专利名称：一种昆虫抗冷冻蛋白基因序列及其表达纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种昆虫抗冷冻蛋白基因的序列，本发明还涉及该昆虫抗冷冻蛋白基因的克隆以及蛋白表达纯化方法。
背景技术：
抗冷冻蛋白(antifreeze proteins，AFPs)是一类具有降低生物体液冰点和抑制冰晶生长的生物活性蛋白，在低温生物的生存中起着重要的作用。抗冷冻蛋白可作为蛋白质制剂在医药上应用于生物体、离体元件、组织、细胞系的低温或超低温保存以及靶组织的冷冻手术；在农业上可提高植物、动物的耐冻能力；在冷冻食品上应用可维持冷冻食品的结构和减少营养的损失；另外抗冷冻蛋白还可以制作冰浆以及作为一种新的抑制冰形成制剂。由此可见，抗冷冻蛋白的应用潜力巨大。
目前，已从鱼类、昆虫、植物、真菌、细菌中分离得到了许多种类的抗冷冻蛋白，其中昆虫抗冷冻蛋白的活性最高，比所有已知北极鱼的抗冷冻蛋白活性高出10-30倍，甚至100倍。
现在常用的大肠杆菌表达系统，如pGEX载体，表达的蛋白会在N端或C端多余几个氨基酸序列，或者带有His或GST的标签，因此表达出的蛋白与天然蛋白存在差异，活性可能受到影响；如要切除标签蛋白GST，还必须使用昂贵的内切酶，必然增加成本。或者以包涵体的形式表达，虽然不带有多余的氨基酸残基，但是包涵体的处理步骤繁琐，最终得到的复性蛋白活性往往较低。
发明内容
(一)要解决的技术问题本发明的目的是公开一种昆虫抗冷冻蛋白基因的序列，本发明的另一目的是提供一种高效、简便、廉价的昆虫抗冷冻蛋白基因的克隆以及蛋白表达纯化的方法。
(二)技术方案本发明公开了一种昆虫抗冷冻蛋白基因，其序列为SEQ ID NO1。
本发明提供了一种昆虫抗冷冻蛋白基因的克隆、蛋白表达及纯化方法，它包括以下步骤a.提取并纯化昆虫的mRNA；b.设计特异性引物对P1，上游序列为AFP15’-TGCAGGAATCGGCACGAGGAA-3’，下游序列为AFP25’-GACTTTCATGGCTTAATTAGC-3’，用RT-PCR法克隆抗冷冻蛋白基因；c.抗冷冻蛋白基因与T载体连接形成重组质粒pGAFP4，测序；d.设计特异性引物对P2，上游序列为AFP1′5’-GGT GGT TGC TCTTCC ACC ATG GAT GGC TCG TGT ACA-3’，下游序列为AFP2′5’-GGT GGT CTG CAG TCA TTA ATT AGC ACT GAA-3’，用PCR方法将抗冷冻蛋白基因从重组质粒pGAFP4中扩增出来，扩增产物与表达元件PTYB11连接构建了表达载体PTYB11-afp；e.表达载体PTYB11-afp转化大肠杆菌细胞；f.诱导表达；g.亲和纯化抗冷冻蛋白。
本发明所述的基因克隆、蛋白表达及纯化方法，mRNA是从一种生活在瑞典的鳞翅目昆虫的幼虫体内提取并纯化的。
本发明所述的基因克隆、蛋白表达及纯化方法，RT-RCP的反应体系为ddH2O 23.0μL5×Buffer 10.0μLdNTPs(10mM)1.0μLAFP1(10μM)5.0μLAFP2(10μM)5.0μLMgSO4(25mM) 2.0μL
AMV反转录酶(5U·μL-1) 1.0μLTflDNA酶(5U·μL-1)1.0μLmRNA2.0μL；RT-RCP反应参数为反转录48℃ 45min；预变性94℃ 2min；循环参数94℃ 40s，55℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；最后72℃延伸6min。
本发明所述的基因克隆、蛋白表达及纯化方法，抗冷冻蛋白基因与T-Vector连接后获得重组质粒pGAFP4。
本发明所述的基因克隆、蛋白表达及纯化方法，PCR反应体系为ddH2O 40.0μL10×Buffer(含Mg2+) 5.0μLdNTPs(10mM) 1.0μLAFP1′(10μM) 1.25μLAFP2′(10μM) 1.25μLTaq DNA聚合酶(5U·μL-1) 0.5μLpGAFP4 1.0μL；PCR反应参数预变性94℃ 5min；循环参数为94℃ 40s，55℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；最后72℃延伸6min。
本发明所述的基因克隆、蛋白表达及纯化方法，将从重组质粒pGAFP4中扩增出来的抗冷冻蛋白基因(afp)与原核生物表达元件PTYB11连接，构建出表达载体PTYB11-afp。
本发明所述的基因克隆、蛋白表达及纯化方法，用表达质粒PTYB11-afp转化DH5α感受态细胞后，挑取阳性克隆摇菌，以试剂盒小量提取重组表达质粒PTYB11-afp。
本发明所述的基因克隆、蛋白表达及纯化方法，把提取的表达质粒PTYB11-afp转化表达菌株BL21，加入IPTG诱导抗冷冻蛋白的表达。加入溶菌酶和无蛋白酶的DNase处理，离心取上清。
本发明所述的基因克隆、蛋白表达及纯化方法，IPTG诱导条件是37℃3h；溶菌酶工作浓度为20μg·mL-1，无蛋白酶的DNase工作浓度为10μg·mL-1，条件是30℃ 2h。
本发明所述的基因克隆、蛋白表达及纯化方法，在诱导表达后，用Chitin介质纯化蛋白并柱上切割，洗脱获得纯化的抗冷冻蛋白。
本发明中所用的mRNA提取纯化试剂盒和RT-PCR试剂盒均为QIAGEN公司产品。
本发明所用的表达质粒载体PTYB11购买自NEB(New England Biolabs)公司，该质粒带有强的T7启动子，目的蛋白基因克隆在标签intein的3’端，且表达出的目的蛋白N端不带有载体的氨基酸残基。
本发明所用的纯化介质Chitin在结合缓冲液中能特异性结合标签intein，从而纯化蛋白，并且在裂解缓冲液中，标签与抗冷冻蛋白断开，洗脱下纯的抗冷冻蛋白。所用的结合缓冲液成分为HEPES 20mM，NaCl 500mM，TritonX-100 0.1％，PMSF 20μM；所用的裂解缓冲液成分为HEPES 20mM，NaCl500mM，DTT 50mM。
本发明所述的表达系统得到的融合蛋白不需要内切酶即可切除标签蛋白，不含多余的氨基酸序列，因为表达质粒PTYB11的目的蛋白(AFP)与PTYB11上的蛋白自剪接元件(称为“内含肽”，intein)及几丁质结合蛋白形成了融合蛋白，通过几丁质柱亲和纯化融合蛋白，诱导内含肽的肽键裂解活性，在几丁质介质上将目标蛋白释放出来，而内含肽与几丁质结合蛋白仍结合在几丁质介质上，达到单柱分离纯化蛋白的目的。pTYB11载体只有在SapI位点被用来分别克隆目的基因的3’和5’端，此克隆策略使得目的基因和intein标签(即剪切标签)正好相邻，纯化的目的蛋白不含多余的氨基酸残基。
用本发明所述的表达系统得到的融合蛋白更接近天然蛋白活性，这是因为纯化的目的蛋白不含多余的氨基酸残基，保证了表达出来的目的蛋白能够正确折叠成天然的构像，从而保持了其天然的活性。
本发明所用的质粒转化方法参照《分子克隆实验指南》第2版，第55页，金冬雁，黎孟枫等译。
本发明中提取mRNA是按购自QIAGEN公司的Oligotex Direct mRNA纯化试剂盒中的操作步骤进行。
(三)有益效果应用本发明所述的方法成功地克隆到了昆虫的抗冷冻蛋白基因。诱导表达的抗冷冻蛋白占菌体总蛋白的30％，通过介质纯化后得到的抗冷冻蛋白纯度达95％以上，说明本发明提供的方法是高效的。
另外，用本发明所述的表达系统得到的融合蛋白不需要内切酶即可切除标签蛋白，不含多余的氨基酸序列，更接近天然蛋白活性。
图1RT-PCR法扩增的电泳图；图中M、100bp DNA Mark；M′、1kbDNAMark；1-4均为RT-PCR产物。
图2诱导表达的蛋白电泳图；图中1、蛋白标准；2、诱导前菌体总蛋白；3-8、诱导2h、4h、6h、8h、10h、12h菌体总蛋白；箭头所指为诱导表达的融合蛋白。
图3纯化后的蛋白电泳图；图中1、蛋白标准；2、上样流出液；3-7、洗脱液；细头所指为融合蛋白，粗箭头所指为昆虫抗冷冻蛋白。
具体实施例方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。
实施例11.取1只3龄昆虫幼虫，去掉头部后，放在一液氮预冷的研钵中，加入液氮，迅速研磨至粉状并转进一液氮预冷的无RNase的1.5mL离心管中，根据mRNA的提取和纯化试剂盒中的说明获得纯mRNA。
2.以AFP1(5’-TGCAGGAATCGGCACGAGGAA-3’)和AFP2(5’-GACTTTCATGG CTTAATTAGC-3’)为引物，以mRNA为模板进行抗冷冻蛋白基因的RT-PCR扩增。
RT-PCR的反应体系为ddH2O 23.0μL，5×Buffer 10.0μL，dNTPs(10mM)1.0μL，AFP1(10μM)5.0μL，AFP2(10μM)5.0μL，MgSO4(25mM)2.0μL，AMV反转录酶(5U/μL)1.0μL，TflDNA酶(5U/μL)1.0μL，mRNA 2.0μL，总体积50.0μL。
反应参数为反转录48℃ 45min；预变性94℃ 2min；循环参数94℃40s，55℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；最后72℃延伸6min。
扩增产物以1％胶电泳并回收。
3.回收的抗冷冻蛋白基因直接与pGEMR T-Vector相连，得到重组质粒pGAFP4并由上海基因公司测序获得抗冷冻蛋白基因核苷酸全序列。
4.以AFP1′5′-GGT GGT TGC TCT TCC ACC ATG GAT GGC TCGTGT ACA-3和AFP2′5′-GGT GGT CTG CAG TCA TTA ATT AGC ACTGAA-3′为引物，以重组质粒pGAFP4为模板用PCR法重新扩增出抗冷冻蛋白基因。
PCR反应体系为ddH2O 40.0μL，10×PCR Buffer(含Mg2+)5.0μL，dNTPs(10mM)1.0μL，AFP1′(10μM)1.25μL，AFP2′(10μM)1.25μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，质粒pGAFP41.0μL，总体积50μL。
反应参数为预变性94℃ 5min；循环参数为94℃ 40s，55℃ 30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸6min。
5.该基因片段直接连接到新的表达载体PTYB11中，形成抗冷冻蛋白的表达载体PTYB11-afp。
6.取10μL质粒PTYB11-afp加入150μL DH5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴2min，加800μL LB，于37℃摇床上摇45min，转速为220rpm，铺板，抗生素为100μg·mL-1氨苄。
7.挑取阳性克隆，用试剂盒小量提取重组表达质粒PTYB11-afp。
8.将表达质粒PTYB11-afp转化表达菌株BL21，然后加入ITPG诱导抗冷冻蛋白的表达，诱导条件是37℃ 3h。再加入溶菌酶和无蛋白酶的DNase处理，离心取上清。溶菌酶工作浓度为20μg·mL-1，无蛋白酶的DNase工作浓度为10μg·mL-1，条件是30℃ 2h。
9.用Chitin介质纯化融合蛋白并柱上切割，洗脱获得纯化的抗冷冻蛋白。所用的结合缓冲液成分为HEPES 20mM，NaCl 500mM，Triton X-100 0.1％，PMSF 20μM；所用的裂解缓冲液成分为HEPES 20mM，NaCl 500mM，DTT50mM。
序列表<110>华南农业大学<120>SEQ ID NO1<130>一种昆虫抗冷冻蛋白基因序列及其表达纯化方法<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>411<212>DNA<213>Budworm<400>1tgcaggaatc ggcacgagga aagacatatt tttttttagt ttcaaaagtt gtgtacattt 60ttctcaagta tcatgaagtg tttaatgctg atcatggctc tagccattat caacactgta120
tcttctgatg gctcgtgtac aaacacgaac tctcagctca gcgcaaactc caagtgcgaa180aaatcgacgt tgaccaactg ctacgtcgat aaaagcgagg tttacggcac tacctgtaca240ggaagccgat tcgacggagt cactataacg acttcaacat ctaccggttc acgtatttca300ggccctggat gcaagatttc cacttgcatt atcaccgggg gtgtacctgc tccatcagct360gcttgcaaga tttctggatg tactttcagt gctaattaag ccatgaaagt c 41权利要求
1.一种昆虫抗冷冻蛋白基因，其序列为SEQ ID NO1。
2.一种昆虫抗冷冻蛋白基因的克隆、蛋白表达及纯化方法，其特征在于包括以下步骤a.提取并纯化昆虫的mRNA；b.设计特异性引物对P1，上游序列为AFP15’-TGCAGGAATCGGCACGAGGAA-3’，下游序列为AFP25’-GACTTTCATGGCTTAATTAGC-3’，用RT-PCR法克隆抗冷冻蛋白基因；c.抗冷冻蛋白基因与T载体连接形成重组质粒pGAFP4，测序；d.设计特异性引物对P2，上游序列为AFP1′5’-GGT GGT TGC TCTTCC ACC ATG GAT GGC TCG TGT ACA-3’，下游序列为AFP2′5’-GGT GGT CTG CAG TCA TTAATT AGC ACT GAA-3’，用PCR方法将抗冷冻蛋白基因从重组质粒pGAFP4中扩增出来，扩增产物与表达元件PTYB11连接构建了表达载体PTYB11-afp；e.表达载体PTYB11-afp转化大肠杆菌细胞；f.诱导表达；g.亲和纯化抗冷冻蛋白。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于mRNA是从一种生活在瑞典的鳞翅目昆虫的幼虫体内提取并纯化的。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于用构建的表达质粒PTYB11-afp转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行摇菌，试剂盒小量提取表达质粒PTYB11-afp。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于用提取的表达质粒PTYB11-afp转化表达菌株BL21，然后加入IPTG诱导抗冷冻蛋白的表达。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于诱导表达后，用Chitin介质纯化蛋白并柱上切割，洗脱获得纯化的抗冷冻蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种昆虫抗冷冻蛋白基因，其序列为SEQ ID NO1。本发明还提供了该昆虫抗冷冻蛋白基因的克隆、蛋白表达及纯化方法，主要包括以下步骤利用特异性引物扩增该昆虫抗冷冻蛋白基因，与原核生物表达元件PTYB11连接构建表达载体PTYB11－afp，转化表达菌株BL21，加入诱导剂诱导，以及纯化抗冷冻蛋白。运用本发明所述的方法成功地克隆到了昆虫抗冷冻蛋白基因。诱导表达的抗冷冻蛋白占菌体总蛋白的30％，通过介质纯化后得到的抗冷冻蛋白纯度达95％以上，说明本发明提供的方法是高效的。而且，用本发明所述的表达系统得到的融合蛋白不需要内切酶即可切除标签蛋白，不含多余的氨基酸序列，更接近天然蛋白活性。
文档编号C12N15/09GK1800393SQ20051012641
公开日2006年7月12日 申请日期2005年12月8日 优先权日2005年12月8日
发明者郭丽琼, 林俊芳, 陈小萍 申请人:华南农业大学