专利名称：一种表达外源基因的重组疟原虫及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达外源基因的重组疟原虫及其 应用。
背景技术：
现有的表达载体，特别是用于生物治疗和疫苗设计的表达载体，多为细菌 载体或是病毒载体。这些载体因其自身基因组较小，故能表达外源基因的容量 也就较小。用疟原虫作为表达载体，特别是作为疫苗的表达载体，有很多自身
独特的优点1、诱导强烈的天然免疫反应；2、诱导强烈的Thl型免疫反应， 刺激T淋巴细胞增殖，刺激T淋巴细胞分泌IFN-y，并且能够刺激树突状细胞的 成熟，促进抗原的递呈，作为一种免疫佐剂；3、外源基因的容量大，疟原虫不 但能够表达大的外源基因，而且能够同时容纳，表达多个外源基因，从而可以 同时刺激产生针对多种抗原的免疫反应或表达免疫辅助因子，诱导产生高效的 免疫保护；4、外源基因表达水平高。
但此前，以痴原虫作为载体表达外源蛋白，仍停留在构建表达体系的基础 研究阶段。有报道采用疟原虫表达绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素酶(Luciferase) 和氯霉素乙酰转移酶(CAT)等报告基因和异种的疟原虫基因，仅限于基础研究 范围。
肿瘤是严重威胁人类健康的慢性疾病，肿瘤的治疗仍然是目前人类面临的 重要难题。目前的治疗方法主要以化疗，放疗和手术治疗为主，但生物治疗越 来越引人注目，逐渐成为一种重要的治疗方法，并应用于肺瘤治疗。生物治疗 是指通过生物反应修饰剂(BRM)对^L体进行治疗的一种方法。生物疗法的主要作 用是提高患者的全身免疫功能，尤其在肿瘤治疗中，现已成为继外科、放疗和化疗后最有发展前途的重要的治疗手段之一。生物治疗的主要特点为1、生物 活性功能多，具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节活性。2、作用范围广，在体外这 些生物制剂几乎对所有肿瘤细胞都有抑制效应。3、对机体的免疫功能有调节增 强作用。
正如前面所述，对机体的免疫调节功能是生物治疗的重要特征之一，而疟 原虫感染正好也具有这个特征。用疟疾本身作为一种生物疗法(疟疾疗法)在 历史上曾成功地应用于治疗神经性梅毒，发明该疗法的奥地利医生Wagner Jauregg因而获1927年诺贝尔医学奖。肿瘤的治疗性疫苗作为肿瘤生物疗法的方 法之一在实验室中广泛应用，并在临床中逐渐推广。已有文献报道疟原虫感染 能够直接抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长。但是已有证据表明增强机体对肿瘤特异性 或相关抗原的识别能更有效的加强抑制肿瘤的效果，因此设想表达肿瘤特异性 或相关抗原的重组痴原虫用于肿瘤治疗更加有效。
艾滋病是直接威胁人类健康的重大传染病。95%以上的感染者生活在发展中 国家。迄今为止，宣传教育及对高危人群的行为干预仅能起到减緩传播速度的 作用，而无法终止其流行。高效抗逆转录病毒疗法虽然有效但不能达到彻底清 除体内病毒的目的，因而需要终身服药，对大多数感染者来说价格过于昂贵， 毒副作用较大，容易出现耐药性。艾滋病疫苗被认定为预防和控制艾滋病的最 有效的武器。-f旦艾滋病疫苗的研制面临严重的"f兆战，因为4姿传统的方法研制的 艾滋病疫苗在临床试验中累累失败。近年来，活载体疫苗的研究越来越受到重 视。活载体疫苗是将编码病毒蛋白的基因插入活的表达载体内，通过表达载体 使外源基因在宿主中表达，由此刺激机体产生更强的特异性免疫应答。这可能 是最有希望的艾滋病疫苗之一。
发明内容
本发明提供一种表达外源基因的重组疟原虫，并将该重组疟原虫应用于生 物治疗和疫苗设计中，尤其是肿瘤的生物治疗和HIV疫苗的设计。 本发明的具体技术方案如下
5本发明的一种表达外源基因的重组疟原虫，其外源基因包括抗原基因、治 疗剂基因、免疫调节剂基因或肽基因。
上述重组疾原虫应用在生物治疗中。
优选的，所述的生物治疗包括肺瘤治疗。
优选的，上述肿瘤治疗为将肿瘤相关抗原基因克隆到表达质粒上，得到 重组质粒，在大肠杆菌中复制后提取并纯化，将提取得到的重组质粒转染到症 原虫内，得到表达肿瘤相关抗原的重组痴原虫，最后免疫胂瘤机体。
上述的肺瘤相关抗原基因包括MUC1。 上述的重组痴原虫应用在疫苗设计中。 优选的，所述的疫苗设计包括HIV-1疫苗设计。
优选的，所述的HIV-1疫苗设计为将HIV-1的编码基因克隆到表达质粒 上，得到重组质粒，在大肠杆菌中复制后提取并纯化，将提取得到的重组质粒 转染到痴原虫内，得到表达HIV-1的编码基因的重组疾原虫，最后免疫机体。
优选的，所述的HIV-1的编码基因包括gag基因。 本发明具有如下有益效果
本发明提供的一种重组疟原虫，可用于表达外源基因，包括抗原、治疗 剂、免疫调节剂、肽等希望传递到动物和人或其细胞的任何分子；为在动物和 人或其细胞中引入并表达异源基因、刺激或激发免疫应答提供了 一种新方法， 特别是应用于肿瘤的生物治疗和HIV疫苗的设计方面。
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是pL0015-gag重组质粒的结构图2-A是pL0015-gag重组质粒转染鼠伯氏疟原虫NK65虫4朱得到的NK65-gag重组疟原虫抹的血涂片实验的一个优选实施例的结果图2-B是pL0015-gag重组质粒转染鼠伯氏疾原虫NK65虫抹得到的NK65-gag重组疾原虫抹的western-blot实-睑的一个优选实施例的结果图2-C是pL0015-gag重组质粒转染鼠伯氏疟原虫NK65虫林得到的NK65-
gag重组症原虫才朱PCR的 一个优选实施例的结果图3是重组疟原虫抹NK65-gag免疫小鼠后ELISPOT检测的一个优选实施
例的实验结果图4是重组疟原虫抹NK65-gag免疫小鼠后ELISA检测的一个优选实施例 的实验结果图5是重组痴原虫林NK65-gag免疫小鼠后，Brdu ELISA检测针对HIV-1 gag 肽的增值的一个优选实施例的实验结果图6是鼠重组疟原虫抹NK65-gag免疫小鼠后，用重组表达HIV-1 gag的痘 病毒vaccinia-gag攻毒，检测保护性的一个优选实施例的实验结果图。
具体实施例方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应 理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1:以鼠伯氏痴原虫NK65虫抹为载体表达1型人免疫缺陷病毒 (HIV-1)的gag基因，并将此重组虫抹作为一种HIV的概念性疫苗免疫小鼠， 用斑点酶联免疫实验(ELISPOT )、 酶联免疫实验(ELISA)和大鼠溴脱氧核苷 脲嘧啶酶联免疫实验(Brdu ELISA)等方法检测小鼠针对gag的免疫反应。最 后再用表达Gag蛋白的疽病毒vaccinia-gag攻毒，观察对小鼠的免疫保护效果。
pL0015-gag重组质粒的构建将HIV-1的gag基因克隆到鼠伯氏痴原虫 NK65虫林的表达质粒pL0015上，得到pL0015-gag重组质粒。具体为设计两端 带有BamHl酶切位点的gag引物，后用PCR方法扩增出gflg基因，将pL0015 质粒和此gag产物用BamHl酶切，然后切胶回收，连接，转化到XL-lblue感 受态细菌涂板，挑选转化子经菌落PCR鉴定，酶切鉴定，测序方向鉴定都正确 后得到重组的pL0015-gag质粒。重组的pL0015-gag质粒结构见图1。
pL0015-gag重组质粒转染鼠伯氏疟原虫NK65虫林将保种的转化了pL0015-gag的大肠杆菌XL-lblue菌抹复豕于大肠杆菌XL-lblue菌4木中复制后 提取并纯化。大量培养，提取pL0015-gag，将提取的pL0015-gag质粒转染鼠伯 氏痴原虫，用该虫抹接种小鼠24小时后开始给小鼠每天口服30mg/kg的乙胺嘧 啶，连续四天。用乙胺嘧，定筛选出重组表达gag的鼠重组疟原虫抹NK65-gag, 见图2。图2-A是pL0015-gag重组质粒转染鼠伯氏疟原虫NK65虫林得到的重 组痴原虫抹NK65-gag的血涂片结果图，该图显示NK65-gag重组痴原虫抹为阳 性。图2-B是pL0015-gag重组质粒转染鼠伯氏症原虫NK65虫抹得到的重组症 原虫林NK65-gag的western-blot实验结果图，以NK65虫抹为空白对照，以 pVAX-gag为阳性对照，由图可见，NK65-gag重组痴原虫株为gag阳性表达抹。 图2-C是pL0015-gag重组质粒转染鼠伯氏疾原虫NK65虫抹得到的NK65-gag 重组症原虫抹PCR的结果图；泳道1 - 6分别为DNA分子量标准(DNA marker )、 NK65基因组DNA、 NK65-gag基因组DNA、 NK65-gag基因组DNA、 NK65-gag基因组DNA和pVAXl - gag质粒。
之后取尾静脉血10 |a 1溶于0.2ml生理盐水中，再腹腔接种于一只新的小鼠 体内，此小鼠再每天口服乙胺嘧啶30mg/kg,连续四天。待原虫感染率达到5% 以上时，眼眶采血，保种，并分别提取原虫DNA和蛋白进行鉴定。当4佥测到 Gag蛋白在原虫内有表达后，再将保种的虫林复苏，然后再单克隆化，单克隆化 后的虫抹再用同样的方法鉴定有Gag蛋白表达后，将此能稳定表达Gag蛋白的 重组虫抹命名为pbGAGcon。用同样方法将空质粒pLOOl5转染到鼠伯氏痴原虫 NK65虫林得到的重组虫抹命名为pbEMPTYcon。用pbGAGcon和pbEMPTYcon 分别免疫小鼠。
鼠重组疟原虫抹NK65-gag免疫小鼠后ELISPOT检测用NK65-gag重组 虫林免疫小鼠7天后，杀鼠取脾脏分出脾淋巴细胞，体外用HIV-1的gag肽刺 激，检测到针对HIV-1的gag的特异性IFN-y的分泌，见图3。
鼠重组疾原虫抹NK65-gag免疫小鼠后ELISA检测用NK65-gag重组虫抹 免疫小鼠30天后，眼眶采血分离出血清，用ELISA法检测血清中gag抗体的滴 度，见图4。图4显示，用pbGAGcon免疫小鼠后小鼠中的gag抗体滴度明显高8于用pbEMPTYcon免疫小鼠后及没有免疫的小鼠中的gag抗体滴度，说明该重 组痴原虫虫抹pbGAGcon能较好的剌激机体对gag的免疫反应。
鼠重组痴原虫抹NK65-gag免疫小鼠后，Brdu EL1SA检测针对HIV-1 gag 肽的增值用NK65-gag重组虫林免疫小鼠21天后，杀鼠取脾脏分出脾淋巴细 胞，体外用HIV-1的gag肽刺激，检测到针对HIV-1的gag肽刺激的特异性淋 巴细胞的增殖，见图5。图5中吸光度表示脾细胞增殖情况，a表示gag肽刺激 的脾细胞与对照相比增殖明显，在统计学上差异有显著性。
鼠重组痴原虫林NK65-gag免疫小鼠后，用重组表达HIV-1 gag的疸病毒 vaccinia-gag攻毒，检测保护性用NK65-gag重组虫抹免疫小鼠30天后，腹腔接 种vaccinia-gag痘病毒，4天后，处死小鼠取卵巢，超声粉碎，研磨卵巢，检测 小鼠卵巢内vaccinia-gag的病毒滴度，检测到经鼠重组疟原虫株NK65-gag免疫 后，小鼠卵巢内病毒载量在免疫组较对照组低，见图6。图6中承表示重组gag 的痴原虫免疫的小鼠与空载体疟原虫免疫的小鼠相比，对vaccinia-gag的攻毒实 验后的病毒滴度有统计学上的差异显著性。
实施例2:用鼠伯氏疾原虫NK65虫抹为表达载体，并应用于肿瘤疫苗的设 计。将肿瘤相关抗原mucl基因克隆到鼠伯氏疟原虫NK65虫林的表达质粒 pL0015上，得到pL0015-mucl重组质粒。经鉴定方向正确后，于大肠杆菌 XL-lblue菌株中复制后提取并纯化。将提取的重组质粒pL0015-mucl转染到鼠 伯氏痴原虫NK65虫抹内，用该虫林接种小鼠24小时后开始给小鼠每天口服乙 胺嘧啶30mg/kg,连续四天。之后取尾静脉血10^1溶于0.2ml生理盐水中，再 腹腔接种于一只新的小鼠体内，此小鼠再每天口服乙胺嘧啶30mg/kg,连续四天。 待原虫感染率达到5%以上时，眼眶采血，保种，并分别提取原虫DNA和蛋白 进行鉴定。当检测到MUC1蛋白在原虫内有表达后，再将保种的虫林复苏，然 后再单克隆化，单克隆化后的虫株再用同样的方法鉴定有MUC1蛋白表达后免 疫小鼠，观察对接种有转染mucl基因的肿瘤的荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制效果和 荷瘤小鼠生存时间。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
权利要求
1、一种表达外源基因的重组疟原虫，其特征在于，所述外源基因包括抗原基因、治疗剂基因、免疫调节剂基因或肽基因。
2、 权利要求1所述的重组疟原虫在生物治疗中的应用。
3、 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的生物治疗包括肿瘤治疗。
4、 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的肺瘤治疗为将肿瘤 相关抗原基因克隆到表达质粒上，得到重组质粒，在大肠杆菌中复制后提取并 纯化，将提取得到的重组质粒转染到痴原虫内，得到表达肿瘤相关抗原的重组 痴原虫，最后免疫肿瘤机体。
5、 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤相关抗原基因包 括MUC1。
6、 权利要求1所述的重组疟原虫在疫苗设计中的应用。
7、 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的疫苗设计包括HIV-1 疫苗设计。
8、 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的HIV-1疫苗设计为 将HIV-1的编码基因克隆到表达质粒上，得到重组质粒，在大肠杆菌中复制后提取并纯化，将提取得到的重组质粒转染到疟原虫内，得到表达HIV-1的编码 基因的重组症原虫，最后免疫机体。
9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的HIV-1的编码基因包 括gag基因。
全文摘要
本发明公开了一种表达外源基因的重组疟原虫，该重组疟原虫中的外源基因包括抗原基因、治疗剂基因、免疫调节剂基因或肽基因。本发明还将该重组疟原虫应用于生物治疗和疫苗设计中，尤其是肿瘤的生物治疗和HIV疫苗的设计。本发明该种重组疟原虫，可用于表达外源基因，包括抗原、治疗剂、免疫调节剂、肽等希望传递到动物和人或其细胞的任何分子；为在动物和人或其细胞中引入并表达异源基因、刺激或激发免疫应答提供了一种新方法，特别是应用于肿瘤的生物治疗和HIV疫苗的设计方面。
文档编号C12N1/11GK101492643SQ20091003718
公开日2009年7月29日 申请日期2009年2月13日 优先权日2009年2月13日
发明者波 姜, 莉 秦, 陈小平 申请人:中国科学院广州生物医药与健康研究院