专利名称：昆虫卵可视化自吸式外源基因导入方法
技术领域：
本发明涉及一种昆虫卵可视化自吸式外源基因导入方法。
背景技术：
通过生物技术将克隆的外源基因人为地整合到昆虫基因组内、并稳定地遗传和表达，这样的昆虫叫做转基因昆虫。转基因昆虫能够形成一个具有相应外源基因的新的品种，其利用价值在于(1)开展基础理论研究；(2)生产外源蛋白；(3)开展经济昆虫的分子育种；(4)开展害虫的生物防治。
在开展转基因昆虫研究时，一般是在卵期，利用显微注射方法导入克隆的外源基因。这一导入方法，需要价值昂贵的精密仪器设备和技术高超的实验操作人员。
发明内容
本发明的目的是提供一种昆虫卵(任何昆虫卵)可视化自吸式外源基因导入方法，利用价值较低的仪器设备，使一般的技术操作人员能够从事转基因昆虫研究工作。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是(1)产卵后10小时以内的昆虫卵用1％-8％甲醛浸5-120分钟、或用60-80％酒精喷洒卵面，进行消毒处理；(2)外源基因溶解在溶解液中，外源基因的浓度范围为0.1ng/μl～100mg/μl；(3)昆虫卵干燥后，借助放大倍数范围为1-100倍的实体显微镜，在卵表面涂抹含有外源基因的溶液，涂抹溶液量为1nl-10μl；(4)利用金属针穿刺涂有外源基因溶液的昆虫卵表面，依靠金属针进出昆虫卵时造成的液体回流，使昆虫卵自动吸入外源基因，金属针进出昆虫卵的次数为1-5次；(5)昆虫卵金属针穿刺后，用石蜡封闭穿刺口或不封闭穿刺口。
所述的外源基因状态为直链基因、环状基因、或整合在质粒中的基因。
所述的溶解液为超纯水、磷酸缓冲液、或Tris-HCl缓冲液。
所述的金属针的针尖直径小于0.5mm。
本发明具有的有益的效果是借助实体显微镜观察，在昆虫卵表面涂抹含有外源基因溶液，在涂抹部位用金属针穿刺昆虫卵数次，依靠金属针进出昆虫卵时造成的液体回流，使昆虫卵自动吸入外源基因，并进一步整合到昆虫基因组内，作成能够稳定地遗传和表达的转基因昆虫。是利用价值较低的仪器设备，使一般的技术操作人员能够从事转基因昆虫研究工作。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1以Nistari家蚕品种产卵后8小时以内的蚕卵为实验材料，用4％甲醛浸蚕卵20分钟，进行卵面消毒。采用整合在piggyBac转座子质粒中的GFP(绿色荧关蛋白)外源基因，具体是用pPIGA3GFP质粒和其辅助质粒pHA3PIG系统，导入GFP(绿色荧关蛋白)外源基因。实体显微镜放大倍数采用32倍，用超纯水溶解含有外源基因GFP的DNA质粒及其辅助质粒，调整DNA浓度为500ng/μl，蚕卵表面涂抹的含有外源基因的质粒溶液量为50nl，外源基因涂抹的部位为蚕卵腹侧面。穿刺蚕卵的金属针的针尖直径小于0.1mm。穿刺蚕卵的次数为3次，穿刺后用石蜡封闭穿刺口。实验共穿刺1000粒蚕卵，蚕卵期表达GFP基因的个体达456粒。
实施例2以越南演金黄家蚕品种产卵后2小时以内的蚕卵为实验材料，用75％酒精喷洒蚕卵，进行卵面消毒。采用整合在piggyBac转座子质粒中的DsRed_(红色荧关蛋白)外源基因，具体是用pBac[3×P3-EGFP-P9DsRed-LITR]质粒和其辅助质粒pHA3PIG系统，导入DsRed_(红色荧关蛋白)外源基因。实体显微镜放大倍数采用25倍，用磷酸缓冲液(pH7.6)溶解含有外源基因DsRed的DNA质粒及其辅助质粒，调整DNA浓度为200ng/μl，蚕卵表面涂抹的含有外源基因的质粒溶液量为30nl，外源基因涂抹的部位为蚕卵背侧面。穿刺蚕卵的金属针的针尖直径小于0.05mm。穿刺蚕卵的次数为1次，穿刺后用石蜡封闭穿刺口。实验共穿刺1000粒蚕卵，650蚕卵发育到转青期胚子，共获得58个蚕蛾，其中雌蛾23个，雄蛾35个，雌雄交配后的下一代有2蛾，其中的一龄家蚕幼虫表达DsRed基因。
实施例3以加秋家蚕品种产卵后4小时以内的蚕卵为实验材料，用2％甲醛浸蚕卵30分钟，进行卵面消毒。采用直链基因，带有A3启动子的CAT基因为外源基因，实体显微镜放大倍数采用40倍，用磷酸缓冲液(pH7.6)溶解外源基因，调整DNA浓度为1mg/μl，蚕卵表面涂抹的含有外源基因的溶液量为100nl，外源基因涂抹于蚕卵表面。穿刺蚕卵的金属针的针尖直径小于0.01mm。穿刺蚕卵的次数为2次，穿刺后不用石蜡封闭穿刺口。实验共穿刺5000粒蚕卵，有165蚕卵表达CAT基因。
权利要求
1.昆虫卵可视化自吸式外源基因导入方法，其特征在于(1)产卵后10小时以内的昆虫卵用1％-8％甲醛浸5-120分钟、或用60-80％酒精喷洒卵面，进行消毒处理；(2)外源基因溶解在溶解液中，外源基因的浓度范围为0.1ng/μl～100mg/μl；(3)昆虫卵干燥后，借助放大倍数范围为1-100倍的实体显微镜，在卵表面涂抹含有外源基因的溶液，涂抹溶液量为1nl-10μl；(4)利用金属针穿刺涂有外源基因溶液的昆虫卵表面，依靠金属针进出昆虫卵时造成的液体回流，使昆虫卵自动吸入外源基因，金属针进出昆虫卵的次数为1-5次；(5)昆虫卵金属针穿刺后，用石蜡封闭穿刺口或不封闭穿刺口。
2.根据权利要求1所述的昆虫卵可视化自吸式外源基因导入方法，其特征在于所述的外源基因状态为直链基因、环状基因、或整合在质粒中的基因。
3.根据权利要求1所述的昆虫卵可视化自吸式外源基因导入方法，其特征在于所述的溶解液为超纯水、磷酸缓冲液、或Tris-HCl缓冲液。
4.根据权利要求1所述的昆虫卵可视化自吸式外源基因导入方法，其特征在于所述的金属针的针尖直径小于0.5mm。
全文摘要
本发明公开了一种昆虫卵可视化自吸式外源基因导入方法。是借助实体显微镜的观察，在昆虫卵表面涂抹含有外源基因溶液，在涂抹部位用金属针穿刺昆虫卵数次，依靠金属针进出昆虫卵时造成的液体回流，使昆虫卵自动吸入外源基因，并进一步整合到昆虫基因组内，作成能够稳定遗传和表达的转基因昆虫。本发明可以利用价值较低的仪器设备，使一般的技术操作人员能够从事转基因昆虫研究工作。
文档编号C12N15/85GK1644702SQ200410073439
公开日2005年7月27日 申请日期2004年12月13日 优先权日2004年12月13日
发明者钟伯雄 申请人:浙江大学