇混合液(氯仿异戊醇的体积比为M 1混勻，以11，13，00(^，离心 15min。取上清液，加入0. 2倍体积的3MNaAc水溶液，3倍体积的无水乙醇，20°C静置沉淀 60min。沉淀用75%乙醇漂洗，风干，溶于200ulTE中，得到DNA样品，命名为DMl，-20°C保 存。DNA提取液由溶质和溶剂组成，所述溶质为NaCl、EDTA、SDS、Tris，所述溶剂为水， 所述Tris在所述提取液中的浓度为0. 5M，所述NaCl在所述提取液中的浓度为0. 6M，所述 EDTA在所述提取液中的浓度为0. 015M ；所述SDS在所述提取液中的浓度为20g/l ；用盐酸 调节PH值为7. 5 ；TE缓冲液由溶质和溶剂组成，所述溶质为Tris碱、EDTA，所述溶剂为水，所述Tris 碱在所述Tris碱中的浓度为10mM，所述EDTA在所述TE缓冲液中的浓度为ImM，用盐酸调 PH值至8.0。检测上述方法一提取DM2、DM3、DM4、DM5和DM6这5个孢囊中孢子的DNA。二、检测结果1、检测DNA的含量用紫外分光法测定方法一提取DM1、DM2、DM3、DM4、DM5和DM6的DNA的纯度和含 量。当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时，会影响DNA吸光度的准确测定。 通过检测同一样品的0拟60、0D280和0D230，计算其比值来测定样品的纯度。结果为方法一提取DMl、DM2、DM3、DM4、DM5 和 DM6 的 DNA 的 0D260/0D280 均为 1.8( > 1.9，表明有RNA污染；< 1.6，表明有蛋白质、酚等污染)；对于方法一提取DM1、DM2、DM3、DM4、DM5和DM6的DNA样品，通过测定^Onm的
光吸收值即可算出含量(将样品放入仪器中即可直接读出浓度和纯度的相关数值，Thermo Scientific NanoDrop公司Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白测定仪)，实验重复三次，结 果取平均值。结果如表1所示表1目前获得DNA样品量
权利要求
1.一种提取粘孢子虫基因组DNA方法，包括如下步骤1)将权利要求6-9中任一所述方法得到的粘孢子虫孢子研磨成粉，加入提取液混勻， 得到混合液；2)向步骤1)的混合液中加入氯仿异戊醇混合液混勻、离心，收集上清液；3)向步骤幻得到的上清液中加入氯仿异戊醇混合液混勻，离心，收集上清液；4)向步骤幻得到的上清液中加入异丙醇混勻，静置，收集沉淀；5)将步骤4)得到的沉淀依次进行漂洗、干燥、溶解、RNA消化，得到消化产物；6)将步骤幻得到的消化产物依次用酚氯仿异戊醇混合液和氯仿异戊醇混合液进行抽 提，离心、收集上清液；7)向步骤6)得到的上清液中加入3MNaAc水溶液和无水乙醇混勻，静置，离心，收集沉 淀，得到DNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述提取液与所述粘孢子虫孢子的配比为(10ml-50ml) (1.5g-2g)，所述 提取液与所述粘孢子虫孢子的配比具体为(10ml、40ml或50ml) (1. 5g、l. 8g或2g)；步骤幻中，所述步骤1)的混合液和所述氯仿异戊醇混合液的体积比为1 (1-2)，所 述步骤1)的混合液和所述氯仿异戊醇混合液的体积比具体为1 1、1 1.5或1 2;步骤幻中，所述步骤幻的上清液和所述氯仿异戊醇混合液的体积比为1 (1-2)，所 述步骤幻的上清液和所述氯仿异戊醇混合液的体积比具体为1 1、1 1.5或1 2;步骤4)中，所述步骤幻得到的上清液和所述异丙醇的体积比为(1-3) (1-2)；所述 步骤幻得到的上清液和所述异丙醇的体积比具体为1 1、3 2或3 1;所述异丙醇的 温度为"200C ；步骤幻中，所述漂洗为依次用75% (体积百分含量)乙醇水溶液、75% (体积百分含 量)乙醇水溶液和无水乙醇进行漂洗；所述溶解的方法为用TE缓冲液溶解所述沉淀得到溶液A，所述消化的方法为向所述溶液A中加入RNaseA得到消化产物，所述RNaseA加入量为 20mg/l 溶液 A ；步骤6)包括如下步骤:A)将步骤幻得到的消化产物和是其1倍-3倍体积的酚氯仿 异戊醇混合液混勻，离心，收集上清液A，所述将步骤幻得到的消化产物和是其1倍-3倍体积的酚氯仿异戊醇混合液具体为将 步骤幻得到的消化产物和是其1倍、2倍或3倍体积的酚氯仿异戊醇混合液；B)将步骤A得到的上清液A和是其1倍-3倍体积的氯仿异戊醇混合液混勻，离心，收 集上清液，所述将步骤A)得到的上清液A和是其1倍-3倍体积的氯仿异戊醇混合液具体为将步 骤A)得到的上清液A和是其1倍、2倍或3倍体积的氯仿异戊醇混合液；步骤7)中，所述步骤6)得到的上清液、所述3MNaAc水溶液和所述无水乙醇的体积比 为1 (0.05-0.2) 0-3)，具体为 1 (0. 005、0. 1 或 0. 2) (2、2.5 或 3)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤1)中，所述提取液由溶质和溶剂组成，所述溶质为NaCl、EDTA、SDS、Tris，所述溶 剂为水，所述Tris在所述提取液中的浓度为0. 1M-0. 5M，所述NaCl在所述提取液中的浓度为0. 4M-0. 6M，所述EDTA在所述提取液中的浓度为0. 005M-0. 015M，所述SDS在所述提取液 中的浓度为10g/l-20g/l ；所述Tri s在所述提取液中的浓度具体为0. 1M、0. 2M或0. 5M，所述NaCl在所述提取 液中的浓度具体为0. 4M、0. 5M或0. 6M，所述EDTA在所述提取液中的浓度具体为0. 005M、 0.0说或0.01511;所述SDS在所述提取液中的浓度具体为10g/l、15g/l或20g/l ； 所述提取液的PH值为7.5;步骤幻、步骤幻和步骤6)中，所述氯仿异戊醇混合液均由氯仿和异戊醇组成，所述氯 仿和异戊醇的体积比均为M 1 ；步骤4)中，所述静置时间为20min-40min，所述静置时间具体为20min、30min或 40min ；所述静置的温度为_20°C -4°C，所述静置的温度具体为-20°C、0°C或4°C ； 步骤5)中，所述消化的温度为35°C _38°C，所述消化的温度具体为35°C、37°C或38°C， 所述消化的时间为0. 5h-l. 5h，所述消化时间具体为0. 5hUh或1.证；步骤6)中，所述离心的温度均为0°C _41，所述离心的温度均具体为01、11或 4°C，所述离心的离心力均为10000g-13000g，所述离心的离心力均具体为10000g、12000g 或13000g，所述离心的时间均为5min-15min，所述离心的时间均具体为5min、10min或 15min ；所述酚氯仿异戊醇混合液由酚、氯仿和异戊醇组成，所述酚、氯仿和异戊醇的体积比为 25 24 1 ；所述酚氯仿异戊醇混合液的PH值为8.0 ；步骤7)中，所述离心的温度为0°C -4 0C，所述离心的温度具体为0°C、1°C或4°C，所述 离心的离心力为10000g-13000g，所述离心的离心力具体为10000g、12000g或13000g，所述 离心的时间为5min-15min，所述离心的时间具体为5min、IOmin或15min。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 步骤1)中，所述研磨为在液氮中研磨；步骤2)和步骤3)中，所述离心的温度均为0°C -4°C，所述离心的温度均具体为0°C、 1°C或4°C，所述离心的离心力均为10000g-13000g，所述离心的离心力均具体为10000g、 12000g或13000g，所述离心的时间均为5min-15min，所述离心的时间均具体为5min、IOmin 或 15min ；步骤7)中，所述静置时间为20min-60min，所述静置时间具体为20min、30min或 60min ；所述静置温度为_70°C _20°C，所述静置温度具体为-70°C、0°C、20°C。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述粘孢子虫为单极虫属、吉陶单极虫(Thelohanellus kitauei)。
6.一种分离粘孢子虫孢子的方法，包括如下步骤a)用PBS缓冲液冲洗粘孢子虫孢子囊，得到粘孢子虫孢子溶液；b)将步骤a)得到的粘孢子虫孢子溶液离心、收集沉淀；c)向步骤b)得到的沉淀中加入PBS缓冲液和SDS水溶液，混合，离心，收集沉淀；d)向步骤c)得到的沉淀中加入PBS缓冲液和SDS水溶液，混合，离心，收集沉淀，即为 粘孢子虫孢子。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于步骤b)中，所述离心的离心力为5000g-8000g，所述离心的离心力具体为5000g、6000g 或8000g，所述离心的时间为5min-15min，所述离心的时间具体为5min、IOmin或15min，步骤c)和步骤d)中，所述PBS缓冲液与所述SDS水溶液的体积比为10 0.5。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于步骤a)、c)和d)中，所述PBS缓冲液按照如下方法配制将NaCl、Na2HPO4, NaH2PO4和 水混合得到PBS缓冲液，NaCl在PBS缓冲液中的浓度为8g/l，Na2HPO4在PBS缓冲液的浓度 为2. 2g/l，Na2HPO4在PBS缓冲液的浓度为0. 4g/l，所述PBS缓冲液的PH值均为7. 0 ；步骤c)和d)中，所述混合的温度均为M°d8°C，所述混合的温度均具体为M°C、 25°〇或^°C，所述混合的时间均为5min-15min，所述混合的时间均具体为5min、10min或 15min，所述混合的方式均为颠倒混合；所述SDS水溶液的浓度均为200g/l。
9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于步骤c)和d)中，所述离心的离心力均为6000g-10000g，所述离心的离心力均具体为 6000g、8000g或lOOOOg，所述离心的时间均为5min_15min，所述离心的时间均具体为5min、 IOmin 或 15min ；所述粘孢子虫为单极虫属、吉陶单极虫(Thelohanellus kitauei)。
10.权利要求1-9中任一所述的方法在粘孢子虫分类鉴定中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种提取鱼类粘孢子虫基因组DNA方法。本发明提供的分离粘孢子虫孢子的方法，包括如下步骤a)从感染粘孢子虫宿主中分离粘孢子虫孢子囊；b)用浓度为10g/l的PBS冲洗步骤a)得到的粘孢子虫孢子囊，得到粘孢子虫孢子溶液；c)将步骤b)得到的粘孢子虫孢子溶液离心、收集沉淀；d)向步骤c)得到的沉淀中加入浓度为10g/l的PBS和10g/l SDS，混合，离心，收集沉淀。本发明的实验证明，用本方法提取的基因组，基因组DNA的纯度高，不含有宿主的基因，而且提取量多。而且本方法可以用于鉴定粘孢子虫孢子。
文档编号C12N15/30GK102115740SQ201010576458
公开日2011年7月6日 申请日期2010年12月1日 优先权日2010年12月1日
发明者何夙旭, 刘玉春, 周志刚, 姚斌, 张宇婷, 杨培龙, 白东青, 霍凤敏 申请人:中国农业科学院饲料研究所