一种昆虫干标本基因组提取方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种昆虫干标本基因组DNA提取方法，为改进的饱和NaCl法，包括以下步骤：(1)昆虫干标本的预处理(2)研磨预处理的材料至粉状，将研磨产物转入1.5mlEP管，(3)加入溶液1溶解，除RNA，(4)加入消化液2消化，离心，转移上清至另一EP管，(5)蛋白质沉淀，(6)洗涤。本发明的方法适用于膜翅目、蜻蜒目、直翅目、鞘翅目等多种昆虫干标本不同部位DNA提取，提取效率高，所提DNA质量和纯度可供昆虫分子系统进化分析，为研究、探索最合适部位、最小量材料、最小损坏标本提取昆虫干标本基因组DNA提供了基础方法，操作简单易行，便于实验室开展。
【专利说明】一种昆虫干标本基因组提取方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物【技术领域】，尤其涉及一种昆虫标本基因组DNA提取方法。
【背景技术】
[0002]DNA是遗传信息的载体，是分子生物学研究的主要对象。由于DNA序列中含有丰富的生物学信息，记载了生物进化的历史。在活体细胞中，DNA存在完整的修复机制，使DNA完整无损。但DNA化学性质极不稳定，在干标本中可以通过水解或氧化作用自发地降解。在标本馆中的干标本是一个巨大的遗传基因信息库，现代分子生物学随机扩增多态DNA(RAPD)技术、限制性片段长度多态性(RFLP)技术DNA指纹技术、以及对12srRNA，16srRNA, 18SrRNA,ND5等序列的测定，已经广泛应用于昆虫分类的研究。应用DNA序列研究生物的系统发育和进化规律成为当前分子系统学研究的热点。而这些技术的应用，首先最基本的问题是基因组DNA的提取.技术的迅速发展使我们得以在分子水平上揭示和利用这个巨大的遗传信息库变得可能，这为生物分类、系统发育、生态和进化提供了新的科学依据和发展机会。许多研究者介绍的基因组DNA的提取方法中所采用的材料基本上是新鲜样品或超低温冷冻标本(Blin&Stafford, 1976 ；Bowtell, 1987 ；Gross-Bellardd el al., 1972 ；Kupiec el al.，1987 ;王文和施立明，1993)，但是分子系统发育和进化研究中经常出现所研究的类群，特别是稀有类群难以得到新鲜材料的问题，因此往往需要利用自然博物馆或标本馆的干标本提取基因组DNA，但干标本保存时间越长基因组DNA的降解也越严重。因此，如何从干标本中提取基因组DNA的方法对系统发育和进化研究至关重要。
[0003]目前，国内外提取昆虫干标本的主要方法有:CTAB法，SDS法，蛋白酶K法，饱和NaCl法，酚仿抽提法等。酚仿抽提法是提取核酸的经典方法，主要原理是利用核酸、蛋白等杂质在水相和有机相中溶解度不同而重新分配，实质上为使用蛋白酶K消化后用酚/氯仿去除蛋白质的抽提方法。CTAB法为Murray和Thompson发明的,其原理为CTAB是一种离子型去垢剂，能使核酸和酸性多糖从低离子强度的溶液中沉淀出来，同时，蛋白质和中性多糖等杂质留在溶液中。CTAB法常用于新鲜植物组织的DNA提取。SDS法由Dellaporta等发明，利用SDS-Tris-Cl-EDTA等直接裂解细胞释放DNA，用酚/氯仿反复抽提后乙醇沉淀出DNA。
[0004]传统DNA提取方法，如SDS法、CTAB法、蛋白酶K法经不少专家学者改进后，仅可提取出某个目或某些昆虫的干标本DNA。蛋白酶K法中蛋白酶K的用量与最终DNA的得率成正比(Kosel&Grae2ber, 1994 ;Diaz2Cano&Brady, 1997),在消化过程中加入还原剂(巯基乙醇或二硫苏糖醇DDT)似乎可以提高DNA的得率(Paabo，1989)。一般用乙醇沉淀DNA。然而，Kosel&Grae2ber (1994)认为用这种方法提取标本DNA，PCR抑制剂会与DNA —起被抽提出来，影响后面的PCR反应。刘波等(1999)用CTAB法分别对稻蝗(Oxya)的干标本和酒精浸泡标本的DNA进行提取并获得了满意结果。张晟铭等利用SDS法提取了鞘翅目小蠹科的干标本DNA。由此可知:上述各种昆虫干标本DNA提取方法适用范围极其狭窄，仅仅适合于某一种或某一昆虫目干标本基因组DNA的提取，对其他类别的昆虫干标本DNA的提取并未取得良好的效果，而且酚仿抽提法提取DNA含有较多杂质，对于微量组织和多年保存的干标本，此3种方法提取效果较差，不能进行特异性PCR扩增等后续研究。国内外以昆虫干标本基因组DNA为研究的仅仅集中在膜翅目、鳞翅目、鞘翅目等少数几个目，而且昆虫干标本DNA的提取方法各自不同。然而，由于昆虫种类之多，体系庞大，发育阶段存在差异，未涉及研究的昆虫仍不能快速有效地确定提取方法，使得昆虫标本馆中的所蕴藏的巨大的遗传基因信息库不能得以利用，严重阻碍了昆虫的分子系统进化的研究进程。昆虫分子系统学研究领域迫切需要一种可适用于多个类目昆虫干标本的基因组DNA提取方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种适用于多个目昆虫的干标本基因组DNA提取方法。
[0006]为实现发明目的，本发明采取如下技术方案:
[0007]一种昆虫干标本基因组DNA提取方法，为改进的饱和NaCl法，包括以下步骤
[0008](I)昆虫干标本样品的获取和预处理，研磨预处理材料至粉状，将研磨产物转入Ep管，
[0009](2)加入溶液(I)溶解，除RNA，
[0010](3加入消化液(2)消化，离心，转移上清至另一 Ep管，
[0011](4)蛋白质沉淀，
[0012](5)洗涤，
[0013](6)干燥，
[0014](7)TE溶解，-2(rC保存备用。
[0015]步骤(1)所述的昆虫干标本样品的用于提取基因组DNA，获取方法为:从昆虫标本胸部和足部、头部剪取肌肉0.03g，于STE缓冲液(0.1mmol/LNaCI, pH8.010mmol/L Trisbuffer, pH8.0lmmol/L EDTA, dsH20)中室温浸泡预处理5h，取出后在消毒的滤纸上干燥。
[0016]步骤(1)所述的研磨放入Ep管中采用灭菌的玻棒研在Ep管中磨碎所述研磨得到的粉末用含0.4ml TE溶解悬浮。
[0017]步骤⑵所述溶液I用量为300~400 μ 1，所述溶液(I)为包含0.1 %的RNase的0.4ml TE，步骤(3)所述去除RNA的温度为35~37°C，时间为45~60min，室温离心12000rpmlmino
[0018]步骤(3)所述消化液I用量为300~400 μ 1，所述消化液⑵包括成为:2~8%SDS’ 100~300 μ g/ml的蛋白酶K ，所述消化液⑵的PH为8.0,步骤(4)所述消化温度为25~37°C，时间为，16~30h。
[0019]步骤(4)所述蛋白质沉淀包括:
[0020]I)加1/4体积饱和NaCl,润旋s或静置5~8min, 12000r/min离心20min,将上清转移到另一支离心管，
[0021]2)加等体积的氯仿,充分混匀后离心12000r/min离心15min,
[0022]3)吸取水相至另一新管内，加入1/10体积的3M NaAc (pH5.2)混匀后，加入等体积的异丙醇并轻轻混匀，12000rpm离心5min离心,去除上清液。
[0023]步骤(5)所述洗涤是加入70%乙醇0.6ml，可见乳白色絮状DNA团块，充分洗涤
DNA沉淀。[0024]步骤(6)所述干燥选自空气中自然干燥或置37 °C温箱中干燥3min。
[0025]步骤(7)所述TE溶解为加入TE (pH8.0) 30~45 μ I溶解DNA。
[0026]所述的0.1%是指100mg/ml,所述的2~8%是指2~8g/100ml,所述的70%乙醇是指70ml纯酒精用灭菌的三蒸水定容到100ml的酒精溶液。
[0027]本发明的TE 成分为:10mM Tris-HCl,0.1Mm EDTA，ρΗ8.0。
[0028]本发明改进的NaCl法提取干标本基因组DNA的工作原理是:
[0029]预处理用于提取DNA的干标本材料，研磨待提取材料至粉状，使待提取DNA的标本样品可充分吸收下一步加入的溶液(I)。加入的溶液(I)含RNAse，去除RNA，这比常规DNA提取方法在提取之后的DNA保存步骤再去除RNA，更加简便；之后用含SDS和蛋白酶K的消化液(2)消化，再用饱和NaCl、氯仿沉淀除去蛋白质，异丙醇沉淀目标DNA，70%乙醇洗涤目标DNA之后干燥，[0030]最后TE溶解-20 V保存。
[0031 ] 2.提取的目标基因组DNA的鉴定
[0032]用本方法提取的多种类目昆虫干标本基因组DNA，可经0.8%的琼脂糖凝胶电泳和PCR检测其浓度和质量。
[0033]PCR检测可选取拷贝数多的线粒体COI基因对运用饱和NaCl法提取的膜翅目不同科干标本DNA进行PCR扩增。
[0034]3.本方法的用途
[0035]本方法可应用于从蜻蜓目Odonata、櫝翅目Plecoptera、直翅目Orthoptera、同翅目 Homoptera、半翅目 Hemiptera、銷翅目 Coleoptera、广翅目 Megaloptera、双翅目 Diptera、毛翅目 Trichoptera、膜翅目 Hymenopteral、鱗翅目 Lepidoptera、赔赠目Ephemeroptera、幢螂目Mantodea、长翅目Mecoptera、脉翅目Neuroptera的任一种干标本提取基因组DNA，提取得到的DNA含量可满足分子生物学后续实验对DNA浓度和质量的要求。本发明具有下列优点和积极效果:
[0036]1、本发明具有广泛的昆虫种类适用范围，能够实现大部分昆虫目干标本DNA的提取。能够提取蜻蜓目Odonata、櫝翅目Plecoptera、直翅目Orthoptera、同翅目Homoptera、半翅目Hemiptera、銷翅目Coleoptera、广翅目Megaloptera、双翅目Diptera、毛翅目Trichoptera、膜翅目 Hymenopteral、鱗翅目 Lepidoptera、輕蝣目 Ephemeroptera、幢螂目Mantodea、长翅目Mecoptera、脉翅目Neuroptera昆虫干标本DNA。
[0037]2、提取效率高，所提DNA的量较高，线粒体COI基因的成功扩增说明本发明所提取的干标本DNA质量和纯度能够应用于昆虫分子系统进化分析。
[0038]3.能够用于昆虫干标本不同部位DNA的提取，为研究、探索最合适部位、最小量材料、最小损坏标本提取昆虫干标本基因组DNA提供了基础方法。
[0039]4、操作简单易行，可在一般实验室开展，十分方便。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1.四种方法提取膜翅目姬蜂干标本基因组DNA的电泳结果(1.饱和氯化钠法；
2.SDS法；3.CTAB法；4.蛋白酶K法)
[0041]图2.饱和氯化钠法提取膜翅目不同科干标本基因组DNA电泳结果[0042](I,姬蜂科 Ichneumonidae ;2，蜜蜂科 Apidae ;3，胡蜂科 Vespidae ;4，叶蜂科Tenthredinidae ;5，熊蜂科 Bombidae AJj^AFormicidae ;7，木蜂科 Xylocopidae.M.分子量标准)
[0043]图3.饱和NaCl法提取不同目昆虫干标本基因组DNA结果
[0044](I，直翅目幢科Acrididae ;2，双翅目蛇科Acrididaee ;3，半翅目缘蝽科Coreidae ;4，同翅目[il单科；Cicadidae ;5,靖艇目媳科Coenagrionidae ;6，銷翅目步甲科Carabidae ;7，櫝翅目原櫝科Placoptera ;8,毛翅目石蛾科Phryganeidae ;9，广翅目鱼蛉科Corydalidae ;10，膜翅目胡蜂科Vespidae ;Μ.分子量标准)
[0045]图4.膜翅目不同科提取的基因组DNA进行PCR扩增结果电泳图
[0046]I, Vespidae 胡蜂科；2, Tenthredinidae 叶蜂科；3, Apidae 蜜蜂科；4，Ichneumonidae 姬蜂科；5, Formicidae 蚁科；6, Bombidae 熊蜂科.Μ.分子量标准)
【具体实施方式】
[0047]下面结合附图和实施例详细说明本发明:
[0048]实施例1改进的饱 和氯化钠法提取不同目昆虫干标本基因组DNA及其检测
[0049]1.DNA 提取
[0050](I)从昆虫干标本头、胸、足获取用于提取基因组DNA的样品0.03g，在STE缓冲液(0.lmmol/L NaCl,pH8.0 IOmmoI/L Tris buffer,pH8.0 lmmol/LEDTA, dsH20)中室温浸泡预处理5h，取出后在消毒的滤纸上干燥，
[0051](2)将干燥的预处理材料放入Ep管中用灭菌的玻棒研磨碎至粉状，将研磨产物转入Ep管,
[0052](3)加入溶液 I (包含 0.1 % 的 RNase 的 0.4ml TE) 350 μ I 溶解，去除 RNA ；
[0053](4)加入消化液2包括2~8% SDS, 100~300 μ g/ml的蛋白酶K，PH为8.0)消化温度为25~37°C消化lOmin，离心，转移上清至另一 1.5ml Ep管，
[0054](5)蛋白质沉淀:
[0055]I)加1/4体积饱和NaCl,润旋30s或静置5~8min, 12000r/min离心20 min,将
上清转移到另一支离心管，
[0056]2)加等体积的氯仿,充分混匀后离心12000r/min离心15min,
[0057]3)吸取水相至另一新管内，加入1/10体积的3M NaAc (pH5.2)混匀后，加入等体积的异丙醇并轻轻混匀，12000rpm离心5min离心,去除上清液。
[0058](6)洗涤:加入70%乙醇0.6ml，可见乳白色絮状DNA团块，充分洗涤DNA沉淀
[0059](7)自然干燥，
[0060](8)加入 TE (ρΗ8.0) 30 ~45 μ I 溶解 DNA，_20°C保存备用。
[0061]2.提取的DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测
[0062](1.)饱和氯化钠法提取膜翅目不同科干标本基因组DNA琼脂糖凝胶电泳
[0063](I,姬蜂科 Ichneumonidae ;2，蜜蜂科 Apidae ;3，胡蜂科 Vespidae ;4，叶蜂科Tenthredinidae ;5，熊蜂科 Bombidae AJj^AFormicidae ;7，木蜂科 Xylocopidae.M.分子量标准)
[0064]检测结果见图2[0065](2)饱和NaCl法提取不同目昆虫干标本基因组DNAl %琼脂糖凝胶电泳检测
[0066](I，直翅目幢科Acrididae ;2，双翅目蛇科Acrididaee ;3，半翅目缘蝽科Coreidae ;4，同翅目[il单科；Cicadidae ;5,靖艇目媳科Coenagrionidae ;6，銷翅目步甲科Carabidae ;7，櫝翅目原櫝科Placoptera ;8,毛翅目石蛾科Phryganeidae ;9，广翅目鱼蛉科Corydalidae ;10，膜翅目胡蜂科Vespidae ;Μ.分子量标准)
[0067]检测结果见图3
[0068](3)膜翅目不同家族看昆虫干标本基因组DNA饱和氯化钠法提取产物PCR扩增电泳((I, Vespidae 胡蜂科；2, Tenthredinidae 叶蜂科；3, Apidae 蜜蜂科；4, Ichneumonidae姬蜂科；5, Formicidae蚁科；6, Bombidae熊蜂科Μ.分子量标准)
[0069]检测结果见图4。
[0070]2.四种方法提取膜翅目姬蜂干标本基因组DNA的电泳检测
[0071](1.)饱和氯化钠法；(2.) SDS法；(3.) CTAB法；(4).蛋白酶K法
[0072](具体操作步骤按照常规分子生物学操作指南)
[0073]检测结果见图1
[0074]以上检测结果表明，采用饱和氯化钠法对不同目的昆虫干标本基因组DNA提取得到的DNA产量可满足后续分子系统学实验的需求。
[0075]本发明不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种 变换，均落在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种昆虫干标本基因组DNA提取方法，为改进的饱和NaCl法，包括以下步骤: (1)昆虫干标本样品的获取和预处理 (2)加入溶液(I)溶解，除RNA, (3)加入消化液(2)消化， (4)蛋白质沉淀， (5)洗涤， (6)干燥， (7)TE溶解，_20°C保存备用； 其特征在于，步骤(1)所述的获取待提取用于提取DNA的材料的方法为:所述昆虫干标本样品为用于提取DNA的材料的部位，包括足、胸、头、，重量为0.03g。
2.根据权利要求1的昆虫干标本基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(1)所述昆虫干标本的预处理是将昆虫干标本样品在STE缓冲液中室温浸泡预处理5h，取出后在消毒的滤纸上干燥，放入Ep管中用灭菌的玻棒研磨碎,所述研磨得到的粉末用含0.4ml TE溶解悬浮，所述 STE 缓冲液组成为 0.1mmol /T, NaCl, 10mmol /T, Tris bufferpH8.0, Immol /T, EDTA,dsH20,所述STE缓冲液的PH为8.0。
3.根据权利要求1的昆虫干标本基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(2)所述溶液I用量为300~400 μ 1，所述溶液(I)为包含2%的RNase的0.4ml TE，步骤(2)所述溶解的温度为35~37°C，时间为45~`60min，溶解后室温离心12000rpmlmin。
4.根据权利要求1的昆虫干标本基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(3)所述消化液⑵用量为300~400 μ 1，所述消化液⑵包括成为:2~8% SDS, 100~300 μ g/ml的蛋白酶K，所述消化液(2)的PH为8.0,步骤(4)所述消化温度为25~37°C，时间为，16~30h。
5.根据权利要求1的昆虫干标本基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(4)所述蛋白质沉淀包括: 1)加1/4体积饱和NaCl,润旋30s或静置5~8min,12000r/min离心IOmin,将上清转移到另一支离心管， 2)加等体积的氯仿，充分混匀后离心12000r/min离心IOmin, 3)吸取水相至另一新管内，加入1/10体积的3MNaAc (pH5.2)混匀后，加入等体积的异丙醇并轻轻混匀，12000rpm离心5min离心,去除上清液。
6.根据权利要求1的昆虫干标本基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(5)所述洗涤是加入70%乙醇0.6ml，可见乳白色絮状DNA团块，充分洗涤DNA沉淀。
7.根据权利要求1的昆虫干标本基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(6)所述干燥选自空气中自然干燥或置37 °C温箱中干燥3min。
8.根据权利要求1的昆虫干标本基因组DNA提取方法，其特征在于，步骤(7)所述TE溶解为加入TE (pH8.0) 30~45 μ I溶解DNA，-20°C保存。
9.根据权利要求1所述的昆虫干标本基因组DNA提取方法，其特征在于，可适用于选自靖艇目Odonata、積翅目Plecoptera、直翅目Orthoptera、同翅目Homoptera、半翅目Hemiptera、銷翅目Coleoptera、广翅目Megaloptera、双翅目Diptera、毛翅目Trichoptera、膜翅目 Hymenopteral、鱗翅目 Lepidoptera、輕蝣目 Ephemeroptera、幢螂目Mantodea、长翅目Mecoptera`、脉翅目Neuroptera的干标本的基因组DNA提取。
【文档编号】C12N15/10GK103509786SQ201310201634
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年5月21日 优先权日:2013年5月21日
【发明者】南小宁, 伏正, 魏琮, 冯继广, 周浪, 赵雅琼, 郭新荣 申请人:西北农林科技大学