专利名称：一种用于hek293细胞高效表达外源基因的表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于HEK293细胞高效表达外源基因的表达载体。具体地说是利 用HEK293细胞的看家基因肽延伸因子的转录调控序列促进外源基因在HEK293细胞中的高 效表达。
背景技术：
HEK293细胞是Graham等在1977年构建的永生化人胚肾上皮细胞系。因其具有 良好的翻译后修饰能力而被广泛的用于诸多人源蛋白质的功能研究，同时它也被广泛的 用作病毒的包装宿主。在细胞工程领域，HEK293细胞也得到了应用，例如生产人蛋白C。 人源宿主细胞中所特有的一些酶类有利于帮助重组蛋白折叠成正确的构象从而改善其生 物学活性。例如，人源宿主细胞中存在a-2，6唾液酸转移酶，它对蛋白进行a-2，6位的 唾液酸修饰，能提高蛋白的生物学活性，具有0-2，6唾液酸连接的低聚糖的〖 々(^%116 plasminogen activator，组织型纤溶酶原激活剂)产品质量提高。在人源宿主细胞中含有 3 1，4-N-羟乙酰神经氨酸转移酶IlKGnTIII)，对目的蛋白进行修饰，可延长糖蛋白的半 衰期。用具有此酶的宿主细胞生产的单克隆抗体，对于诱导ADCC(antib0dy-d印endentcel 1-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导细胞毒作用)更为有效，可减少抗体用量。 因此有必要开发以人源细胞为宿主的重组蛋白表达系统。启动子的强弱直接关系到外源基因在宿主细胞中的表达水平，为提高外源基因的 转录效率，必须尽可能的选用高活性的启动子。目前在真核细胞中最常用的启动子为人的 CMV启动子，它有比较广泛的宿主细胞，也是比较强的启动子。但是研究发现，该启动子内存 在CpG岛容易导致沉默效应；仅在细胞周期的S期起作用，因此寻找比CMV更好的启动子是 必要的。人们一直在寻找，高强度适应性广的启动子，Kalwy S用鼠的mCMV启动子在CH0-K1 细胞中表达GFP，是人的CMV启动子的3倍，但在表达抗体这样的蛋白时，表达能力却比较弱 不如人的CMV启动子。Gershon TJ等通过人工设计合成了一个能够增加基因表达的核心启 动子，体内外研究表明它比CMV核心启动子显著性提高报告基因荧光素酶的表达水平，这 就为寻找高活性启动子提供了另一种思路，有可能创造出自然界不存在的高强度的人工启 动子。ProBioGen公司，克隆了细胞内广泛存在的启动子，强度比CMV强，非细胞周期依赖， 能够对抗基因沉默，在细胞中稳定表达50代以上，很可能细胞内源性启动子更有利于重组 蛋白基因的转录调控。肽延伸因子在细胞整个周期中都处于高表达，不受细胞周期影响的看家基因，其 基因座序列可能含有一些有利于基因表达的转录调控序列，与细胞的反式作用因子共同作 用，促进基因的高表达。我们根据Genbank的报告的序列，克隆了 HEK293细胞的肽延伸因 子1的5'端和3'端4Kb的调控序列，用来构建不同的表达载体，以EGFP为报告基因，确 定了同时存在肽延伸因子1的5’端和3’端的调控序列时EGFP的表达水平最高，为对照载 体的7倍。用这个载体在HEK293细胞中表达外源基因tPA和proUK能够提高表达2_5倍。肽延伸因子的转录调控序列与我们构建的人工转录因子结合，能够提高EGFP的表达15倍。
发明内容
本发明的目的是提供一种在HEK293细胞中高效表达外源基因的载体。本发明的另一目的在于提供上述载体的构建方法。本发明的第三个目的在于是提供这种载体的调控元件的核苷酸序列，其具有序列 表中SEQ No. 1和SEQ No. 2所述的序列。本发明的第四个目的是提供调控元件的组合应用。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案培养HEK293细胞，然后提取基因组DNA，通过PCR的方法扩增人HEK293细胞的 肽延伸因子1的5’端和3’端4kb的调控序列，用调控序列的不同组合，以EGFP为报告 基因，通过流式细胞仪测定EGFP的荧光强度，确定载体的最佳组合，再用外源基因tPA和 proM(prourokinase，尿激酶原)验证其有效性。一种用于HEK293细胞高效表达外源基因的表达载体，其具有图2E所示结构。所述的用于HEK293细胞高效表达外源基因的表达载体，其是对p⑶NA3. 1 (+)进行 改构，引物BGH1(SEQ ID No. 7)含Xbal酶切位点，BGH2 (SEQ ID No. 8)含BspEI酶切位点， FORI (SEQ ID No. 9)含 BspEI 酶切位点，F0R2 (SEQ ID No. 10)含 Xmal 酶切位点；通过 PCR 的方法以P⑶NA3. 1 (+)为模板，分别扩增出200bp和800bp的片断，胶回收后分别用Xbal、 BspEI酶切200bp的片段，BspEI、Xmal酶切800bp的片断，Xbal、Xmal酶切后胶回收大片 断，再将载体与200bp和800bp片断连接，至此在pcDNA3. 1 (+)的BGHPA处引入BspEI酶切 位点；在改构的pcDNA3. 1 (+)的EcoRV处连入EGFP报告基因得出pcDNA3. 1 (+) /EGFP载体， 利用SEQID No. 1所示的肽延伸因子1基因5’端调控序列和SEQ ID No. 2所示的肽延伸因 子1基因3’端调控序列替代替换pcDNA3. 1 (+) /EGFP中的CMV启动子和BGHPA。一种构建上述载体的方法，具有如下步骤(1)提取 HEK293 基因组 DNA ；(2)利用SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示引物扩增肽延伸因子1的4Kb的5，端 调控序列，扩增产物含Nhel和Mlul酶切位点，所述肽延伸因子1的5’端调控序列具有SEQ ID No. 1所示序列；(3)再利用SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示引物扩增肽延伸因子1的4Kb的3， 端调控序列，所述肽延伸因子1的3’端调控序列具有SEQ ID No. 2所示序列，扩增产物含 Xbal和BspEI酶切位点；(4)对 pCDNA3. 1 (+)进行改构，引物 BGH1 (SEQ ID No. 7)含 Xbal 酶切位点， BGH2 (SEQ ID No. 8)含 BspEI 酶切位点，FORI (SEQ ID No. 9)含 BspEI 酶切位点，F0R2 (SEQ ID No. 10)含Xmal酶切位点；通过PCR的方法以pCDNA3. 1 (+)为模板，分别扩增出200bp 和800bp的片断，胶回收后分别用Xbal、BspEI酶切200bp的片段，BspEI、Xmal酶切800bp 的片断，Xbal、Xmal酶切后胶回收大片断，再将载体与200bp和800bp片断连接，至此在 pcDNA3. 1 (+)的BGHPA处引入BspEI酶切位点；(5)在步骤⑷改构的pcDNA3. 1⑴的EcoRV处连入EGFP报告基因得出 pcDNA3. 1 (+) /EGFP 载体；
(6)利用SEQ ID No. 1所示的肽延伸因子1基因5，端调控序列和SEQ ID No. 2 所示的肽延伸因子1基因3’端调控序列替代替换pcDNA3. 1 (+)/EGFP中的CMV启动子和 BGHPA。在上述载体的上游加上人工转录因子结合序列2UAS。一种用于扩增所述转录调控外源基因在HEK293细胞中高效表达的5’端核苷酸序 列的引物，所述引物具有SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示序列。一种用于扩增所述转录调控外源基因在HEK293细胞中高效表达的3’端核苷酸序 列的引物，所述引物具有SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示序列。本发明的优点是(1)本发明是通过分子生物学手段获得HEK293细胞内源性转录 调控序列构建的表达载体更适合于细胞的转录调控因子的结合(2)所获得的调控序列在 对在细胞周期的所有阶段都具有活力，促进所调控的基因在HEK293细胞中高效表达。下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1人的肽延伸因子1基因的转录调控序列的PCR产物；图2含人肽延伸因子1不同序列的载体构建(A为pcDNA3. 1 (+)/EGFP载体；B为 HEF/EGFP 载体；C 为 PEF1/EGFP 载体；D 为 cmvHEF3utr/EGFP 载体；E 为 HEF53utr/EGFP 载 体)；图 3 表达 proUK 和 tPA 的载体图(A 为 HEF53utr/proUK 载体；B 为 HEF53utr/tPA 载体)；图4人的肽延伸因子1基因的转录调控序列与人工转录因子序列结合载体(A为 PcDNA3. l/GVP4/Hygro 载体；B 为 HEF53utr/EGFP 载体)。
具体实施例方式实施例1人的肽延伸因子1的基因转录调控序列的克隆。1.HEK293细胞基因组DNA序列的提取HEK293细胞用D/F培养基5%血清培养至细胞方瓶长满，胰酶消化。按 TAKARAGeneBall Genome preparation kit 操作说明书提取 HEK293 细胞基因组 DNA。2.人的肽延伸因子1的基因转录调控序列的克隆根据Genbank的报告的序列设计如下引物，见SEQ ID No. 3-6所示HuEFl (SEQ ID No. 3) :5-ata acgcgt CCCAAAACAC ATTTACGAGC CTCAACATCGTTACTG-3HuEF2 (SEQ ID No. 4) :5-ata gctagc TCA CGACACCTGA AATGGAAGAA AAAAACTTTGAACC-3HuEF3 (SEQ ID No. 5) 5-ata tctaga ATATTATCC CTAATACCTG CCACCCCACTCTTAATCAGT GG-3HuEF4 (SEQ ID No. 6) :5-ata tccgga CATTAAAAAG TAAGAGATTA CTGATATATACAGGCTCACG-3用引物HuEFl和HuEF2扩增肽延伸因子1的4kb的5，端调控序列，扩增产物含Nhel和Mlul酶切位点；包括启动子和内含子1的序列，引物HuEF3和HuEF4扩增肽延伸因 子1的4kb的3’端调控序列，扩增产物含Xbal和BspEI酶切位点。采用宝生物公司的LA Ta 去 DNA 聚合酶。扩增条件为 94°C 5min,94°C 30sec,60°C 30sec,72°C 4min，30 个循环， 72°C延伸lOmin，扩增产物1 %琼脂糖胶回收，与T载体连接。酶切和测序结果表明所获得 的序列为正确序列。实施例2含人肽延伸因子1不同序列的载体构建1.对 pCDNA3. 1(+)进行改构合成以下引物BGH1(SEQ ID No. 7) 5-TCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAAC-3BGH2(SEQ ID No. 8) :5-ATATCCGGACTCAGAAGCCATAGAGCCCACC_3FORI(SEQ ID No. 9) 5-ATATCCGGAGCGGAAAGAA CCAGCTGGGG-3F0R2(SEQ ID No. 10) 5-TATACAAGCTCCCGGGAGCTTTTTGC-5引物BGH1含Xbal酶切位点，BGH2含BspEI酶切位点，FORI含BspEI酶切位点， F0R2含Xmal酶切位点。通过PCR的方法以p⑶NA3. 1⑴为模板，分别扩增出200bp和 800bp的片断，胶回收后分别用Xbal、BspEI酶切200bp的片段，BspEI、Xmal酶切800bp 的片断，Xbal、Xmal酶切后胶回收大片断，再将载体与200bp和800bp片断连接，至此在 pcDNA3. 1 (+)的BGHPA处引入BspEI酶切位点。2.含EGFP报告基因不同载体的构建在pcDNA3. 1 (+)的 EcoRV 处连入 EGFP 报告基因，命名为 pcDNA3. 1 (+) /EGFP (图 2A所示结构)，作为对照载体，然后用1. 7kb的PEF1启动子(来自invitrogen)替换 pcDNA3. 1 (+) /EGFP中的CMV启动子，构建的载体命名为PEF1/EGFP (图2C所示结构)， 用4kb的HEF-alpha启动子替换pcDNA3. 1 (+) /EGFP中的CMV启动子，构建的载体命名 为HEF/EGFP (图2B所示结构)，用4kb的HEF-alpha基因3，端通过Xbal和BsPEI替 换pcDNA3. 1 (+) /EGFP中的BGHPA，命名为cmvHEF3utr/EGFP (图2D所示结构)，同时用 HEF-alpha基因的5，和3，端调控序列替换pcDNA3. 1 (+)/EGFP中的CMV启动子和BGHPA， 命名为HEF53utr/EGFP (图2E所示结构)。实施例3载体转染HEK293细胞和报告基因EGFP荧光表达强度的测定转染前一天，HEK293细胞以7. 5X105细胞铺板6孔板，细胞过夜培养，将表 达载体 pcDNA3. 1/EGFP 与 pcDNAPEF/EGFP、pcDNA HEF5UTR/EGFP, pcDNAHEF5UTR/EGFP/ HEF3UTR、pcDNACMV/EGFP/HEF3UTR ；按等摩尔比转染进HEK293细胞中，转染试剂用 LipOfectamineTM2000，操作方法按试剂说明书进行。转染后24小时，用胰酶消化细胞，一孔6孔板接种至一板24孔板，24h后待细胞贴 壁后，培养基换为含抗生素G418 0.3mg/ml。3_4d换一次液。直到2周后待阳性克隆长出。 胰酶消化，收集阳性细胞，2000r/min离心5min，用PBS悬浮细胞，用非转染的HEK293细胞 作空白对照，用Clonetech公司流式细胞仪BDFACS Calibur测定EGFP荧光强度，细胞总数 设定为100000，结果见表1。表1不同载体表达的荧光强度单位 实施例4用人的肽延伸因子1的基因转录调控序列表达proUK和tPA通过实施例3表明载体HEF53utr/EGFP表达EGFP的荧光强度最强，表明用人的肽 延伸因子1的基因5’和3’端调控序列在293细胞中表达外源基因效果更好，进一步用外 源基因proUK和tPA来验证此载体的效果。通过Nhel和Xhol酶切位点在HEF53utr/EGFP上，用proUK和tPA基因替换EGFP 基因，构成载体HEF53utr/proUK(图3A所示结构)、HEF53utr/tPA (图3B所示结构)。载 体用Sail线性化后，用脂质体Lipofectamine 2000转染HEK293细胞，0. 3mg/ml G418筛 选阳性细胞，2周后采用体外纤维蛋白琼脂板溶圈法检测proM和tPA体外纤维蛋白溶解活 性。结果见下表2表2载体表达proUK和tPA结果 实施例5用人的肽延伸因子1的基因转录调控序列与人工转录因子结合促进EGFP 的高效表达在实施例3的表达载体HEF53utr/EGFP的上游加上人工转录因子结合序列2UAS， 与表达人工转录因子的载体PcDNA3. l/GVP4/Hygro (图4A所示结构)(见文章李世崇等， 人工转录因子促进外源基因在CH0细胞中的高效表达，生物工程学报，2007，vol. 23(1) 21-26)共转染，用抗生素新霉素、潮霉素双筛选，两个星期后，克隆细胞用流式测定EGFP表 达强度，与PcDNA3. 1/EGFP和HEF53utr/EGFP (图4B所示结构)比较能够提高表达15倍和 2倍，结果见表3。表3人工转录因子与载体结合表达的荧光强度单位
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权利要求
一种转录调控外源基因在HEK293细胞中高效表达的5’端核苷酸序列，其具有序列表中SEQ ID No.1所述的序列。
2.一种调控外源基因在HEK293细胞中高效表达的3’端核苷酸序列，其具有序列表中 SEQ ID No. 2所述的序列。
3.人的肽延伸因子1的基因5’端和3’端转录调控序列组合构建的高效表达载体。
4.一种用于HEK293细胞高效表达外源基因的表达载体，其特征在于，其具有图2E所示 结构。
5.根据权利要求4所述的用于HEK293细胞高效表达外源基因的表达载体，其特征在 于，其是对PCDNA3. 1⑴进行改构，引物BGH1(SEQ ID No. 7)含Xbal酶切位点，BGH2 (SEQ ID No. 8)含 BspEI 酶切位点，FORI (SEQ ID No. 9)含 BspEI 酶切位点，F0R2 (SEQ ID No. 10)含 Xmal酶切位点；通过PCR的方法以pCDNA3. 1 (+)为模板，分别扩增出200bp和800bp的片 断，胶回收后分别用XbaI、BspEI酶切200bp的片段，BspEI、XmaI酶切800bp的片断，Xbal、 Xmal酶切后胶回收大片断，再将载体与200bp和800bp片断连接，至此在pcDNA3. 1 (+)的 BGHPA处引入BspEI酶切位点；在改构的pcDNA3. 1 (+)的EcoRV处连入EGFP报告基因得出 pcDNA3. 1 (+)/EGFP载体，利用SEQ ID No. 1所示的肽延伸因子1基因5，端调控序列和SEQ ID No. 2所示的肽延伸因子1基因3’端调控序列替代替换pcDNA3. 1 (+)/EGFP中的CMV启 动子和BGHPA。
6.根据权利要求5所述的用于HEK293细胞高效表达外源基因的表达载体，其特征在 于，在权利要求5所述载体的上游加上人工转录因子结合序列2UAS。
7.—种构建权利要求5所述载体的方法，其特征在于，具有如下步骤(1)提取HEK293基因组DNA；(2)利用SEQID No. 3和SEQ ID No. 4所示引物扩增肽延伸因子1的4Kb的5，端调控 序列，扩增产物含Nhel和Mlul酶切位点，所述肽延伸因子1的5’端调控序列具有SEQ ID No. 1所示序列；(3)再利用SEQID No. 5和SEQ ID No. 6所示引物扩增肽延伸因子1的4Kb的3，端调 控序列，所述肽延伸因子1的3’端调控序列具有SEQ ID No. 2所示序列，扩增产物含Xbal 和BspEI酶切位点；(4)对pCDNA3. 1 (+)进行改构，引物 BGH1 (SEQ ID No. 7)含 Xbal 酶切位点，BGH2 (SEQ ID No. 8)含 BspEI 酶切位点，FORI (SEQ ID No. 9)含 BspEI 酶切位点，F0R2 (SEQID No. 10) 含Xmal酶切位点；通过PCR的方法以p⑶NA3. 1⑴为模板，分别扩增出200bp和800bp的片 断，胶回收后分别用XbaI、BspEI酶切200bp的片段，BspEI、XmaI酶切800bp的片断，Xbal、 Xmal酶切后胶回收大片断，再将载体与200bp和800bp片断连接，至此在pcDNA3. 1 (+)的 BGHPA处引入BspEI酶切位点；(5)在步骤⑷改构的pcDNA3.1(+)的EcoRV处连入EGFP报告基因得出pcDNA3. 1(+)/ EGFP载体；(6)利用SEQID No. 1所示的肽延伸因子1基因5’端调控序列和SEQ ID No. 2所示的 肽延伸因子1基因3’端调控序列替代替换pcDNA3. 1 (+)/EGFP中的CMV启动子和BGHPA。
8.—种构建权利要求6所述载体的方法，其特征在于，在权利要求6所述步骤(6)制备 得到都得载体上游加上人工转录因子结合序列2UAS。
9.一种用于扩增权利要求1所述转录调控外源基因在HEK293细胞中高效表达的5’端 核苷酸序列的引物，其特征在于，所述引物具有SEQ ID No.3*SEQ IDNo.4所示序列。
10.一种用于扩增权利要求2所述转录调控外源基因在HEK293细胞中高效表达的3’ 端核苷酸序列的引物，其特征在于，所述引物具有SEQ ID No. 5和SEQ IDNo.6所示序列。
全文摘要
本发明公开了一种构建在HEK293细胞中高效表达外源基因的载体的方法，构建这种载体的转录调控序列的核苷酸序列。用构建的高效表达载体表达外源基因EGFP、proUK、tPA分别是对照载体的7倍、5倍、和2倍与人工转录因子结合能够促进EGFP的表达与PcDNA/3.1/EGFP比较能够提高15倍。
文档编号C12N15/113GK101864420SQ201010164368
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月6日 优先权日2009年5月6日
发明者刘兴茂, 刘红, 叶玲玲, 吴本传, 李世崇, 王启伟, 陈昭烈 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所