专利名称：提高外源基因在植物体内表达水平的核苷酸序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，主要是一种提高外源基因在植物体内表达水平的核苷酸序列。
背景技术：
近来越来越多的研究表明，基因的3’ UTR可通过影响mRNA的稳定性调节基因表 达。已经有实验证实，在mRNA3’UTR中存在降解相关元件，在影响mRNA稳定上起重要作用。 除此之外，3’UTR可以多种方式调控基因表达，如mRNA前体的加工过程及有效的poly (A)聚 合依赖于3’UTR中的加尾信号，而poly㈧尾巴与mRNA的稳定与翻译密切相关；另外3’UTR 序列中包含的一些元件、序列可以调节mRNA的稳定性。富含AU区(AU_rich region, ARE) 是在3’ UTR中发现得较早的一个元件，通常被认为是一个导致mRNA稳定性下降的元件，并 且3’ UTR中ARE越多越不稳定。与此相反，转铁蛋白受体基因和铁蛋白基因的3’ UTR中含 有IRE元件，在缺乏铁离子的时候可以阻止mRNA降解。这些元件可能通过与其结合的RNA 结合蛋白影响mRNA的稳定性和正常的翻译。鉴于3’UTR具有调节基因表达的特点，我们就 可以利用其特点来增加基因的稳定性，进而提高基因表达。
发明内容
本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种提高外源基因在植物体内表达水平 的核苷酸序列，本发明的序列能够增加基因的转录产物提高基因表达。本发明解决其技术问题采用的技术方案这种提高外源基因在植物体内表达水平 的核苷酸序列，它是SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，atttcttttt cttgtcaact ttattgcatt cattcatgataataattgtc ttagt。本发明提供一段核苷酸序列，将它连接到基因编码区的下 游后再进行常规的外源基因在植物体内的表达过程，可提高外源基因表达水平1倍以上。1)序列的获得以拟南芥总 DNA 为模板，用 Pl (ATTTCTTTTTCTTGTCAACT)禾口 P2 (ACTAAGACAATTATTATCATGAA)引物进行 PCR 反应。扩增体系如下10 X PCR buffer 5 μ 1， 15mM MgCl2IOy 1，IOmM dNTPs 2 μ 1，IOmM Pf 禾口 Pu 各 3 μ 1，Taq 酶(5U/μ 1) 1 μ 1，无菌水补 足50 μ 1。反应条件为95°C预变性3min ；93°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lm，35个循 环；72°C延伸IOmin。目的PCR产物大小约65bp，PCR产物经Qiagen凝胶纯化试剂盒纯化 后,利用 Promega T-vector 进行 PCR片段的 TA 克隆，条件如下2XPromega Iigasebuffer 5ul, T-vector Iul，PCR 回收片段 2ul，Promega T4_ligase lul，无菌水 lul，混勻后 4°C反 应16h。反应完毕后，取IOul反应液加入到含有IOOul大肠杆菌感受态细胞的离心管中，轻 轻混勻冰上放置30m后，42°C热激90s，立即放置冰上2_3m，向离心管中加入LB液体培养基 890ul。将离心管放于37°C摇床上震动培养Ih后，取300ul培养液涂布于含有lOOmmol/L 氨苄青霉素、lmmol/L IPTG和10mg/L的固体LB培养基上，37°C培养14h。之后选择白色的 菌斑送上海Invitrogen公司测序。含有插入序列的克隆命名为T-I。
2)序列的应用方法利用分子生物学实验技术将获得序列连到外源基因编码区终止密码子的下游，以融合片段作为一个整体进行常规的植物表达载体构建后进行外源基因在植物体内的表达， 即可提高外源基因在植物体内的表达水平。本发明有益的效果是本发明的序列，可提高外源基因在植物体内的表达水平。
图1 本发明序列连接到GFP的末端后提高GFP在烟草叶片内的表达水平示意图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明实施例应用本发明提高GFP在烟草叶片内的表达水平①序列的克隆以拟南芥总 DNA 为模板，用 Pl (ATTTCTTTTTCTTGTCAACT)禾口 P2 (ACTAAGACAATTATTATCATGAA)引物进行 PCR 反应。扩增体系如下10 X PCR buffer 5 μ 1， 15mM MgC1210y 1, IOmM dNTPs 2μ 1, IOmM Pf 禾口 Pu 各 3 μ l，Taq 酶(5U/μ 1) 1 μ 1(购自大 连Takara公司)，无菌水补足50 μ 1。反应条件为95°C预变性3min ；93°C变性30s，55°C退 火30s，72°C延伸lm，35个循环；72°C延伸lOmin。目的PCR产物大小约65bp，PCR产物经 Qiagen凝胶纯化试剂盒(德国Qiagen公司)纯化后，利用Promega T-vector (美国Promega 公司)进行PCR片段的TA克隆，条件如下2XPromega ligase buffer 5ul,T-vector lul, PCR 回收片段 2ul，Promega T4_ligase lul (美国 Promega 公司)，无菌水 lul，混勻后 4°C 反应16h。反应完毕后，取IOul反应液加入到含有IOOul大肠杆菌感受态细胞的离心管中， 轻轻混勻冰上放置30m后，42°C热激90s，立即放置冰上2_3m，向离心管中加入LB液体培养 基890ul。将离心管放于37°C摇床上震动培养Ih后，取300ul培养液涂布于含有IOOmmol/ L氨苄青霉素、lmmol/L IPTG和10mg/L的固体LB培养基上，37°C培养14h。之后选择白色 的菌斑送上海Invitrogen公司测序。含有插入序列的克隆命名为T-I。②序列与GFP的融合根据测得的序列，设计引物P3 (ACAAACATGACGAACTCTAAATTTCTTTTTCTTGTCAACT) 和P4(GAGCTCACTAAGACAATTATTATCATGA，下划线为SacI识别位点)，以T-I载体为模板进 行 PCR 反应。扩增体系如下10XPCR buffer 5 μ 1,15mM MgCl2IO μ 1，IOmM dNTPs 2μ 1, IOmM Pf和Pu各3μ l，Taq酶(5U/μ 1) 1 μ 1 (购自大连Takara公司)，无菌水补足50μ 1。 反应条件为95°C预变性3min ；93°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸lm，35个循环；72°C延 伸lOmin。目的PCR产物大小约65bp，PCR产物(产物1)经Qiagen凝胶纯化试剂盒(德 国Qiagen公司)纯化。根据pBinGFP中的GFP序列和本发明序列设计引物P5 (GAATTCATG AAGACTAATCTTTTTCTCTTT，下划线为 BamHI 识别位点)和 P6 (GTTGACAAGAAAAAGAAATTTAGAG TTCGTCATGTTTGT)，以pBinGFP质粒为模板扩增GFP序列。扩增体系如下10 X PCR buffer 5 μ 1,15mM MgCl2IOy 1, IOmM dNTPs 2 μ 1, IOmM Pf 禾口Pu各 3μ l，Taq 酶(5U/μ 1) 1 μ 1 (大 连Takara公司)，无菌水补足50 μ 1。反应条件为95°C预变性3min ；93°C变性30s，55°C退 火30s，72°C延伸lm，35个循环；72°C延伸IOmin。目的PCR产物大小约750bp，PCR产物(产物2)经Qiagen凝胶纯化试剂盒(德国Qiagen公司)纯化。将产物1和产物2稀释100 倍后混合，以此为模板，用P4和P5为引物进行PCR反应。扩增体系如下10XPCR buffer 5 μ 1,15mM MgCl2IOy 1, IOmM dNTPs 2 μ 1, IOmM Pf 禾口Pu各 3μ l，Taq 酶(5U/μ 1) 1 μ 1 (大 连Takara公司)，无菌水补足50 μ 1。反应条件为95°C预变性3min ；93°C变性30s，55°C 退火30s，72°C延伸lm，35个循环；72°C延伸IOmin。PCR产物经Qiagen凝胶纯化试剂盒纯 化后，利用Promega T-vector (美国Promega公司)进行PCR片段的TA克隆，条件如下 2XPromega ligase buffer 5ul, T-vector Iul，PCR 回收片段 2ul，Promega T4-ligase Iul (美国Promega公司)，无菌水Iul，混勻后4°C反应16h。反应完毕后，取IOul反应液加 入到含有IOOul大肠杆菌感受态细胞的离心管中，轻轻混勻冰上放置30m后，42°C热激90s， 立即放置冰上2-3m，向离心管中加入LB液体培养基890ul。将离心管放于37°C摇床上震 动培养Ih后，取300ul培养液涂布于含有100mmol/L氨苄青霉素、lmmol/L IPTG和IOmg/ L的固体LB培养基上，37°C培养14h。之后选择白色的菌斑送上海Invitrogen公司测序。 测序正确的克隆命名为T-GFP-1。③融合GFP在烟草叶片内的表达将T-GFP-I中的融合片断经BamHI和SacI酶切后连入同样酶切的pCV1300中，构建pCVGFP-Ι载体；同时，利用同样的方法构建只含有GFP序列、不含有本发明核苷酸序列的 PCVGFP载体。将两个载体分别转入农杆菌EHA105后，应用瞬时表达系统注射本氏烟草叶 片，3天后观测烟草叶片GFP荧光变化，并通过real-time PCR检测GFP表达情况，结果如图 2所示。在表达有pCVGFP-Ι的区域，GFP荧光明显较强，而在表达有pCVGFP的区域，GFP荧 光相对较弱(图la)。real-time PCR的结果也表明，pCVGFP_l区域的GFP表达水平要高 出pCVGFP区域的GFP表达水平1倍以上(图lb)。实施效果利用本发明序列，可提高实验中GFP基因在植物体内的表达水平。 除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形 成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
权利要求
一种提高外源基因在植物体内表达水平的核苷酸序列，其特征是它是SEQ ID No1所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及一种提高外源基因在植物体内表达水平的核苷酸序列，它是SEQ ID No1所示的核苷酸序列，本发明提供一段核苷酸序列，将它连接到基因编码区的下游后再进行常规的外源基因在植物体内的表达过程，可提高外源基因表达水平1倍以上。本发明有益的效果是利用分子生物学实验技术将本发明序列连到外源基因编码区终止密码子的下游，以融合片段作为一个整体进行常规的植物表达载体构建后进行外源基因在植物体内的表达，即可提高外源基因在植物体内的表达水平。
文档编号C12N15/113GK101870973SQ201010201208
公开日2010年10月27日 申请日期2010年6月4日 优先权日2010年6月4日
发明者和琼姬, 彭杰军, 林林, 燕飞, 程晔, 郑红英, 陈剑平, 鲁宇文 申请人:浙江省农业科学院