专利名称：外源基因等位性的制作方法
技术领域：
和背景本发明涉及遗传工程方面的新概念，依照这一新概念对真核生物体进行转化和杂交，使其子代染色体对的第一染色体上包含第一外源基因，染色体对的第二染色体上包含第二外源基因，上述的外源基因表现为等位关系，因此强制性地分配到不同的配子中。本发明进一步涉及实施这一新概念的表达盒，及为在植物中获得可逆的雄性不育而实施该新概念的方法，并进一步涉及由此获得的植物和植物产品。
该基因是基本的遗传功能单位。这一基因概念由Mendel在1865年根据他在豌豆上进行实验的结果首次提出。Mendel提出一种特异性特征的遗传决定因素作为一个单元从一代传到下一代，而且各单元之间不相混合，即现在所谓的“一基因一性状理论”。
Mendel提出的两条定律作为现代遗传学的基础。Mendel第一条理论称，一个基因对的两个成员(等位基因)强制性地分配到不同的配子中，因此一半的配子携带基因对中的一个成员(等位基因)，另一半配子携带基因对中的另一成员(等位基因)。Mendel的第二条定律称，在配子形成过程中，一个基因对中的等位基因分离相对于其它基因对上的等位基因而言是独立的。
依照Mendel的研究，即染色体的发现和在单一染色体上位置相近的基因之间的连锁的存在，对我们关于遗传性状的知识作出了进一步的贡献。目前已知Mendel的第二条定律对定位于不同染色体上的基因，和位于同一染色体上距离至少50厘摩(cM)的基因同样是正确的，但对于定位于同一染色体上位置更近的基因，其连锁不均衡是经验性的。
因而对个体而言，遗传性状最简单的形式是由一对称作等位基因的非常相关的序列决定的。每一等位基因是基因的一种可任选的可变形式，位于染色体对中的一条染色体上。对于一种给定个体的等位基因对，在序列上既可以是同一的也可以存在不同程度的差异。在减数分裂中，即形成性细胞(配子)的细胞分裂过程中，任何给定的染色体对中的染色体均分配到不同的配子中。染色体分离之后通过染色体间重组使染色体对中的DNA重排。
个体的性状由该个体所携带的两等位基因之间的特定组合而决定。这样，个体的性状由该个体从两亲代所继承的遗传物质所决定，相当于由在该个体的每一亲代中的染色体分离和重组事件所决定。
染色体对所携带的等位基因编码相同的遗传性状。等位基因的差异保证了个体间的高度区别。
外源基因转化到基因组是典型的随机行为。假定一个外源基因的整合位点，所得的基因组是所谓杂合的1/0型。通过小心的培育和筛选能够获得该外源基因的纯合体，即1/1型。尽管可以用第二外源基因(2)转化一个基因组，但用常规的转化技术，在不同的基因组中将第二外源基因定位到给定的整合位点，实际上是不可能的。因此，用常规的分子生物和育种技术不可能获得外源基因等位性的1/2型。
尽管通过基因剔除技术，理论上可以将外源基因定位到染色体上特定的位点，并其产生1/2型的外源基因等位性，但用这一技术所得的转化得率很低。事实上，至今没有人尝试生产外源基因等位性。
从本世纪初就开始生产杂种植物。植物培育者发现将不同亲本的株系杂交经常能获得表现所谓杂种优势的杂种植物，该杂种植物具有产量提高和/或对生物和非生物压力的适应性的性状。早期，杂种植物的生产主要集中于玉米和高粱，将其在相容性好的亲本株系之间杂交可以获得好的效果。后来发现杂种植物的生产也适用于其它植物物种。
对于杂种优势有几种推定的解释。由于杂种植物中的等位基因是由不同的亲本株系遗传而来，所以与同系繁殖的植物相比，显然杂种植物具有广泛的等位基因多样性。这种等位基因多样性可以作为杂种优势的一种可能的解释，但目前并没有科学证据支持这种解释。
由于杂种植物已显示出在产量和优势性方面优于同系繁殖植物，因此开发杂交种子是种子工业的一个首要目标之一。另外，由于杂种植物的多样性是由独特的重组导致的，所以对杂种种子的复制和再利用的可能性很小，这样，对培育者具有天然的商业保护。
大范围地生产杂交种子具有挑战性，因为许多作物在同一株植物上，在同一朵花或不同的花上同时具有雄性和雌性生殖器官(雄蕊和雌蕊)。这种布局导致高水平的自身授粉并且在很大范围内亲本植株间直接杂交，从而难于产生杂种植物。
为了保证在生产杂种种子的过程中出现异型杂交，培育者或用手工或以机械方式从一个亲本株系中去除雄蕊。尽管这种手工去雄对一些植物有效，例如小麦，但对于小的两性花则因劳动强度过大且不切实际。培育者为对这些植物进行异花传粉常恢复用自然出现的雄性不育突变体生产杂种种子。尽管用自然出现的雄性不育突变株能与小两性花进行异花传粉，这样的突变株的有效性和其中时常存在的不良组成严重地限制了这一方法的广泛应用。另外，用不育突变株进行异源杂交典型地导致所生产出的种子中的大部分保持了雄性不育性。用这些种子进行播种即生产出雄性不育植物，当这些雄性不育植物是自身授粉植物，例如小麦时将导致这些植物中的一部分没有收成。为克服这一低产结果，培育者必须将雄性不育的种子捡出，而这几乎是一项不可能的工作。
由于重要的作物如水稻，小麦都是开小的两性花的自身授粉植物，人们需要并且已有尝试开发有助于杂种F1代产量的授粉控制系统。但是，要获得经济上可实施的F1代杂种植物有几项条件必须具备。该雄性不育系必须是100％不育而雌性可育。天然花粉便于从雄性可育系到雄性不育系的转移，而且对于谷物和结实作物，必须能进行雄性可育恢复(MFR)以在F1代获得作物产量。
目前存在几种植物中的雄性不育机制。一种机制是细胞质遗传雄性不育(CMS)。一般CMS在有限的基础上已应用于谷类，水稻，高粱和洋葱，参见例如专利权人为Patterson美国专利3,861,079。
但是依赖单一的细胞质遗传雄性不育系统生产所有的杂种植物是不合适的，因为这使得全部的杂种资源均易于受植物病原菌的侵害。例如由于广泛地应用一种谷物细胞型cmsT导致了1970年南方谷物叶枯病(SouthernCorn Leaf Blight)的大爆发。这样在只有单一的雄性不育系统的植物物种中开发其它的方法生产雄性不育系非常重要。
目前出现替代细胞质不育的是核不育。基于核雄性不育的授粉系统依赖于将雄性不育的特征引入一个亲本植物，然后引入可育恢复基因，异花传粉的结果产生可育的杂种植物。
典型地，遗传工程化的核雄性不育以一种可控制的和靶定的方式在植物中表达一种破坏该植物花药组织的蛋白毒素而发挥作用。通过引入可育恢复基因，作为异花传粉的结果，这一毒素在F1子代中的表达可以是沉默的或拮抗性的。
开花植物的雄性繁殖过程发生在花药内。这一器官包括几种组织和细胞类型，其负责产生包含精细胞的花粉颗粒。绒毡层是一种特化的花药组织，在花粉形成过程中起重要作用。在花药形成的早期绒毡层环绕着花粉囊，并在花药形成的后期退化，不作为有机化的组织存在于成熟的花药中。绒毡层产生许多蛋白和其它物质，它们或者在花药形成中起辅助作用或成为花药外壁的成分。已知许多雄性不育突变体干扰绒毡层细胞的分化和/或功能。因此绒毡层组织对功能性花药颗粒的产生是必需的。
正因为如此，许多本领域已知的基于核雄性不育的授粉系统使用花药特异的启动子，在成熟过程中靶向破坏绒毡层或其它花药特异组织，从而使接下来的花药发育受到抑制。
例如，专利权人为Crossland的美国专利5,409,823，5,659,124和5,824,542描述了生产雄性不育植物的两种方法。两株遗传转化的植物亲本1和2进行杂交以获得雄性不育的子代。亲本1是用包含编码花药特异性启动子的核酸序列的表达盒转化，所述启动子可操作地与编码反式激活蛋白的核酸序列相连接。亲本2是用编码包含由上述反式激活蛋白所激活的靶核酸序列的表达盒转化，可操作地与编码毒素的核酸序列相连接，上述毒素可以是RNA或多肽，其可破坏活花粉的形成。因此将亲本1与亲本2杂交可以得到雄性不育后代。所得的雄性不育植物可用于生产杂种种子。接下来将雄性不育植物与不含上述反式激活蛋白的植物杂交以恢复繁殖力。
尽管用这一系统所生产出的子代中有一部分是所需的雄性不育系，但用这一系统不能有效地影响依赖反式激活蛋白基因与毒素基因分离的可育性恢复。雄性不育植物的减数分裂过程中这两个基因的分离很大程度上依赖于它们在染色体上的物理定位，因此当一株雄性不育植物与一株不表达反式激活蛋白的植物杂交时，该反式激活蛋白和毒素由雄性不育的亲本提供，结果一部分产生的子代保留了人们所不需要的雄性不育。
因此Crossland的方法不能有效地应用于自身授粉植物，如小麦，棉花和水稻。
专利权人为Hodges的美国专利5,929,307介绍了包括一种以位点特异性重组序列为侧翼序列的自杀基因的重组表达载体，将该载体引入植物即导致雄性不育。这一发明进一步涉及一种包括重组酶基因的第二表达载体，当该载体经自花传粉恢复系植物引入雄性不育植物时，导致毒素基因缺失从而恢复可育性。可知在这种情况下，由于通过一种自花传粉恢复系植物引入的基因产物的作用使可育性得以恢复，所以在恢复系植物中必须存在高拷贝数的恢复基因，才能在所得子代中高效恢复可育性。
这样目前的核雄性不育授粉系统尽管一般对于生产雄性不育植物来说有效，但应用于需要通过异花传粉使雄性不育得以恢复的，例如谷物或结实杂种植物时即受到限制。由于这些系统不能100％使雄性不育的植物恢复可育性，而且所得的雄性不育杂种种子不能典型地被筛选出来，这些系统只能获得次最优的谷物或结实杂种植物产量。
因此公认需要一种雄性不育植物，其与适当的雄性可育植物杂交后产生的子代大体上100％是雄性可育的，这中雄性不育植物将非常有用。依照下述的详细描述，这样的植物可以由使两外源基因等位化转化的方法获得。公认需要一种产生外源基因等位性的方法和表达盒，这种方法和表达盒也非常有用。
发明概述本发明的一个目的是提供一种真核生物如动物界或植物界(animalia orplanta kingdom)的生物，或其中对于商业上重要的产物，上述生物含具有外源基因等位性，也就是说，可用于确定该生物表型的两个不同的外源基因的等位性特征的基因组，。
本发明的另一目的是提供表达盒，该表达盒可用于预先计划的转化和杂交方案以产生具有外源基因等位性特征基因组的真核生物。
本发明的再一目的是提供一种在真核生物中利用上述发明目的中的表达盒产生外源基因等位性的方法。
本发明的又一目的是在例如杂种种子工业和具有小两性花特征的结实谷物中，利用上述方法和表达盒产生基本上100％可逆的植物雄性不育。
因而，依照本发明的一个方面提供一种非人真核生物体，该真核生物体基因组包含位于某一染色体对的第一染色体上的第一外源基因和位于所述染色体对的第二染色体上的第二外源基因，所述第一和第二外源基因处于等位关系，因此该第一和第二外源基因强制性地分配到不同的配子中。依照本发明下述优选实施例中的进一步描述，所述第一和第二外源基因的表达决定了该生物体的一种表型。
依照本发明下述优选实施例中的又进一步描述，所述第二外源基因的表达产物反式激活第一外源基因的表达。
依照本发明下述优选实施例中的再进一步描述，所述第二外源基因编码一种RNA聚合酶。
依照本发明下述优选实施例中的又进一步描述，所述第二外源基因编码一种转录因子。
依照本发明下述优选实施例中的又进一步描述，所述第一外源基因编码一种多肽，该多肽选自细胞毒性多肽和细胞抑制多肽。
依照本发明下述优选实施例中的又进一步描述，所述第一外源基因编码一种RNA分子，该RNA分子选自反义RNA分子和核酶RNA分子。
依照本发明下述优选实施例中的又进一步描述，所述的第一和第二外源基因的表达产物组装到一种异源寡聚蛋白中。
依照本发明下述优选实施例中的又进一步描述，所述的异源寡聚蛋白具有细胞毒活性或细胞抑制活性。
依照本发明下述优选实施例中的又进一步描述，所述的生物体是植物。
依照本发明下述优选实施例中的又进一步描述，所述第二外源基因编码RNA聚合酶并非可操作性的带有真核启动子。
依照本发明下述优选实施例中的又进一步描述，所述的RNA聚合酶选自细菌RNA聚合酶和噬菌体RNA聚合酶。
依照本发明下述优选实施例中的又进一步描述，所述的噬菌体RNA聚合酶选自T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。
依照本发明下述优选实施例中的又进一步描述，所述的第一外源基因编码一种多肽，该多肽选自细胞毒性多肽和细胞抑制多肽。
依照本发明下述优选实施例中的又进一步描述，所述的多肽选自果胶酸裂解酶，1，3 β-葡聚糖酶，抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白，白喉毒素A链(DTA)，URF13，吲哚乙酸-赖氨酸合成酶，CytA毒素和RNA酶TI。
依照本发明下述优选实施例中的又进一步描述，所述的第二外源基因受控于一种真核组织特异的启动子，使得第一外源基因在该植物的特定组织中表达。
依照本发明下述优选实施例中的又进一步描述，所述的特定组织形成该植物雄蕊组织的一部分。
依照本发明下述优选实施例中的又进一步描述，所述的第一和第二外源基因的表达导致该植物雄性不育。
依照本发明的另一方面，提供一种表达盒，该表达盒包括(a)包括第一可转录多核苷酸序列的第一节段，所述的第一可转录多核苷酸序列可操作地与第一启动子序列相连接，所述的第一节段的两侧翼区是一对第一位点特异性重组序列；和(b)与所述的第一节段相连的第二节段，所述的第二节段包括第二可转录多核苷酸序列，所述的第二可转录多核苷酸序列可操作地与第二启动子序列相连接，所述的第二节段的两侧翼区是一对第二位点特异性重组序列。
依照本发明的又一方面，提供一种在非人真核生物体中产生外源基因等位性的方法，该方法包括下列步骤(a)产生第一和第二同基因生物体，该同基因生物体对上文中所述的表达盒而言是纯合的；(b)向所述第一生物体中引入第一重组酶，以便去除所述的第一节段；(c)向所述第二生物体中引入第二重组酶，以便去除所述的第二节段；和(d)使由步骤(b)、(c)中所得的生物体杂交，以产生具有外源基因等位性特征的子代。
依照本发明下述优选实施例中的又进一步描述，所述的第一和第二对直接重复位点特异性重组序列分别独立地选自Lox重组序列，FRT重组序列，Gin重组酶序列，Pin重组酶序列和R/RS重组酶序列。
依照本发明的又一方面，提供一种表达盒，该表达盒包括(a)包含第一启动子序列的第一节段；(b)包含第一可转录多核苷酸序列的第二节段；和(c)包含第二可转录多核苷酸序列的第三节段，第二可转录多核苷酸序列可操作地与第二启动子序列相连接，所述的第一和第二节段位于该第三节段的侧翼区，其中一对位点特异性重组序列中的一个置于第一节段和第三节段之间，另一个置于第二和第三节段之间，由此当所述的一对位点特异性重组序列通过位点特异性重组将第三节段从该表达盒中切除后，第一启动子序列即可操作地与第一可转录多核苷酸序列相偶联。
依照本发明的又一方面，提供一种在非人真核生物中产生外源基因等位性的方法，该方法包括下述步骤(a)产生第一和第二同基因生物体，该同基因生物体对上文中所述的表达盒而言是纯合的；(b)向所述第一生物体中引入重组酶，以便去除所述的第三节段，由此可操作地使第一可转录多核苷酸序列与第一启动子序列相邻接；和(c)使由步骤(b)所得的生物体与上述第二生物体杂交以产生具有外源基因等位性特征的子代。
依照本发明优选实施例中的又进一步描述，所述的第一启动子序列是非真核启动子序列。
依照本发明优选实施例中的又进一步描述，所述的第二启动子序列是在第一组织中可天然操作的一种组织特异性启动子序列。
依照本发明优选实施例中的又进一步描述，所述的第一启动子序列是在第二组织中天然可操作的组织特异性启动子序列，其中所述第二可转录多核苷酸序列编码在第二组织中可天然表达的组织特异性转录激活蛋白，该蛋白天然地具有激活第一启动子序列的能力。
依照本发明优选实施例中的又进一步描述，所述的第二可转录多核苷酸序列编码一种反式激活蛋白。
依照本发明优选实施例中的又进一步描述，该反式激活蛋白是一种RNA聚合酶。
依照本发明优选实施例中的又进一步描述，所述的第一可转录多核苷序列编码一种酶。
依照本发明优选实施例中的又进一步描述，所述的第一可转录多核苷酸序列编码一种RNA分子，该RNA分子选自反义RNA分子和核酶RNA分子。
依照本发明优选实施例中的又进一步描述，所述的第二可转录多核苷酸序列编码一种所述第一启动子序列的反式激活蛋白。
依照本发明的又一方面，提供一种对此处所述的任何一个表达盒而言是纯合的植物。
依照本发明的再一方面，提供一种植物，该植物的基因组包括一对处于等位关系的外源基因，其中所述的一对外源基因中的第一外源基因定位于该植物基因组染色体对上的第一染色体上，所述的一对外源基因中的第二外源基因定位于该植物基因组染色体对上的第二染色体上。
依照本发明优选实施例中的又进一步描述，所述的第一和第二外源基因是根据其表达能产生雄性不育植物而选择的。
依照本发明优选实施例中的又进一步描述，所述的雄性不育植物与一种雄性可育植物杂交产生具有雄性可育性状的后代。
依照本发明的又一方面，提供植物种子，每颗种子的基因组包括处于等位关系的外源基因其中所述的一对外源基因中的第一外源基因定位于该植物种子基因组染色体对上的第一染色体上，所述的一对外源基因中的第二外源基因定位于该植物种子基因组染色体对上的第二染色体上。
本发明成功地通过提供具有外源基因等位性，也就是可用于确定该生物的表型两个不同的外源基因的等位性，特征基因组的真核生物体、表达盒和对产生上述生物体有用的方法弥补了目前已知构型的缺陷。
附图简述下面参照附图以举例的方式对本发明进行描述。具体参照附图的细节要强调的是，所给出的特定实例是以举例的方式给出的，其仅仅用于对本发明的优选实施例进行示意性的讨论，所提供的据认为是对本发明的原理和构思最有用的和最容易理解的描述。在此方面无需尝试给出比完全理解本发明所必须的描述更具体的本发明的结构细节，该附图描述容易使本领域的普通技术人员知道，本发明的几种形式具体是如何实现。
在附图中
图1是依照本发明的教导生产植物的一种方法的概要流程图。TapP-绒毡层启动子；Lox-Cre重组酶识别位点；T7P-噬菌体T7启动子；T7聚合酶-噬菌体RNA聚合酶识别该T7启动子位点；35S-CaMV启动子；CRE-CRE重组酶。
图2是依照本发明的教导生产植物的另一种方法的概要流程图。TapP-绒毡层启动子；Lox-Cre重组酶识别位点；T7P-噬菌体T7启动子；T7聚合酶-噬菌体RNA聚合酶识别该T7启动子的位点；35S-CaMV启动子；CRE-CRE重组酶；FRT-FLP重组酶识别位点。
优选实施方案的描述本发明涉及在基因工程方面实践一种新概念，据此，通过真核生物的转化和杂交使所得的子代包含位于所述基因组染色体对的第一染色体上的第一外源基因，位于所述染色体对的第二染色体上的第二外源基因，所述第一和第二外源基因之间是等位关系，因此该第一和第二基因强制性的分配到不同的配子中。本发明进一步涉及实施上述新概念的表达盒，实施上述新概念以在植物中获得可逆的雄性不育的方法，和由此获得的植物及植物产物。
依照本发明的方法的原理和操作以及在非人真核生物中产生外源基因等位性的表达盒可参照附图结合描述更好地理解。
在详细说明本发明的至少一个实施例之前，应当理解本发明并不局限于在下述描述和附图中所展示的构建细节以及组分安排上的应用。本发明也能采用其它的实施方式或用多种方法进行实施或操作。并且，应当理解此处所用的词组和术语是为了描述本发明而并非是对本发明的限制。
依照本发明的一个方面提供一种非人真核生物，该生物的基因组包括位于染色体对第一染色体上的第一外源基因和位于该染色体对第二染色体上的第二外源基因。所述的第一和第二外源基因处于等位关系，因此当该生物体形成配子时这两个外源基因强制性地分配到不同的配子中。
可知由于非人真核生物体包含复数的染色体对，两个外源基因的等位关系可以在不止一对染色体对及给定染色体对的不止一个位点上建立。
此处所用的术语“等位关系”和术语“等位性”是指一个染色体对两条染色体上的两个基因之间的位置关系。类似的，“外源基因等位性”是指一个染色体对两条染色体上两个功能不同的外源基因的等位定位。由此观察到在配子形成时两外源基因基本上100％的分离。
此处所用到的术语“外源基因”是指通过反式引入(trans-introduced)并整合到某物种基因组中的多核苷酸序列。这样的外源基因可以来自相同或不同的物种。依照本发明的外源基因包括可转录的序列，例如编码mRNA和蛋白的序列，cDNA和基因组序列，和反义RNA编码序列，和/或顺式控制基因表达的顺式作用序列，如启动子和增强子。这样的外源基因组装到表达盒中用于转化细胞或生物体，以获得在其基因组中含有上述外源基因的转化的，经遗传修饰的或转基因的细胞和/或生物体。转基因生物体是一个或多个细胞含有外源基因的稳定转化的生物体。术语稳定转化的是指经转化的细胞或生物体(宿主)，该细胞或生物体能将外源基因传递到其子代。依照本发明稳定转化的宿主具有整合到其基因组中的外源基因。依照本发明的外源基因可以表示在生物体或突变体中自然存在的序列或其中的部分或嵌合体，或者非天然存在于生物体中的序列，例如来自不同的亚种，种或属的序列。
依照本发明的优选实施例所述的第一和第二外源基因的表达决定该生物体的表型。此处所用到的术语“表型”是指特有的基因或外源基因表达所导致的在一种生物体中不同分子产物出现。这样的分子产物的出现，例如一种蛋白或RNA分子(例如mRNA或反义RNA)，可以导致形态的变化，对病原体和化学物质不同的抵抗力，不同的发育等等。
这样，所表达的外源基因共同作用于一种生物体的表型，也就是说为了获得一种特定的表型需要两个外源基因表达产物的存在。
术语“表达”是指基因产物的生物合成。例如，对于结构基因，表达包括结构基因转录为信使RNA(mRNA)和mRNA翻译为一个或多个多肽。对于反义RNA或核酶，其表达产物是RNA分子。
由两个等位的外源基因所决定的性状是特别有益的，而且是本发明的要点所在，因为将具有外源基因等位性特征的转基因生物体与另一生物体杂交导致两外源基因完全分离使后代中失去该表型。这是单一基因或以非等位的方式排布的多重基因决定的性状所不能达到的，因为这些基因完全分离进而丢失该性状不能得到保证。下面将以具有外源基因等位性的植物为例进一步说明外源基因等位性的优势。
依照本发明的一个优选实施例，第二外源基因的表达产物反式激活第一外源基因的表达。
本发明的反式激活蛋白包括，但不局限于聚合酶、DNA结合蛋白、天然存在的或合成的转录激活蛋白、翻译激活蛋白，转录后激活蛋白等等。考虑仅选择并不天然存在于其所表达的细胞或组织的反式激活蛋白。优选来自非相关的组织中的反式激活蛋白。
依照本发明的一个优选实施例的反式激活蛋白是噬菌体RNA聚合酶。以T7 RNA聚合酶为例说明使用这样的反式激活蛋白多肽指导另一种核苷酸序列的表达。参见美国专利5,122,457；5,126,251；和5,135,855；Lassner等(1991)植物分子生物学17229-2；Rodriguez等(1990)病毒学杂志644851-4857；Vennema等(1991)基因108201-210；Benton等，分子和细胞生物学(1990)分子和细胞生物学10353-360；Elroy-Stein和Moss(1990)美国国家科学院汇编876743-6747；Moss等(1990)自然34891-92；Elroy-Stein等(1989)美国国家科学院汇编8661266130；和Rosenberg等(1987)基因56125-135，引入此处作为参考。可知其它不是正常存在于该生物体中的聚合酶，例如来自与该生物体不同种但属于同属的生物体中的聚合酶也可以用于本发明。
反式激活蛋白还包括对激活特定启动子所必需的转录激活蛋白。一个蛋白的结合结构域可以与另一蛋白的激活结构域相融合形成这种DNA结合蛋白二聚体，例如GAL4/VP16(Carey等(1989)，分子生物学杂志，209423-432；Cress等(1991)科学，25187-90；和Sadowski等(1988)，自然，335563564)。类似的，其它蛋白的结合结构域，即Lex A(Brent和Ptashne，(1985)，细胞，43729-736，记述了a Lex A/GAL4转录激活蛋白)也可以应用。
反式激活蛋白也可以是翻译激活蛋白。以花椰菜花叶病毒翻译激活蛋白(TAV)为例说明翻译激活蛋白。参见例如Futterer和Hohn(1991)EMBOJ.103887-3896。该系统产生双顺反子mRNA。即，由相同的启动子在同一mRNA上转录出两个编码区。缺乏TAV时核糖体仅翻译出第一个顺反子。但是在表达TVA的细胞中两个顺反子都被翻译出来。
因此当其表达时，该反式激活蛋白反式激活第一外源基因的表达。是第一外源基因的表达决定该生物体的表型，但由于第一外源基因的表达依赖于第二外源基因产物的存在，因此为了建立并维持一种表型两个基因都需要表达。
依照本发明的优选实施例，第一外源基因编码抑制细胞再生和/或引起细胞退化的分子。
因而，依照本发明的优选实施例该第一外源基因编码细胞毒性的多肽或细胞抑制多肽。第一外源基因的表达或阻止使其表达的细胞增殖、或使之发生改变引起细胞退化最终导致细胞死亡。细胞抑制和细胞毒性多肽的特定实施例在下文中进一步描述。
在另一实施例中，该第一外源基因编码一种反义RNA分子或核酶，上述RNA分子转录时靶定在该细胞内表达的特定mRNA序列，如此应用可导致例如破坏生化过程及造成细胞死亡。
依照本发明的另一优选实施例，该第一与第二外源基因组装到一异源寡聚蛋白中。在这种情况下优选两外源基因相伴随表达，以积累两种非功能性的表达产物用于组装功能性的异源-寡聚蛋白。
在下文中第一和第二外源基因也指可转录的多核苷酸序列。
依照本发明的另一方面还提供用于在非人真核生物中产生外源基因等位性的表达盒。依照本发明的这一方面该表达盒包括含第一启动子序列的第一节段。该表达盒还进一步包括含第一可转录多核苷酸序列的第二节段和以第一和第二节段为侧翼区并且含有可操作地与第二启动子序列相连接的第二可转录多核苷酸序列的第三节段。一对位点特异性重组序列中的一个位于第一节段和第三节段之间，另一个位于第二节段和第三节段之间。这样，由所述的一对位点特异性重组序列通过位点特异性重组从表达盒中切除第三节段后，第一启动子序列能够可操作地与第一可转录多核苷酸序列相偶联。
此处所用的表达盒是一种多核苷酸分子，其包括至少一个可在宿主细胞或生物体中表达的多核苷酸序列。典型地，这种表达受控于包含组成型，诱导型或组织特异性启动子和增强元件的顺式作用调节元件。本领域中习惯于将这样的多核苷酸序列称为“可操作地连接于”调控元件上。表达盒典型地还包括源于真核或细菌的选择标记，该选择标记用于筛选包含该表达盒的真核细胞。这些可包括但不局限于，多种可引起抗生素抗性的基因，这是本领域所熟知的，在此不再详细描述。
在许多方面的应用中，均需要将上述的表达盒整合到核酸构建体中，例如表达构建体或反义构建体。这样的构建体是本领域所熟知的，并可商购的，也可以包含附加序列例如克隆位点，一个或多个带有启动子的、用于筛选含该表达盒的原核细胞的原核或真核标记基因，一个或多个原核生物转录起始位点，一个或多个翻译起始位点，一个或多个聚腺苷酸信号等等。
依照本发明的一种构建体，优选地进一步包含合适的筛选标记。在依照本发明的更优选实施例中该构建体还包括复制起始位点。在依照本发明的另一最优选实施例中该构建体是穿梭载体，该穿梭载体能够在大肠杆菌(E.coli)(其中该构建体包含合适的筛选标记和复制起点)和所选择的生物细胞中增殖或整合到其基因组中。依照本发明的这一方面的构建体可以是例如质粒，杆粒，噬菌粒，粘粒，噬菌体，病毒或人工染色体。
为使其表达，包含表达盒的多核苷酸序列需由启动子驱动。与其它调节元件一样，在转化领域所熟知的几种类型的启动子可单独使用也可与上述启动子结合使用。
此处所用到的术语“启动子”包含DNA转录起始位点上游的区域和RNA聚合酶及其它起始转录所需的蛋白的识别和结合位点。仅在特定的组织中起始转录的启动子称作“组织特异性的”。“细胞类型”特异的启动子在一个或多个器官的特定细胞类型中首先驱动表达。
依照本发明的又一优选实施例，上述表达盒中的驱动所述反式激活蛋白表达的第二启动子是位点特异性启动子。可知根据由外源基因等位性决定的表型所需的时空表达，其它类型的启动子如诱导型启动子，组成型启动子和发育调节型启动子也可以用于本发明。
有关多核苷酸序列和启动子的特定实施例在下文关于本发明的植物方面的实施例中予以详细地介绍，并在实施例部分的实施例1和2中以示例的方式予以进一步地说明。
许多位点特异性重组酶系统均可依照本发明予以应用，它们包括但不局限于噬菌体PI的Cre/lox系统，酵母的FLP/FRT系统，Mu噬菌体的Gin重组酶，大肠杆菌的Pin重组酶，和质粒pSRI的R/RS系统。目前的两个优选的位点特异性重组酶系统是噬菌体PI的Cre/lox和酵母的FLP/FRT系统，这些系统均表现出与其它的高重组率。这两个系统中每一个，其特异性重组序列都相对较短(lox 34bp，FRT 34-47bp)。在这些系统中重组酶(Cre或FLP)与其相应的位点特异性重组序列(分别为lox或FRT)相互作用倒转或切除依赖于位点特异性重组序列方向的中间序列。通过本发明的表达盒使用的位点特异性重组序列按照直接重复确定方向，以影响其侧翼序列的切除。在美国专利5,527,695中进一步描述了位点特异性重组系统，在此引入作为参考。
如上所述，为完成切除可通过任何合适的方法将重组酶引入靶生物体，所述方法使得重组酶在靶生物体中表达。例如可将重组酶基因稳定地整合到该生物体基因组中或在其中交替地瞬时表达。在下述有关植物的进一步详细描述中，也可以通过与带有重组酶基因的转基因植物进行有性杂交引入植物体。在动物界的近交生物体之间也可以进行类似的杂交。
为在生物体中产生外源基因等位性，通过本领域已知的转化方法将上述的表达盒引入该生物体基因组中，所述的一些方法在下文中作出详细介绍。
在稳定的转化生物体建立之后，可由此增殖具有纯合表达盒的第一和第二同基因生物体。对该位点特异性重组序列特异的重组酶基因引入第一生物体中以切除第三节段由此可操作地将第一可转录多核苷酸序列与第一启动子序列相连接。正如已经提及的该重组酶基因或通过转化技术引入，或优选地通过与表达重组酶而不含表达盒的生物体进行远源杂交引入，但该不含表达盒的生物体优选与第一生物体是同基因的。
最后将第一和第二生物体杂交以产生具有外源基因等位性特征的子代。由于每个生物体都对其子代的染色体对提供一条染色体，这样其子代的一个染色体对中的第一染色体包含第一可表达多核苷酸序列，第二染色体包含第二可表达多核苷酸序列作为其基因组的一部分，其中第一和第二可表达多核苷酸序列表现等位性关系，即这样的多核苷酸序列强制性达到分配到不同的配子中。
可知当使用一对位点特异性重组序列时，定位于第一多核苷酸编码序列中的表达盒与第二多核苷酸编码序列可相互转换。
如上述示例中所介绍的第一可转录多核苷酸序列编码一种细胞毒性或细胞抑制分子，第二多核苷酸编码一种反式激活蛋白。这种情况下，反式激活蛋白的表达依赖于所用到的第二启动子的类型，最典型地是，当其中所使用的是组成型的或组织特异性的启动子时，反式激活蛋白的表达是在表达盒转化到该生物体后引发的。另一方面，在位于这一表达盒中的另一多核苷酸序列中，该反式激活蛋白可由第一可转录多核苷酸序列编码，而细胞毒性或细胞抑制分子可由第二可转录多核苷酸序列编码。这样，在这种情况下该反式激活蛋白仅在重组后表达。照此，在下述的实施例部分的实施例1中予以详细描述的后一构型中，任何外源基因的表达均在重组后起始。这对反式激活蛋白对使其表达的细胞具有毒性的情况特别有用。这种情况下必须避免该反式激活蛋白的超前(premature)表达。
在下述的详细描述中，用使用了两对位点特异性重组序列的表达盒也可以产生外源基因等位性。
由此，按照本发明的另一方面提供在非人生物体中产生外源基因等位性有用的表达盒。该表达盒依照本发明的这一方面包括以第一位点特异性重组序列为侧翼序列包含第一可转录多核苷酸序列的第一节段，其中第一可转录多核苷酸序列可操作地与第一启动子序列相连接。
依照本发明这一方面的表达盒进一步包括与第一节段相连接的第二节段，该第二节段包含可操作地与第二启动子序列相连接的第二可转录多核苷酸序列，其中第二节段以第二位点特异性重组序列为侧翼区。
通过下述详细描述的转化，在用上述的表达盒建立了稳定的转化生物体之后，可由此增殖具有纯合表达盒的第一和第二同基因生物体。如上文所描述的，将第一重组酶引入第一生物体，以切除第一节段。将第二重组酶引入第二生物体以切除第二节段。
最后将第一和第二生物体杂交以产生具有外源基因等位性特征的子代。
如前，由于每一生物体均对子代生物体染色体对贡献一条染色体，这样其子代的一个染色体对中的第一染色体包含第一可表达多核苷酸序列，第二染色体包含第二可表达多核苷酸序列作为其基因组的一部分。在下述的实施例2中给出了对本发明这一方面所涉及的表达盒的进一步描述。
如实施例部分的实施例1和2中所介绍的，依照本发明的另一方面外源基因等位性用于在植物中产生可逆的核雄性不育。
雄性不育是指不能产生功能性的或活的花粉。雄性不育可能是由于缺陷导致不形成花粉或当花粉形成时没有功能。因此，要么不形成花粉，要么即便形成花粉，或没有活性或在正常的情况下不能进行有效的受精作用。
本发明的雄性不育植物是雌性可育的。也就是说，虽然该植物不产生可育的花粉但可以接受所需父本的花粉而完成受精作用产生杂交种子。
为在植物中达到雄性不育，需表达两个可转录多核苷酸序列，因此仅在雄蕊组织或下述组织(例如花药，花粉或绒毡层)中表达细胞抑制活性或细胞毒活性。
依照本发明这一方面的优选实施例所述的第二启动子是雄蕊组织特异的启动子。此处所用到的术语″雄蕊″是指开花植物的雄性生殖器官，包括花药组织。此处所用到的术语″花药组织″或术语″花药″是指包括花粉和绒毡层。
对于启动子DNA序列，雄蕊特异性的启动子典型地特异于花药组织，并且包括指导相关可转录序列在花药组织中转录出相应的RNA的转录调节序列，所述的RNA浓度至少是其它组织中的100倍。
花药特异性启动子是本领域所公知的，这样的例子包括但不局限于，绒毡层特异的启动子，例如烟草花药启动子，ant32，花药特异性启动子，如来自LAT52(Twell等，普通分子遗传学(Mol.Gen.Genet.)217240-245(1989))；花粉特异性启动子例如来自Zml3(Guerrero等普通分子遗传学224161-168(1993))或小孢子优选启动子(microspore-preferred启动子)例如来自apg(Twell等，Sex.Plant Reprod.6217-224(1993)。另外的例子如美国专利5,477,002，其公开了来自花药特异的染色体克隆的启动子序列，该启动子序列可操作地与编码所需多肽的DNA序列相连接，使花药能够特异性表达。
通过使用雄蕊特异性启动子所得的转基因植物仅在该植物的雄蕊组织中表达反式激活蛋白。
如上所述，表达盒的第二可转录多核苷酸序列表达的反式激活蛋白可以是RNA聚合酶，转录激活蛋白或翻译激活蛋白。
在本发明这一方面的优选实施例中，该反式激活蛋白是噬菌体RNA聚合酶例如，但不局限于T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶。
因此，驱动第一可转录多核苷酸序列表达的第一启动子包括可由噬菌体RNA聚合酶识别的序列，因此只有存在噬菌体RNA聚合酶且第一可转录多核苷酸序列和第一启动子之间可操作地连接后，第一多核苷酸序列的转录才能完成。
依照本发明这一方面的优选实施例，该第一可转录多核苷酸序列的表达产物表达可用于破坏活性花药的形成。
如上所述所得的第一可转录多核苷酸序列的表达产物可以是多肽或RNA分子，例如反义RNA或核酶RNA分子。
适合应用于本发明这一方面的多肽的例子包括，但不局限于能抑制对细胞功能所必需的大分子合成的蛋白，能够降解对细胞功能所必需的大分子的酶，能够改变植物激素生物合成或代谢的蛋白和抑制花药/绒毡层细胞特定功能或发育的蛋白。
例如，Mariani等，自然，347737，(1990)，中介绍了米曲霉(Aspergillusoryzae)RNA酶-TI或命名为″BARNASE″的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)RNA酶的这种表达，在植物的绒毡层细胞中诱导该绒毡层细胞破坏而导致雄性不育。也可以用其它基因代替BARNASE以培育雄性不育植物，例如花药特异性的P-1，3-葡聚糖酶(Hird等植物杂志41023-1033，1993)，Aarts等自然363715-717，1993中描述的雄性不育基因。
其它的多肽包括白喉毒素A-链(DTA)，其抑制蛋白合成，Greenfield等(1983)，美国国家科学院汇编806853；Palmiter等(1987)，细胞，50435；果胶酸裂解酶来自菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)EC16的pelE，其可降解果胶引起细胞溶解。Keen等(1986)，细菌学杂志168595；来自玉米线粒体基因组的T-urf13(TURF-13)cms-T；这一基因编码一个命名为URF13的破坏线粒体或细胞膜的多肽。Braun等(1990)，植物细胞，2153；Dewey等(1987)，美国国家科学院汇编845374；Dewey等(1986)，细胞，44439；Gin重组酶，一种来由Mu噬菌体的基因编码的位点特异性DNA重组酶，该重组酶在植物细胞中表达可导致基因组重排或失去细胞活性。Maeser等(1991)，普通分子遗传学230170-176；丁香假单胞菌(Pseudomonassyringe)的吲哚乙酸-赖氨酸合成酶(iaaL)，其编码是吲哚乙酸(IAA)与赖氨酸连接起来的酶。因为其可通过连接从细胞中移去IAA，所以当该酶在植物细胞中表达时引起发育变化。Romano等(1991)，基因和发育，5438446；Spena等，普通分子遗传学，(1991)，227205-212；Roberto等(1992XXX)美国国家科学院汇编，875795-5801；苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillusthuringiensis Israeliensis)的CytA毒素基因，其编码一种杀蚊虫和溶血性的蛋白。当其在植物细胞中表达时由于可使细胞膜遭到破坏因而引起细胞死亡。McLean等(1987)，细菌学杂志，1691017-1023；Ellar等(1990)，美国专利4,918,006；和生物素结合蛋白，例如在WO 96/40949和99/04023中进一步描述的链霉抗生物素蛋白和抗生物素蛋白，上述两篇文献中描述了利用生物素结合蛋白诱导雄性不育。
另外第一多肽序列也可以编码DNA酶，RNA酶；蛋白酶；水杨酸水解酶等等。
若将第一可转录多核苷酸序列的多肽产物靶定到某亚细胞区域如叶绿体，液泡，过氧化物酶体，细胞壁或线粒体，或分泌到质外体内是有益的，则该第一可转录多核苷酸序列的5′和或3′多肽编码序列区域包括信号序列。
在5′和/或3′末端的靶定序列可以在蛋白的合成和分泌过程中决定所编码的蛋白最终划分到哪一区域。信号肽引导多肽到细胞内的细胞器或亚细胞区域或分泌到质外体中。许多信号肽序列(sigsequences)是本领域已知的。这方面可参见Becker等，植物分子生物学2049(1992)，Close，P.S.，硕士论文，衣阿华洲洲立大学(1993)，Knox，C.，等，″两个有争议的大麦α-淀粉酶基因的组织结构″，植物分子生物学93-17(1987)，Lerner等，植物生理学91124-129(1989)，Fontes等，植物细胞3483-496(1991)，Matsuoka等，美国国家科学院汇编88834(1991)，Gould等，J.细胞生物学1081657(1989)，Creissen等，植物学杂志2129(1991)，Kalderon，D.，Robers，B.，Richardson，W.，和Smith A.，″确定核定位的短氨基酸序列″，细胞39499-509Stiefel，V.，Ruiz-Avila，L.，Raz R.，Valles M.，Gomez J.，Pages M.，Martinez-Izquierdo J.，Ludevid M.，Landale J.，Nelson T.，和Puigdomenech P.，“大麦细胞壁早期叶根维管系统分化中富含羟脯氨酸的糖蛋白基因的表达”，植物细胞2785-793(1990)。
表达反义RNA也可以诱导可变的雄性不育。反义RNA分子与和靶信使RNA分子的结合导致RNA酶H相关mRNA降解和/或反义的抑制。因此合适的反义RNA分子具有与编码对绒毡层细胞功能或花粉合成至关重要的蛋白的mRNA相互补的序列。
例如，可与RTS2基因表达产物相互作用的反义RNA可用于本发明。另外，来自膨胀矮牵牛(Petunia inflata)(Mu等，植物细胞6709-721，1994)的反义RNA PRK1(花粉表达受体样激酶)，反义定向于芥(Arabidopsis)的Bcp1雄性不育基因(Xu等，美国国家科学院汇编922106-2110，1995)也可以作为反义RNA应用于本发明。另外，反义RNA分子也可定向于核定位信号序列，并引起降解和/或抑制带有NLS信号序列的mRNA的翻译。
第一多核苷酸也可以编码一种核酶。核酶可设计为表达核酸内切酶活性，其定位于mRNA特定的靶序列。例如Steinecke等，EMBO J.，111525，(1992)，在烟草原生质体中核酶对新霉素磷酸转移酶基因的表达可以达到100％的抑制。另外，也可以使用能够促进RNaseP-介导的靶mRNA分子切割的RNA分子。依照这一方法，可以构建外源的引导序列，将内源的RnaseP定位于特定的细胞内mRNA，并由此切割该mRNA。参见Altman等，美国专利5,168,053和Yuan等，科学，2631269，(1994)。
依照本发明的另一优选实施例第一和第二多核苷酸的表达产物形成异源寡聚体，例如异源二聚体。这样的异源寡聚体可以是，例如具有细胞毒活性的酶。这样依照本发明的这一方面第一和第二启动子都是雄蕊特异性启动子。结果两个多核苷酸均表达并且它们的表达产物在雄蕊组织，例如花药组织中组装，以便引起花药组织的退化最终导致雄性不育。
为在植物中产生外源基因等位化，上述的任何表达盒必须首先用于转化植物组织从而使转基因植物重建。
下中将详述的所谓“转化”描述了一种过程，其中外源基因，例如表达盒进入受体细胞并将其改变为转化的、遗传修饰的或转基因细胞。转化可借助任何方法将外源核酸序列插入到真核宿主细胞中。
影响外源DNA整合到植物基因组DNA中的基本方法包括，根瘤菌介导的基因转移，直接DNA吸收，包括直接将DNA吸收进入原生质体中的方法，DNA的电穿孔，将DNA注射到植物细胞或组织中，DNA包被颗粒的生物裂解(biolistic)粒子辐射，DNA与萌芽花粉的直接培养和利用植物病毒作为基因载体。这些方法已在本领域中有详细地介绍在此不再赘述。
通过应用上述任何一种产生外源基因等位性的方法，可以获得所需的雄性不育，雌性可育植物。将这样的雄性不育植物与雄性可育植物杂交，在其子代中可获得100％雄性可育的杂交种子。
因此两个表现为等位关系的不同的外源多核苷序列，可在同一株转基因植物中共表达结果诱导出雄性不育。这些序列接下来的分离导致可育性100％的恢复。当上述子代与合适的非转基因植物杂交时，可100％地观察到上述的分离现象。如此，外源基因等位性可用于在植物中产生雄性不育。这是特别有用的，因为可育性的恢复在需要收获种子或果实的杂交作物生产中特别重要。只有所述的两多核苷酸序列完全分离才能保证可育性完全恢复，而这只有当上述序列在同一株植物基因组中处于等位关系时才能作到。因此本发明的方法和表达盒能确保上述的完全分离和可育性的完全恢复。
可知本发明的方法和构建体可用于在结实或不结实的植物中产生雄性不育。结实植物包括，但不局限于小麦，大麦和水稻，而不结实植物包括但不局限于莴苣，花椰菜和甘蓝。对于需要收获果实的植物，如谷物，所得的杂交种子雄性可育是非常重要的，因为这样才能从由这些种子所长成的植物上收获果实。这种情况下，可育性能够100％地恢复在经济上是非常重要的，因为由杂交所得的全部子代均需结实。本发明的方法和表达盒也可以应用于动物，这对本领域的技术人员来说是显而易见的。
例如，外源基因等位性可用于表达等摩尔的两个不同外源基因，否则所述两个外源基因可能具有不同的位置效应。例如由具有外源基因等位性的动物细胞衍生的细胞培养物可用于基本上等摩尔地表达两不同的外源基因，因为两外源基因均定位于染色体对中两条染色体上的同一位置。结果如果有的话，这些外源及倾向于表现相同的位置效应，即基本上以等摩尔的量表达。可知在这种情况下两外源基因上游所使用的启动子是相同的。
动物细胞转化方法和转基因动物的生产方法是本领域所公知的。这样的方法在列于实施例部分引言中的手册和教科书中有进一步详细地描述。I由此，本发明提供可在非人真核生物中产生外源基因等位性的方法和表达盒。当需要在子代中使等位的外源基因完全分离时，例如雄性不育植物和由它们所得的雄性可育杂种后代的情况，这种等位性将非常有用。
通过下述实施例的介绍，本领域的技术人员能够对本发明其它的目的、有益效果，和新颖之处有更清晰的了解，但这些实施例不作为对本发明的限制。另外，在上文中所描述的每一个不同的实施例和本发明的各个方面，以及权利要求部分所提出的权利要求均在下述的实施例中得到实验的支持。
实施例在此列出下述实施例的参考文献与上述描述一起，以非限定性的方式介绍本发明。
一般来说，本发明中所用到的命名法和实验规程包括分子的，生化的，微生物的和重组DNA技术。这样的技术在文献中作了详细地描述。参见，例如，″分子克隆实验操作手册″Sambrook等，(1989)；″现代分子生物学实验方法″1-111卷Ausubel，R.M.，编(1994)；细胞生物学实验手册1-111卷Cellis，J.E.，编(1994)；″现代免疫学方法″1-111卷Coligan J.E.，编(1994)；″寡核苷酸合成″Gait，M.J.，编(1984)；″核酸杂交″Hames，B.D.，和Higgins S.J.，编(1985)；″转录和翻译″Hames，B.D.，和Higgins S.J.，编(1984)；″动物细胞培养″Freshney，R.I.，编(1986)；″固定化的细胞和酶″IRL出版社，(1986)；″分子克隆实用手册″Perbal，B.，(1984)and″方法论和酶学″1-317卷科学出版社；上述全部引用作为参考。其它参考文献穿插于上下文中。所用到的实验操作是本领域已知的但为方便读者也在文中作了介绍。在其中所包含的所有信息均包含在此作为参考。
实施例1实施例1描述了适合于在植物中产生等位性的表达盒，该等位性可用于产生100％可逆的雄性不育。由于杂种种子的生产在商业上具有重要意义，而雄性可育的完全恢复对谷物的高产至关重要，因此开发了一种系统，该系统可产生雄性不育但同时通过异型杂交，如杂种异型杂交使子代中完全恢复雄性可育。因此这一系统可用于高效率地生产杂种种子。
此处所用到的涉及植物自体杂交和异型杂交的方法以使转化植物增殖并接下来生产杂交种子是本领域常用的方法，因此在这里不需要作进一步的详细描述。
图1是依照本发明生产可逆的雄性不育植物的方法的概要。
将表达盒I通过例如根瘤菌介导的基因转移方法转化植物组织，转基因组织在同一带有单拷贝的表达盒I的转基因植物中再生。表达盒I包括绒毡层特异的启动子(TapP)例如ant32或其它特异的雄蕊组织特异的启动子，其后是LOX直接重复序列。该LOX序列后是T7启动子区域(T7P)，该区域由非在植物中正常产生的噬菌体T7聚合酶所识别。由T7启动子启动的表达需要T7聚合酶基因或基因产物存在。该T7启动子可操作地连接到命名为毒素的细胞毒性分子编码区域。T7聚合酶存在时T7启动子启动该毒素表达。依照本发明可应用的毒素编码一种在下文中进一步描述的能够破坏功能性花粉细胞产物或花粉形成的蛋白或RNA分子。毒素基因后连接第二Lox位点(直接重复)，其后是T7聚合酶基因，该T7聚合酶基因不与可操作的启动子相连接。
包括这一表达盒的转基因植物和与一种同基因植物杂交，该同基因植物对于在强组成型启动子例如35S启动子控制下表达的重组酶基因(CRE)是纯合的，但该植物不包含表达盒I。该包括表达盒I的转基因植物通过同种繁殖获得纯合体(III)。
通过杂交II所获得的该植物通过同种繁殖获得包含表达盒IV的植物。表达盒IV由毒素和T7启动子区域的切除而获得。这一切除使T7聚合酶区域与TapP启动子区域(由34bp长的Lox位点所分隔)靠得很近。带有表达盒IV的植物在绒毡层细胞中表达T7聚合酶，其对花粉的产生无有害影响。这种情况下由于直接重复序列(Lox)位点在TapP启动子临近的下游，或者用不含ATG密码的直接重复序列或从直接重复序列中去除任何可能的ATG起始密码子(用位点特异性突变)以使转录从T7聚合酶ATG起始。
下一步中植物IV与不表达任何外源基因的植物III杂交，收获由一条来自植物III的染色体，一条来自植物IV的染色体组成的染色体对的植物。所得的植物(V)是雄性不育的，因为在绒毡层细胞染色体A产生的T7聚合酶结合到染色体A的T7启动子区域驱动毒素的表达，该毒素降解绒毡层细胞并进而导致雄性不育。
这一植物作为接下来的杂种杂交(VII)的母本，其中的合适的非转基因雄性植物(VI)的花粉用于对植物V受精，以(从植物V)收获可育的子代。可以做到这一点是由于染色体A和A100％分离。从植物V收集的种子是包括表达盒VIIa或表达盒VIIb的杂种种子。
可知基因的特定重排，特异性重组位点和表达盒I中的启动子可以改变，但改变后仍可得到相似的结果。例如TapP启动子可与T7聚合酶相连接且两者均以Lox位点作为侧翼序列。这种情况下T7启动子可通过TapP启动子和T7聚合酶与毒素基因分离。切除后该毒素的产生受控于T7启动子。
实施例2图2是产生等位性的另一种方法。在这一方法中再次参照特定的参考诱导雄性不育，可以知道这一方法产生的基因等位性可以用于任何目的图2是依照本发明的教导产生可逆的雄性不育植物的另一种方法的概要。
用表达盒I转化植物组织，转基因组织在同一转基因植物中再生。这些转基因植物是雄性不育的，因为它们表达T7聚合酶和由T7启动子驱动的毒素。依照这一方法包括T7聚合酶的表达盒I可操作地连接到TapP启动子例如ant32上，两者皆以FRT重组酶位点作为侧翼序列。表达盒I进一步包括可操作地与T7启动子相连接的毒素基因，两者均以Lox位点为侧翼序列。
带有表达盒I的同一植物由Cre重组酶植物(II)(Cre纯合)和FLP重组酶植物(III)(FLP纯合)授粉。包含与启动子连接的任意一个基因的所得的植物(IV和V)是雄性可育的。如此这些植物为失去重组酶基因并建立它们的重表达盒(recassettes)(VI和VII)纯合体而进行自花授粉。植物VI和VII进行杂交以产生包括处于等位关系的两外源基因(T7聚合酶和毒素)的雄性不育植物。从这一点起可依照实施例I中所描述的生产杂种雄性可育植物。
尽管此处本发明结合了特定实施例进行了描述，显然多种替换，修饰和变异对本领域的技术人员来说是显而易见的。据此，在不背离本发明主旨的范围内的所有替代，修饰和变异均包括在本发明的范围内并属于后附的权利要求广泛的保护范围之内。
权利要求
1.一种非人真核生物体，该真核生物体基因组包含位于某一染色体对的第一染色体上的第一外源基因，和位于所述染色体对的第二染色体上的第二外源基因，所述第一和第二外源基因处于等位关系，因此该第一和第二外源基因强制性地分配到不同的配子中。
2.如权利要求1的生物体，其中，所述第一和第二外源基因的表达决定该生物体的表型。
3.如权利要求1的生物体，其中，所述第二外源基因的表达产物反式激活所述第一外源基因的表达。
4.如权利要求1的生物体，其中，所述第二外源基因编码一种RNA聚合酶。
5.如权利要求1的生物体，其中，所述第二外源基因编码一种转录因子。
6.如权利要求1的生物体，其中，所述第一外源基因编码一种多肽，该多肽选自细胞毒性多肽和细胞抑制多肽。
7.如权利要求1的生物体，其中，所述第一外源基因编码一种RNA分子，该RNA分子选自反义RNA分子和核酶RNA分子。
8.如权利要求1的生物体，其中，所述的第一和第二外源基因的表达产物组装到一种异源寡聚蛋白中。
9.如权利要求8的生物体，其中，所述的异源寡聚蛋白具有细胞毒活性或细胞抑制活性。
10.如权利要求1的生物体，其中，所述的生物体是植物。
11.如权利要求1的生物体，其中，所述第二外源基因编码RNA聚合酶并非可操作性的带有真核启动子。
12.如权利要求11的生物体，其中，所述的RNA聚合酶选自细菌RNA聚合酶和噬菌体RNA聚合酶。
13.如权利要求11的生物体，其中，所述的噬菌体RNA聚合酶选自T7 RNA聚合酶，T3 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。
14.如权利要求11的生物体，其中，所述的第一外源基因编码一种多肽，该多肽选自细胞毒性多肽和细胞抑制多肽。
15.如权利要求14的生物体，其中，所述的多肽选自果胶酸裂解酶，1，3β-葡聚糖酶，抗生物素蛋白，链霉抗生物素蛋白，白喉毒素A链(DTA)，URF13，吲哚乙酸-赖氨酸合成酶，CytA毒素和RNA酶TI。
16.如权利要求11的生物体，其中，所述的第二外源基因受控于一种真核组织特异的启动子，使得第一外源基因在该植物的特定组织中表达。
17.如权利要求16的生物体，其中，所述的特定组织形成该植物雄蕊组织的一部分。
18.如权利要求17的生物体，其中，所述的第一和第二外源基因的表达导致该植物雄性不育。
19.一种表达盒，包括(a)包含第一启动子序列的第一节段；(b)包含第一可转录多核苷酸序列的第二节段；和(c)包含第二可转录多核苷酸序列的第三节段，第二可转录多核苷酸序列可操作地与第二启动子序列相连接，所述的第一和第二节段处于该第三节段的侧翼区，其中一对位点特异性重组序列中的一个置于第一节段和第三节段之间，另一个置于第二和第三节段之间，由此当所述的一对位点特异性重组序列通过位点特异性重组将第三节段从该表达盒中切除后，第一启动子序列即可操作地与第一可转录多核苷酸序列相偶联。
20.如权利要求19所述的表达盒，其中，所述的第一启动子序列是非真核启动子序列。
21.如权利要求19所述的表达盒，其中，所述的第二启动子序列是在第一组织中可天然操作的一种组织特异性启动子。
22.如权利要求21所述的表达盒，其中，所述的第一启动子序列是在第二组织中天然可操作的组织特异性启动子序列，其中所述第二可转录多核苷酸序列编码在第二组织中可天然表达的组织特异性转录激活蛋白，该蛋白天然地具有激活第一启动子序列的能力。
23.如权利要求19所述的表达盒，其中，所述的位点特异性重组序列对选自Lox重组序列，FRT重组序列，Gin重组酶序列，Pin重组酶序列和R/RS重组酶序列。
24.如权利要求19所述的表达盒，其中，所述的第二可转录多核苷酸序列编码一种反式激活蛋白。
25.如权利要求24所述的表达盒，其中，所述反式激活蛋白是RNA聚合酶。
26.如权利要求19所述的表达盒，其中，所述的第一多核苷酸序列是一种酶。
27.如权利要求19所述的表达盒，其中，所述的第一可转录多核苷酸序列编码一种RNA分子，该RNA分子选自反义RNA分子和核酶RNA分子。
28.如权利要求19所述的表达盒，其中，所述的第二多核苷酸序列编码一种所述第一启动子序列的反式激活蛋白。
29.如权利要求19所述的表达盒，其中，所述的第一可转录多核苷酸序列编码一种反式激活蛋白。
30.如权利要求24所述的表达盒，其中，所述的反式激活蛋白是一种RNA聚合酶。
31.如权利要求19所述的表达盒，其中，所述的第二多核苷酸序列编码一种酶。
32.如权利要求19所述的表达盒，其中，所述的第二可转录多核苷酸序列编码一种RNA分子，该RNA分子选自反义RNA分子和核酶RNA分子。
33.如权利要求19所述的表达盒，其中，所述的第一可转录多核苷酸序列编码一种所述第二启动子序列的反式激活蛋白。
34.如权利要求19所述的表达盒，其中，所述的第一启动子序列是可在第一组织中天然操作的一种组织特异性启动子序列。
35.如权利要求21所述的表达盒，其中，所述的第二启动子序列是在第二组织中天然可操作的组织特异性启动子序列，其中所述第一可转录多核苷酸序列编码在第二组织中可天然表达的组织特异性转录激活蛋白，该蛋白天然地具有激活第二启动子序列的能力。
36.一种表达盒包括(a)包括第一可转录多核苷酸序列的第一节段，所述的第一可转录多核苷酸序列可操作地与第一启动子序列相连接，所述的第一节段的两侧翼区是一对第一位点特异性重组序列；和(b)与所述的第一节段相连的第二节段，所述的第二节段包括第二可转录多核苷酸序列，所述的第二可转录多核苷酸序列可操作地与第二启动子序列相连接，所述的第二节段的两侧翼区是一对第二位点特异性重组序列。
37.如权利要求36所述的表达盒，其中，所述的第一和第二对直接重复位点特异性重组序列分别独立地选自Lox重组序列，FRT重组序列，Gin重组酶序列，Pin重组酶序列和R/RS重组酶序列。
38.如权利要求36所述的表达盒，其中，所述的第一启动子序列是非真核启动子序列。
39.如权利要求36所述的表达盒，其中，所述的第二启动子序列是可在第一组织中天然操作的一种组织特异性启动子序列。
40.如权利要求39所述的表达盒，其中，所述的第一启动子序列是在第二组织中天然可操作的组织特异性启动子序列，其中所述第二可转录多核苷酸序列编码在第二组织中可天然表达的组织特异性转录激活蛋白，该蛋白天然地具有激活第一启动子序列的能力。
41.如权利要求36所述的表达盒，其中，所述的第二可转录多核苷酸序列编码一种反式激活蛋白。
42.如权利要求41所述的表达盒，其中，所述的反式激活蛋白是RNA聚合酶。
43.如权利要求36所述的表达盒，其中，所述的第一可转录多核苷酸序列编码一种酶。
44.如权利要求36所述的表达盒，其中，所述的第一可转录多核苷酸序列编码一种RNA分子，该RNA分子选自反义RNA分子和核酶RNA分子。
45.如权利要求36所述的表达盒，其中，所述的第二可转录多核苷酸序列编码一种所述第一启动子序列的反式激活蛋白。
46.一种在非人真核生物体中产生外源基因等位性的方法，该方法包括下列步骤(a)产生第一和第二同基因生物体，该同基因生物体对权利要求19的表达盒而言是纯合的；(b)向所述第一生物体中引入重组酶，以便去除所述的第三节段，由此可操作地使所述第一可转录多核苷酸序列与所述第一启动子序列相邻接；和(c)将由步骤(b)中所得的生物体与所述的第二生物体杂交，以便产生具有外源基因等位性特征的后代。
47.如权利要求46所述的方法，其中，所述的非人真核生物体是植物，而且其中所述的第一和第二可转录多核苷酸序列是为使所述后代成为雄性不育且雌性可育而进行选择出的。
48.一种在非人真核生物体中产生外源基因等位性的方法，该方法包括下列步骤(a)产生第一和第二同基因生物体，该同基因生物体对权利要求36的表达盒而言是纯合的；(b)向所述第一生物体中引入重组酶，以便去除所述的第一节段；(c)向所述第二生物体中引入重组酶，以便去除所述的第二节段；和(d)将由上述步骤(b)、(c)中所得的生物体杂交，以产生具有外源基因等位性特征的子代。
49.如权利要求48所述的方法，其中，所述的非人真核生物体是植物，而且其中所述的第一和第二可转录多核苷酸序列是为使所述后代成为雄性不育且雌性可育而进行选择出的。
50.一种对权利要求19的表达盒而言是纯合的植物。
51.一种对权利要求36的表达盒而言是纯合的植物。
52.一种植物，该植物的基因组包括一对处于等位关系的外源基因，其中所述外源基因对的第一外源基因位于该植物基因组的所述染色体对中的第一染色体上，所述外源基因对的第二外源基因位于该植物基因组的所述染色体对中的第二染色体上。
53.如权利要求52所述的植物，其中，所述的第一和第二外源基因是为了使该基因表达后产生雄性不育植物而选择的。
54.如权利要求53所述的植物，其中将所述的雄性不育植物与一种雄性可育植物杂交得到具有雄性可育特征的植物。
55.植物种子，每一种子的基因组包括一对处于等位关系的外源基因，其中所述外源基因对的第一外源基因位于该植物种子基因组的所述染色体对中的第一染色体上，所述外源基因对的第二外源基因位于该植物种子基因组的所述染色体对中的第二染色体上。
全文摘要
一种非人真核生物体，其基因组的染色体对的第一染色体上包含第一外源基因，染色体对的第二染色体上包含第二外源基因，上述的第一和第二外源基因是等位关系，因此第一和第二外源基因强制性地分配到不同的配子中。
文档编号C12N15/82GK1402611SQ00815086
公开日2003年3月12日 申请日期2000年8月27日 优先权日1999年8月31日
发明者S·伊滋哈尔 申请人:费泰西德有限公司