可使甘油脱水的新型酶的制作方法

专利名称：可使甘油脱水的新型酶的制作方法
1 发明领域本发明涉及生产1，3-丙二醇的改进的方法和试剂。更具体而言，本发明提供能催化甘油发酵为1，3-丙二醇的新型嗜热生物和热稳定酶。本发明也涉及分离这些嗜热生物的方法，克隆编码这些酶的多核苷酸的方法，编码这些酶的多核苷酸，和利用这些酶和生物生产1，3-丙二醇的方法。
2 背景1，3-丙二醇是一种在生产聚酯纤维和生产聚氨脂和环状化合物中使用的单体。
1，3-丙二醇的多种合成途径是周知的。例如，1，3-丙二醇能如下合成(1)在磷化氢、水、一氧化碳、氢和一种酸的存在下，利用催化剂转化环氧乙烷；(2)丙烯醛的催化溶液相水合，随后还原；(3)在一氧化碳和氢存在下，利用具有元素周期表中VIII组原子的催化剂反应一种碳氢化合物(例如甘油)。然而，传统化学合成法是昂贵的，并且产生含有环境污染物的废液，因而绝非理想的。发展便宜并且更加利于环境的生产1，3-丙二醇的备选方法和试剂是所希望的。
一种备选方法在体内(即，在微生物中)或在体外使用酶催化甘油发酵为1，3-丙二醇。参见，例如，WO98/21339，WO98/21341和US专利号5,821,092、5,254,467、5,633,362和5,686,276。能由甘油产生1，3-丙二醇的菌株在例如柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、梭菌属(Clostridium)、肠杆菌属(Enterobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、乳杆菌属(Lactobacillus)和暗杆菌属(Pelobacter)中发现。这些细菌通过两步酶催化反应将甘油转化为1，3-丙二醇。第一步，脱水酶催化甘油转化为3-羟基-丙醛(3-HP)和水(方程式1)。第二步，3-HP被NAD+-连接的氧化还原酶还原为1，3-丙二醇(方程式2)。
甘油 3-HP+H2O (方程式1)3-HP+NADH+H+1，3-丙二醇+NAD+(方程式2)1，3-丙二醇不被进一步代谢，因此能在基质中积累到高浓度。总反应导致还原的b-烟碱腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化为烟碱腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。
甘油向1，3-丙二醇的生物转化通常在厌氧条件下进行，用甘油作为唯一的碳源，并且不存在其它的外源还原等价受体。在某些菌株中，如在某些柠檬酸杆菌属、梭菌属和克雷伯氏菌属菌株中，甘油代谢的一个平行途径在运转，首先包括甘油被NAD+-(或NADP+)连接的甘油脱氢酶氧化为二羟丙酮(DHA)(方程式3)。DHA在被DHA激酶磷酸化为磷酸二羟丙酮(DHAP)后(方程式4)，可用于生物合成和支持通过如糖酵解产生ATP。
(方程式3)(方程式4)与1，3-丙二醇途径不同，该途径可为细胞提供碳和能量，并且产生而不是消耗NADH。
在肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)中，在dha调节子中发现编码甘油脱水酶(dhaBCE)、1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油脱氢酶(dhaD)和二羟丙酮激酶(dhaK)的功能上相关连的活性的基因。来自柠檬酸杆菌属和克雷伯氏菌属的dha调节子已经在大肠杆菌中表达，显示能将甘油转化为1，3-丙二醇(Tong等人，Appl.Environ.Microbiol.573541-46(1991)；Seyfried等人，J.of Bact.1785793-96(1996)；Tobimatsu等人，J.Biol.Chem.27122352-22357(1996))。
由于使用生物学方法和试剂生产1，3-丙二醇所固有的潜在优点，需要发展和确定能将甘油和其它碳底物转化为1，3-丙二醇的具有优良特征的新型微生物和酶。本发明通过提供优良的微生物和酶以及鉴定其它优良微生物和酶的方法满足了这一需要。
3 发明概述本发明涉及生产1，3-丙二醇的改进的方法和试剂。更具体而言，本发明提供能催化甘油发酵为1，3-丙二醇的新型嗜热生物和热稳定酶。本发明也涉及分离这些嗜热生物的方法，克隆编码这些酶的多核苷酸的方法，编码这些酶的多核苷酸，和利用这些酶和生物生产1，3-丙二醇的方法。
一方面，本发明提供一种在嗜热生物中将甘油转化为1，3-丙二醇的方法，该方法包括提供一种可将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热生物；在可产生1，3-丙二醇的条件下培养这种嗜热生物。在一个优选实施方案中，该方法还包括收集嗜热生物产生的1，3-丙二醇的步骤。在另一个优选实施方案中，该嗜热生物是Caloramator viterbiensis，其中由保藏为ATCC号PTA-584的生物衍生的嗜热生物是特别优选的。
本发明还提供一种由甘油生产1，3-丙二醇的方法，该方法包括将甘油与热稳定的脱水酶一起温育，由此将甘油转化为3-羟基丙醛；将3-羟基丙醛还原为1，3-丙二醇。在一个优选实施方案中，3-羟基丙醛向1，3-丙二醇的还原由一种热稳定的1，3-丙二醇氧化还原酶催化。在另一个优选实施方案中，该方法还包括收集1，3-丙二醇的步骤。在另一个优选实施方案中，热稳定的脱水酶来自一种嗜热生物，如Caloramator viterbiensis，其中由保藏为ATCC号PTA-584的生物衍生的嗜热生物是特别优选的。
本发明另一方面提供一种来自C.viterbiensis的分离的热稳定甘油发酵酶，其中来自保藏为ATCC号PTA-584的生物的热稳定甘油发酵酶是特别优选的。在特别优选的实施方案中，热稳定甘油发酵酶是一种脱水酶，如甘油脱水酶，或NAD+-连接的氧化还原酶，如1，3-丙二醇氧化还原酶。本发明也提供一种分离的热稳定甘油发酵酶，它与来自C.viterbiensis的热稳定甘油发酵酶同源。
本发明也提供一种分离的C.viterbiensis培养物或细胞。在一个非限制性实施方案中，培养物或细胞的基因组与保藏为ATCC号PTA-584的生物的基因组至少85％相同，优选地与保藏为ATCC号PTA-584的生物的基因组90％相同，更优选地与保藏为ATCC号PTA-584的生物的基因组95％相同，最优选地与保藏为ATCC号PTA-584的生物的基因组至少99％相同。在另一个非限制性实施方案中，培养物或细胞的16SrDNA序列与保藏为ATCC号PTA-584的生物的16S rDNA序列至少95％相同，优选地与保藏为ATCC号PTA-584的生物的16S rDNA序列至少98％相同。
另一方面，本发明提供一种克隆编码热稳定甘油发酵酶的多核苷酸序列的方法，该方法包括使与已知甘油发酵酶基因的一部分同源的多核苷酸探针与怀疑含有嗜热生物的环境样品的多核苷酸分子杂交；分离与至少一种多核苷酸探针结合的多核苷酸序列。在一个非限制性实施方案中，该方法使用聚合酶链反应扩增与多核苷酸探针结合的多核苷酸序列。在一个优选实施方案中，热稳定甘油发酵酶来自确定其可将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热生物，其中C.viterbiensis是特别优选的。在另一个优选实施方案中，多核苷酸探针与已知dhaB基因的一部分同源，其中与来自克雷伯氏菌属的dhaB基因同源的探针是特别优选的。
本发明还提供一种克隆编码热稳定甘油发酵酶的多核苷酸序列的方法，该方法包括用来自嗜热生物的DNA转化一种不能在甘油上厌氧生长的靶生物；通过在甘油上厌氧生长鉴定那些含有编码可将甘油发酵为1，3-丙二醇的酶的多核苷酸序列的转化靶生物。在一个非限制性实施方案中，热稳定甘油发酵酶来自一种确定其可将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热生物，如C.viterbiensis，其中由保藏为ATCC号PTA-584的生物衍生的嗜热生物是特别优选的。
本发明再另一方面提供一种分离可催化甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热生物的方法，该方法包括在含有甘油作为主要碳源的培养基中温育含有嗜热生物的样品；分离至少一种可将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热生物。在非限制性实施方案中，样品在约40℃到约100℃的温度和厌氧条件下温育。在另一个非限制性实施方案中，样品从温度约为环境温度到约100℃、更优选地约50℃到约100℃的自然来源中获得。在一个优选实施方案中，该方法还包括检测嗜热生物产生1，3-丙二醇和/或乙酸盐的步骤。
4 附图简述


图1显示温度对菌株JW/MS-VS-5的生长的影响，td＝倍增时间。
图2显示pH25℃对菌株JW/MS-VS-5在60℃的生长的影响，td＝倍增时间。
图3显示基于JW/MS-VS-5和有关菌株的16S rRNA基因序列对比的无根系统发生树状图。邻接的树由距离矩阵重建。在分支点处显示1000个数据组的分析的引导(bootstrap)值(表示为百分数)。定标线条代替每100个核苷酸5个核苷酸置换。
图4显示在60℃和厌氧条件下，甲苯厌氧处理的JW/MS-VS-5细胞将甘油转化为3-HPA的时程测定。
图5显示在60℃和厌氧条件下，甲苯厌氧处理的JW/MS-VS-5细胞将1，2-丙二醇转化为丙醛的时程测定。
5 发明详述嗜热生物是在大多数其它生物(例如中温生物)不能存活的升高温度下能够存活并生长的生物。这种对高温的异常的适应性部分地是由于这些生物利用热稳定酶催化生命中的生物学反应。热稳定酶使嗜热生物能在升高的温度下催化代谢反应。这些生物能从环境温度的环境中分离，但更可能从高温环境中分离，包括例如温泉、排热口和洗衣店排出液。嗜热细菌和酶的异常的热稳定性使得能在比使用中温生物和酶能达到的更高的温度下催化有经济价值的生物转化。在许多情况中，在发酵过程中用嗜热细菌催化希望的体内反应。此外，也能用热稳定酶在体外或“无细胞”生物转化中催化，这一般利用固定的酶，以便于控制反应和反应产物的回收。
在升高的温度下进行生物转化有许多优点。如同任何化学反应，酶促催化反应的速率通常随反应温度的升高而显著提高。提高进行工业生物转化的速率可获得明显的效益。另外，在大多数可能的污染生物不能存活的升高温度下进行反应，能防止反应培养基的微生物污染。
使用嗜热生物在高温下催化生物转化的另一个优点在于，有时高温便于从反应培养基中分离希望的产物。例如，美国专利号5,182,199描述了使用热稳定酶和高温发酵促进从反应培养基中分离乙醇。
除了对高温稳定外，通常发现热稳定酶对一般可灭活酶的其它条件和物质也具有提高的稳定性。热稳定酶也倾向于比来自中温生物的酶有更长的贮存寿命。本发明提供酶催化生产1，3-丙二醇的改进的方法和试剂。在某种程度上，本发明第一次提供了能催化甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热生物和热稳定酶。这些生物和酶的一个新的特征是它们在以前鉴定的1，3-丙二醇产生生物和酶被快速灭活的升高温度下保持存活和催化活性的能力。本发明的方法和组合物能用来在升高的温度下将甘油生物转化为1，3-丙二醇，由此比以前描述的方法(特别是在较低温度下进行的方法)有明显的优点。本发明还包括鉴定能由甘油产生1，3-丙二醇的嗜热生物的方法，以及克隆编码催化该转化的热稳定酶的多核苷酸的方法。5.1 在升高的温度下能将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热生物，和分离这些生物的方法在一个实施方案中，本发明提供一种在升高的温度下能将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热生物。
在此使用时，术语“嗜热生物”是指在高温下、优选地在高于50℃的温度下、更优选地在高于60℃的温度下、再更优选地在高于70℃的温度下、最优选地在高于85℃的温度下能够生长的生物。在高于85℃的温度下能够生长的生物被称作嗜高温生物。嗜热生物的例子能在如原核微生物真细菌和古细菌中发现。这些生物存在于热环境如温泉、火山区和海底火山口中，并能从中分离。另外，嗜热生物也能从环境温度来源中分离。
在本发明的一个优选实施方案中，在升高的温度下能将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热生物是一种Caloramator viterbiensis菌株。C.viterbiensis是能将甘油发酵为1，3-丙二醇和乙酸盐的嗜热菌的一个种。C.viterbiensis在此被定义为具有下列鉴定特征的菌种该种是(1)嗜热的；(2)能将甘油发酵为1，3-丙二醇；(3)与保藏为ATCC号PTA-584的模式株JW/MS-VS5T有“基本基因组序列同一性”。
在本发明的一个非限制性实施方案中，C.viterbiensis种的一个成员也具有模式株JW/MS-VS5T的下列鉴定特征。JW/MS-VS5T细胞是直的到略微弯曲的杆状，尺寸为0.4～0.6μm。细胞单个存在，菌株为革兰氏阳性。在pH6.0时生长的温度范围为33～64℃，58℃时最佳。生长的pH25℃范围为5.0～7.6，6.0～6.5最佳。使用甘油、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、纤维二糖、乳糖、淀粉和酵母提取物观察到生长。该菌株根本不能发酵木糖、阿拉伯糖、乙酸盐、乳酸盐、甲酸盐、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、丙酸盐、丙酮、琥珀酸盐、乙二醇、1，2-丙二醇、苯酚和苯甲酸盐。在H2CO2存在时，在自养条件下不发生明显的生长。甘油的发酵产生乙酸盐和1，3-丙二醇作为主要有机产物，在生长过程中产生明显量的H2。生长可被氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、利福平和卡那霉素抑制(全都在100μg/ml时)。同样浓度的链霉素或四环素可延缓生长。经HPLC测定，该菌株DNA的G+C含量为32mol％。
为了鉴定推断的C.viterbiensis种的成员，术语“基本基因组序列同一性”是指生物基因组序列与模式株JW/MS-VS5T的基因组序列至少90％的同一性，优选地至少95％的同一性，更优选地至少99％的同一性；或者，生物的16S rDNA序列与模式株JW/MS-VS5T的16S rDNA序列至少90％的同一性，优选地至少95％的同一性，更优选地至少99％的同一性。
基本序列同一性可通过比较推断的C.viterbiensis与JW/MS-VS5T的完整基因组序列来确定。此外，也能通过比较推断的C.viterbiensis与JW/MS-VS5T的16S rDNA序列确定基本序列同一性。JW/MS-VS5T和推断的C.viterbiensis的全部或部分基因组序列，特别是生物的16SrDNA序列，能用本领域技术人员周知的常规核酸测序技术确定(参见，例如，Sambrook等人，《分子克隆，实验室手册》(1989)和《现代分子生物学手册》(Ausubel等人，编写，1989))。然后能用技术人员周知的序列对比方法比较这些序列。例如，能用BLAST计算机程序2.0版计算百分同一性，该程序可在互联网上获得http//www.ncbi.nlm.nih.gov。关于BLAST的描述，参见，例如，Altschul等人，J.Mol.Biol.215403-10(1990)和Altschul等人，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997)。
在一个具体实施方案中，本发明提供一种能将甘油发酵为1，3-丙二醇嗜热微生物，其基因组在低严格条件下可与模式株JW/MS-VS5T的基因组杂交。在一个备选的优选实施方案中，本发明提供一种能将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热微生物，其16S rDNA序列在低严格条件下可与模式株JW/MS-VS5T的16S rDNA序列杂交。使用低严格条件的方法可以如下进行(参见Shilo和Weinberg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA786789-6792(1981))含DNA的滤纸在含有35％甲酰胺、5×SSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.1％ PVP、0.1％ Ficoll、1％BSA和500μg/ml变性鲑精DNA的溶液中在40℃下预处理6小时。杂交在具有下列改变的相同溶液中进行使用0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/ml鲑精DNA、10％(w/v)硫酸葡聚糖和5-20×106cpm32P标记探针。滤纸在杂交混合液中40℃温育18-20小时，然后在含有2×SSC、25mMTris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS的溶液中55℃洗涤1.5小时。将洗涤溶液替换为新鲜的溶液，在60℃下再温育1.5小时。滤纸干燥印迹，暴露进行放射自显影。如必要，滤纸在65-68℃下第三次洗涤，再次暴露于胶片。可以使用的其它低严格条件在本领域众所周知(如种间杂交使用的)。
在另一个具体实施方案中，本发明提供一种能将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热微生物，其基因组在中度严格条件下可与模式株JW/MS-VS5T的基因组杂交。在一个优选实施方案中，本发明提供一种能将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热微生物，其16S rDNA序列在中度严格条件下可与模式株JW/MS-VS5T的16S rDNA序列杂交。使用中度严格条件的方法能如下进行含DNA的滤纸在含有6×SSC、5×Denhart’s溶液、0.5％ SDS和100μg/ml变性鲑精DNA的溶液中在55℃下预处理6小时。杂交在相同溶液中进行，使用5-20×106cpm32P标记探针。滤纸在杂交混合液中55℃温育18-20小时，然后在含有1×SSC和0.1％ SDS的溶液中60℃洗涤2次30分钟。滤纸干燥印迹，暴露进行放射自显影。可以使用的其它中度严格条件在本领域众所周知。滤纸的洗涤在含有2×SSC和0.1％SDS的溶液中37℃进行1小时。
在另一个具体实施方案中，本发明提供一种能将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热微生物，其基因组在高度严格条件下可与模式株JW/MS-VS5T的基因组杂交。在一个优选实施方案中，本发明提供一种能将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热微生物，其16S rDNA序列在高度严格条件下可与模式株JW/MS-VS5T的16S rDNA序列杂交。使用高度严格条件的方法能如下进行含DNA的滤纸的预杂交在由6×SSC、50mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA和500μg/ml变性鲑精DNA组成的缓冲液中在65℃下进行8小时至过夜。滤纸在含有100μg/ml变性鲑精DNA和5-20×106cpm32P标记探针的预杂交混合液中65℃杂交48小时。滤纸的洗涤在含有2×SSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll和0.01％ BSA的溶液中37℃进行1小时。随后在0.1×SSC中50℃洗涤45分钟，之后进行放射自显影。可以使用的其它高度严格条件在本领域众所周知。
C.viterbiensis种还包括模式株JW/MS-VS5T的后代，包括相对于模式株JW/MS-VS5T基因型和/或表型改变的后代。突变(包括定向或随机诱变引起的)能改变表型和/或基因型。本发明提供具有单个或多个突变的细胞，特别用来提高1，3-丙二醇的产生。例如，耐受底物或产物抑制的能将甘油发酵为1，3-丙二醇的突变株预计在本发明中特别有用。
产生突变体的方法在本领域中常用且众所周知。例如，可将野生型细胞暴露于多种因素，如辐射或化学诱变剂，然后筛选希望的表型。当通过辐射产生突变时，可以使用紫外线(UV)或电离辐射。用辐射或化学剂产生突变体的具体方法在本领域中得到很好地证明。参见，例如，Brock，《生物技术工业微生物教材》第二版(1989)，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，Mass.或Deshpande，Appl.Biochem.Biotechnol.36227-34(1992)，在此引用作为参考。在诱变处理后，可以用多种方法筛选具有希望的表型的突变体。当对于希望的性质筛选诱变的细胞时，随机筛查是最常用的。突变体筛选方法在工业微生物领域高度发展并且众所周知。参见，例如，Brock，同上文。
本发明还提供分离和培养保存能将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热生物的方法。这些生物在实施本发明的实施方案中有用，例如，能用它们在升高的温度下将甘油生物转化为1，3-丙二醇，或者它们能用作发酵甘油的热稳定酶或编码它们的多核苷酸的来源。
适于细菌培养物保存和生长的材料与方法见，例如《普通细菌学方法手册》(Gerhardt等人编写)，美国微生物学会，华盛顿，或Brock，同上文。用于细菌细胞生长和保存的试剂和材料能从供应商处获得，例如Aldrich Chemicals(Milwaukee，Wis.)、DIFCO Laboratories(Detroit，Mich.)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，Md.)或Sigma ChemicalCompany(St.Louis，Mo.)。
本发明的嗜热生物，如C.viterbiensis，能从有利于嗜热生物生长的任何环境中分离，例如，排热口、温泉或土壤或它们周围的水和沉积物，或洗衣店排出液。例如由沉积物、水或其混合物组成的样品从目的环境中收集。测量采样点的pH和温度作为从样品中分离的任一种生物的最适生长条件是希望的。然后用样品接种基础培养基，优选地甘油作为唯一或主要碳源的培养基。基础培养基一般用样品接种为终浓度约10％(w/v)。培养基的pH优选地接近采样点。此外，能接种不同pH的多种基础培养基，以筛选具有不同pH生长依赖性的生物。然后在高温下温育富集培养物，优选地至少约50℃，更优选地至少约60℃，最优选地至少约75℃，优选地在厌氧或微需氧环境中进行。培养嗜热生物的指导见，例如，Weigel，J.，“嗜热生物的分离与研究方法”，《嗜热生物普通、分子和应用微生物学》的第4章，T.D.Brock编写(John Wiley & Sons，N.Y.)，第17-37页。
当富集培养物能利用甘油作为碳源时，均质培养物能如下分离制备一系列稀释的培养物，使用软琼脂覆盖层(例如含有0.8％琼脂的基础培养基)将这些系列涂布于固体基础培养基(例如1.5％琼脂)上，挑取单菌落，在相同组成的液体培养基中传代培养，检查1，3-丙二醇和/或乙酸盐的形成。对培养基进行高压液相层析(HPLC)分析能直接鉴定1，3-丙二醇。例如，能用0.01N硫酸的流动相以等度方式在分析离子交换柱上分析发酵培养基。此外，1，3-丙二醇也能用其它合适的分析技术鉴定，包括但不限于气相色谱法(GC)和气相色谱-质谱法(GC-MS)。
能将甘油转化为1，3-丙二醇的嗜热生物的一种菌株能用本领域周知的培养保存技术培养保存。这些方法包括冷藏(短贮存时间)、在液氮中冷冻(延长的贮存时间)和冻干(使细胞脱水)。保存方法的选择取决于培养物的性质和可以利用的设施。当使用冷冻时，必须仔细控制冻融率，以确保微生物存活，因为冷冻过程中形成的冰晶能破坏膜。甘油通常用作“防冻”剂，以防止冰晶引起的损害，并确保当冷冻培养物融解时回收活微生物的能力。5.2 在升高的温度下能产生1，3-丙二醇的热稳定酶在一个实施方案中，本发明提供一种在升高的温度下催化甘油发酵为1，3-丙二醇中的一个步骤的热稳定酶，在此被称为“热稳定甘油发酵酶”。
在此使用时，术语“热稳定甘油发酵酶”是指催化甘油发酵为1，3-丙二醇中的至少一个反应步骤的一种酶，它是“热稳定的”，即，在高温下(优选地在高于50℃时，更优选地在高于60℃时，再更优选地在高于70℃时，最优选地在高于85℃时)稳定并具活性。如果一种酶在暴露于给定温度至少5分钟后，优选地至少30分钟后，更优选地至少1小时后，再更优选地至少8小时后，最优选地至少24小时或更长后，能保留原始催化活性的至少50％，则该酶在该温度下“稳定”。在许多情况中，热稳定酶也有延长的保存期，并且对变性条件(如物理搅拌或接触有机溶剂)比具有类似功能特性的非热稳定酶更加稳定。
在一个优选实施方案中，本发明提供一种来源于C.viterbiensis的热稳定甘油发酵酶。在一个优选但非限制性的实施方案中，本发明提供一种来源于C.viterbiensis的热稳定的脱水酶。在另一个优选但非限制性的实施方案中，本发明提供一种来源于C.viterbiensis的热稳定的1，3-丙二醇氧化还原酶。在本发明的一个特别优选的实施方案中，热稳定甘油发酵酶来源于JW/MS-VS5T株。
在此使用时，术语“脱水酶”是指能催化甘油分子转化为产物3-羟基丙醛的任一种酶。脱水酶的具体例子包括甘油脱水酶和二醇脱水酶，即优选底物分别为甘油和1，2-丙二醇的的脱水酶。
术语“1，3-丙二醇氧化还原酶”是指一种能催化3-羟基丙醛转化为1，3-丙二醇、并伴随有NADH氧化的酶。
催化甘油发酵为1，3-丙二醇中的一个反应步骤的能力可通过测定酶活性确定。甘油发酵活性能用本领域技术人员周知的技术测定。例如，Poppe等人，Eur.J.of Biochem 245398-41(1997)，Honda等人，J.of Bact.1431458-65(1980)，和Macis等人，FEMS Microbiology Letters16421-28(1998)叙述了测定脱水酶活性的方法，在此引用作为参考。例如，Johnson等人，J.of Bact.1692050-54(1987)叙述了测定1，3-丙二醇氧化还原酶活性的方法，在此引用作为参考。酶活性能用甲苯处理的细胞原位测定，如Honda等人所述。也能通过在一般不能发酵甘油的宿主细胞中表达酶，并测定酶的表达是否可使细胞发酵甘油，来确定该酶催化甘油发酵为1，3-丙二醇中的一个反应步骤的能力。
对于本发明，如果热稳定的1，3-丙二醇产生酶(a)由C.viterbiensis或C.viterbiensis的指定株内源表达，或其氨基酸序列由C.viterbiensis或C.viterbiensis的指定株中存在的多核苷酸编码序列编码；(b)在实施本发明中有用，则它“来源于”C.viterbiensis或C.viterbiensis的指定株。在此使用时，如果酶是一种热稳定甘油发酵酶，即催化甘油发酵为1，3-丙二醇中的至少一个反应步骤，并在高温下(优选地在高于50℃时，更优选地在高于60℃时，再更优选地在高于70℃时，最优选地在高于85℃时)稳定且具活性，则该酶“在实施本发明中有用”。
本发明还提供一种与来源于C.viterbiensis的热稳定甘油发酵酶同源的酶。对于本发明，如果(a)一种酶的氨基酸序列由一种多核苷酸编码序列编码，该多核苷酸序列在中度严格条件下(即，在65℃时在0.5MNaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中与滤纸结合的DNA杂交，在42℃时用0.2×SSC/0.1％SDS洗涤(Ausubei等人，1989，《现代分子生物学方法》第一卷，Green Publishing Associates，Inc.，和JohnWiley & Sons，Inc.，纽约，第2.10.3页))可与编码来源于C.viterbiensis的热稳定甘油发酵酶的多核苷酸序列的互补序列杂交；(b)它在实施本发明中有用，则该酶与来源于C.viterbiensis的热稳定甘油发酵酶“同源”。在一个优选实施方案中，该同源酶由一种多核苷酸编码序列编码，该多核苷酸序列在高度严格条件下(即，在65℃时在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mM EDTA中与滤纸结合的DNA杂交，在68℃时用0.1×SSC/0.1％SDS洗涤(Ausubel等人，同上文))可与编码来源于C.viterbiensis的热稳定甘油发酵酶的多核苷酸序列的互补序列杂交，并且在实施本发明中有用。
与来源于C.viterbiensis的热稳定甘油发酵酶同源的酶能采取多种形式。在本发明的某些实施方案中，该同源酶是来源于C.viterbiensis的热稳定甘油发酵酶的突变形式，其中一个或多个氨基酸残基被置换为不同的氨基酸残基，产生一种在实施本发明中有用的酶。突变可以是保守性的，其中氨基酸残基被置换为具有类似功能和结构特征(如酸度、极性或侧链膨胀度)的另一种氨基酸残基。突变也可以是非保守性的，其中置换的氨基酸残基的功能和/或结构特性不是保守的。有时，来源于C.viterbiensis的热稳定甘油发酵酶的突变形式具有相对于天然酶改变的功能特性，如改变的催化能力、稳定性或最适pH或温度。这些突变体只要与来源于C.viterbiensis的热稳定甘油发酵酶同源，即属于本发明的范围。
酶的突变形式能用技术人员周知的多种技术产生。美国专利号5,830,696中综述了大量这些技术，在此引用作为参考，它描述了热稳定酶的定向进化。此外，突变酶也能在生物中随机产生，或自然存在。
而且，与来源于C.viterbiensis的热稳定甘油发酵酶同源的酶也可以是天然C.viterbiensis酶的缺失突变体或截短变体。这些酶形式的应用有时是希望的，例如，当缺失或截短导致相对于相应的天然酶稳定性提高或易于纯化时。
本发明还提供一种与来源于C.viterbiensis的热稳定甘油发酵酶同源的酶，它是来源于C.viterbiensis的热稳定甘油发酵酶的一种嵌合形式，即，一种融合蛋白。嵌合体能用于例如提高酶的稳定性或便于纯化，例如，通过内含能与离子交换、金属螯合、底物亲和或免疫亲和基质结合的部分。在一个优选实施方案中，本发明提供一种与固体载体(如纤维素)共价结合的同源酶。
此外，本发明也提供一种与来源于C.viterbiensis的热稳定甘油发酵酶同源、而来源于不同微生物(优选地嗜热微生物)的酶。这种酶的一个例子是热稳定甘油发酵酶“同系物”，它被定义为由不同种的基因编码的酶，其中本领域技术人员根据大于约80％的核苷酸序列同一性程度，认为该基因是C.viterbiensis甘油发酵基因的同系物。序列同一性能用如上文所述的BLAST程序确定。
在一个实施方案中，本发明提供一种分离的热稳定甘油发酵酶，术语“分离的”是指该酶至少是部分纯化的，即，相对于制品中的其它物质，制品中酶的重量百分比高于自然存在的。在一个优选实施方案中，本发明提供一种分离的热稳定甘油发酵酶，其纯度至少为污染的蛋白质重量的90％，更优选地至少为蛋白质重量的95％。
下文中描述了在制备和分离上述酶中可用的材料与方法。在一个实施方案中，本发明的酶能从内源表达该酶的嗜热生物(特别是C.viterbiensis菌株)中分离。此外，也能通过向合适的宿主细胞中引入编码该酶的多核苷酸序列并表达编码的基因产物，重组产生本发明的酶。本发明的酶也能利用体外翻译或化学合成技术产生。5.3 克隆编码可将甘油转化为1，3-丙二醇的热稳定酶的多核苷酸的方法本发明提供一种编码热稳定甘油发酵酶的多核苷酸序列或其片段，和鉴定、分离和克隆这些多核苷酸的方法。这些方法包括获取含有来自嗜热生物的多核苷酸编码序列的样品，筛选编码热稳定甘油发酵酶的多核苷酸序列或其片段。样品可以采用多种形式之一，通过本领域技术人员周知的多种不同技术制备。类似地，可用多种合适的技术实现样品的筛选，下文中描述了这些技术的一些非限制性例子。
此处公开的多核苷酸分子和寡核苷酸分子的产生和操作在本领域范围内，能按照以下所述的重组技术进行Sambrook等人，《分子克隆，实验室手册》(1989)；《现代分子生物学手册》(Ausubel等人编写，1989)；《PCR策略》(Innis等人编写，1995)；和《PCR技术》(Erlich等人编写，1992)，全部在此引用作为参考。
在本发明的一些实施方案中，用具有被认为编码一种甘油发酵酶的核苷酸序列的探针，或代表其部分的探针筛查样品。探针序列可基于已知甘油发酵酶的氨基酸序列，或其片段，或编码这种酶的多核苷酸序列。例如，甘油发酵酶的一部分的氨基酸序列能用如Creighton《蛋白质结构与分子原则》(1983)所述的氨基酸测序技术测定，用这些信息产生一组简并探针。在本发明的一个优选实施方案中，用基于编码来自嗜热生物(如C.viterbiensis)的脱水酶或氧化还原酶序列的探针筛查样品。此外，探针也可基于来自非嗜热生物(例如，K.pasteurianum、弗氏柠檬酸杆菌或巴氏梭菌(C.pasteurianum))的甘油发酵酶编码基因，如dhaBCE或dhaT基因，它们分别编码甘油脱水酶和氧化还原酶。文献中报道了dhaBCE基因的核苷酸序列(参见，例如，Macis等人，FEMS Microbiology Letters16421-28(1998)(巴氏梭菌)；Seyfried等人，J.of Bacteriology1785793-96(1996)(弗氏柠檬酸杆菌)；Tobimatsu等人，J.Biol.Chem.27122352-57(1996)(K.pasteurianum))。也报道了dhaT基因的核苷酸序列(参见，例如，Luers等人，FEMS Microbiol.Lett.154337-45(1997)(巴氏梭菌)；Daniel等人，J.of Bacteriol.1772151-56(1995)(弗氏柠檬酸杆菌))。本发明提供的特异探针包括基于K.pasteurianum的dhaB基因的引物对(如以下通过说明性实施方案详述的，dhaB15’(SEQ ID NO1)；dhaB13’(SEQ ID NO2)；dhaB25’(SEQ ID NO3)；dhaB23’(SEQ IDNO4)；dhaB35’(SEQ ID NO5)；dhaB33’(SEQ ID NO6))，它们特别可用于通过聚合酶链反应(“PCR”)扩增甘油发酵酶编码多核苷酸或其片段。能用这种引物对从目的生物中扩增甘油发酵酶编码多核苷酸的片段，随后作为探针用于从相同或不同生物中鉴定并克隆全长编码序列。可标记探针，以在例如cDNA文库中鉴定同源序列。此外，也能用探针作为引物尤其通过PCR或RT-PCR扩增侧翼为可被该引物识别的序列的多核苷酸序列。特别是，能从cDNA或基因组文库，从分离的生物，或从环境样品中扩增目的序列，如下详述。
在本发明的一个实施方案中，将要筛选的样品是一种怀疑携带嗜热生物的环境样品，如从利于嗜热生活的环境中收集的水、土壤或泥样品。一般而言，以一种方式制备环境样品，使样品中存在的核酸可与互补探针如PCR引物相互作用。能根据与上述探针杂交的能力识别编码甘油发酵酶的多核苷酸或其片段。
从环境样品中分离和克隆本发明的多核苷酸的一种优选方法是利用PCR。该技术利用编码同源酶或具有类似活性的酶的多核苷酸之间的序列同源性。该方法使用基于已知甘油发酵酶编码多核苷酸序列或其部分的一组引物，从环境样品中扩增同源多核苷酸序列或其片段。能用本领域周知的常规PCR方法从样品中的DNA中，特别是从样品中微生物的基因组DNA中扩增同源多核苷酸。此外，也能通过合成RNA的第一链cDNA拷贝，并经PCR(如RT-PCR)扩增cDNA，从样品中的RNA中，特别是mRNA或总RNA中扩增同源多核苷酸。利用本领域技术人员周知的技术，能调节反应的退火条件，使引物以希望的同源性水平杂交，由此可扩增与引物所基于的序列有较多或较少同源性的序列。该方法允许分离完整的甘油发酵酶编码开放阅读框(“ORF”)或其片段。甘油发酵酶编码ORF的一个或多个片段能一起克隆和剪接，以产生完整的ORF。然后能在实施本发明的不同方面中用扩增的甘油发酵酶编码ORF表达编码的甘油发酵酶。例如，能将序列导入宿主细胞中，从而使宿主细胞能发酵甘油。此外，为了如无细胞发酵的用途也能纯化表达的酶。此外，为了进一步检测和分离新型热稳定甘油发酵酶编码序列，能用ORF序列本身设计新型引物和探针。
在本发明的另一个实施方案中，样品是由嗜热生物(特别是已知能将甘油发酵为1，3-丙二醇的生物)制备的一种多核苷酸文库，优选地是一种基因组或cDNA文库。关于分子生物学技术的一般背景及如何制备cDNA文库和基因组文库，参见，例如，Ausubel等人，同上文；Sambrook等人，同上文；美国专利号5,650,148。如上所述，能用核酸杂交筛选技术结合适当标记的探针筛查该文库。Benton和Davis，Science196180(1977)(噬菌体文库)和Grunstein和Hogness，Proc.Natl.Acad.Sci.USA723961-65(1975)(质粒文库)描述了合适的筛选技术，在此引用作为参考。
在本发明的另一个实施方案中，样品含有一种分离的生物，或由分离的生物产生的多核苷酸文库，能用PCR或RT-PCR从中扩增本发明的多核苷酸。优选地，使用的分离的生物是嗜热生物，并能发酵甘油。
在本发明的一个实施方案中，构建一种表达文库，它能指导该文库的多核苷酸组分编码的基因产物的表达。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，通过检测其组分编码可催化甘油发酵中一个步骤的基因产物的能力，功能筛查表达文库。在一个优选实施方案中，通常不能将甘油发酵为1，3-丙二醇的生物用如上所述的DNA文库(优选地由已知能发酵甘油的嗜热生物制备的文库)的组分转化。然后通过在甘油上厌氧生长，根据将甘油发酵为1，3-丙二醇的能力，筛选转化的生物。能根据1，3-丙二醇或乙酸盐的产生筛选转化的微生物。在甘油上厌氧生长或产生1，3-丙二醇和/或乙酸盐的能力表明，用来转化生物的文库组分编码一种具有甘油发酵所需酶活性的酶。然后能用标准技术克隆和表征该文库组分，并在实施本发明的各方面中使用。
用上述功能克隆策略转化的微生物可以是先天缺乏发酵甘油的能力的微生物，或由于突变(例如甘油发酵所需的一种基因的无效突变)丧失发酵甘油的能力的微生物。可以用本领域周知的技术将这种突变构建到生物中。微生物可以是，但并非必须是嗜热生物。优选地，测试的微生物没有甘油发酵所需的一种酶活性，使得导入一种酶活性能恢复发酵甘油的能力。
此外，能用标准技术结合抗甘油发酵酶的抗体免疫筛选表达的基因产物。关于这种筛选技术，参见，例如，《抗体实验室手册》(Harlow和Lane编写，1988)。5.4 能将甘油发酵为1，3-丙二醇的重组生物本发明也提供一种遗传改造后表达一种或多种外源(即异源)热稳定甘油发酵酶的重组生物。在本说明书中使用时，术语“外源”是指该酶由一种异源多核苷酸编码序列(即对于宿主生物不是天然的或内源的多核苷酸序列)编码。在一个优选实施方案中，构建重组生物使之表达一种来源于C.viterbiensis的热稳定甘油发酵酶，或与这种酶同源的酶。在一个特别优选的实施方案中，构建重组生物使之表达一种来源于C.viterbiensis株如JW/MS-VS5T的脱水酶或1，3-丙二醇氧化还原酶。
本发明的一种重组生物能用于实施本发明的多个方面。例如，能用该重组生物作为甘油生物转化为1，3-丙二醇过程中的催化剂。在另一个非限制性实施方案中，能用该重组生物作为热稳定甘油发酵酶的来源，它能用技术人员熟悉的蛋白质纯化技术分离。
本发明提供适于克隆、转化和表达编码热稳定甘油发酵酶的多核苷酸序列或其片段的多种载体和转化和表达盒。合适的载体是那些适应于宿主微生物和产生的重组微生物的用途的载体。例如，合适的载体可来源于质粒、病毒(如噬菌体T7或M13衍生的噬菌体)或粘粒。获得和使用这些载体的方法为本领域技术人员所周知。参见，例如，Sambrook等人，同上文。
载体或盒一般含有指导相关基因转录和翻译的序列、选择性标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含携带转录起始控制的编码序列5’的区域和控制转录终止的编码序列3’的区域。在一个优选实施方案中，控制区来源于与转化的宿主细胞同源的基因。
优选地构建本发明的重组载体，特别是表达载体，使编码序列与编码序列转录和翻译所必需的一个或多个调节元件有效结合。在此使用时，术语“调节元件”包括但不限于编码诱导型和非诱导型启动子、增强子、操纵子的核苷酸序列和本领域中周知可引导和/或调节多核苷酸编码序列表达的其它元件。在此使用时，当调节元件有效调节或允许编码序列的转录或其mRNA的翻译或此两者时，称编码序列与一个或多个调节元件“有效结合”。
这些载体的调节元件在强度和特异性上可能不同。根据使用的宿主/载体系统，能使用多种合适的转录和翻译元件中的任一种。细菌的转录调节区或启动子的非限制性例子包括β-gal启动子、T7启动子、TAC启动子、λ左及右启动子、trp和lac启动子和trp-lac融合启动子。
表达重组蛋白的一般方法在本领域中众所周知，如R.Kaufman，Methods in Enzymology 185537-566(1990)。任选地，异源序列能编码包含N端鉴定肽的融合蛋白，该肽提供希望的特性，例如表达的重组产物的稳定性或简化的纯化。
为了引导甘油发酵酶进入宿主细胞的分泌途径，可在表达载体中含有分泌信号序列。分泌信号序列与编码甘油发酵酶的多核苷酸序列在正确的阅读框中连接。分泌信号序列通常位于编码序列的5’。分泌信号序列可以与宿主生物分泌的蛋白质正常结合。
一旦构建合适的转化或表达载体，即可利用已知的方法用它转化合适的宿主细胞，如钙通透的细胞、电穿孔、原生质体转化或用重组噬菌体病毒转染。合适的表达宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)的不同种，尽管也可使用其它的作为选择。
在一个优选实施方案中，本发明提供一种经遗传构建表达一种或多种外源热稳定甘油发酵酶的嗜热重组微生物。这些微生物特别可用于如上所述的甘油向1，3-丙二醇的生物转化。嗜热微生物的例子包括芽孢杆菌属、栖热菌属(Thermus)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)、热分枝菌属(Thermobrachium)和喜热菌属(Caloramator)的成员。
选择的宿主微生物优选地能产生辅因子腺苷-钴胺素(辅酶B12)。必要时，能引入B12合成基因，微生物和/或培养基能补充维生素B12。5.5 分离热稳定甘油发酵酶的方法本发明提供一种制备和分离热稳定甘油发酵酶的方法。在一个优选实施方案中，该酶为基本上纯化的形式。在一个非限制性实施方案中，从表达天然热稳定甘油发酵酶的嗜热微生物中分离该酶。在另一个非限制性实施方案中，从经构造表达编码热稳定甘油发酵酶的外源多核苷酸序列的重组生物中分离该酶。此外，也能用常规溶液或固相肽合成法制备本发明的热稳定酶，如Creighton，同上文所述。
表达目的热稳定甘油发酵酶的宿主细胞一般用本领域周知的方法在适于生产该酶的营养培养基中培养。例如，可通过摇瓶培养、在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，这在合适的培养基中和可表达和/或分离该酶的条件下进行。合适的营养培养基一般包含碳源和氮源和无机盐，使用本领域周知的方法。合适的培养基可从供应商处获得，或者可以按照公开的组成制备(例如，美国典型培养物保藏中心目录)。
根据使用的宿主细胞和表达载体的性质，酶可以保留在细胞质中，通常是不溶性颗粒(称为包涵体)，或者可以由细菌分泌序列导向周质间隙。对于前者，裂解细胞，回收并变性颗粒，之后通过稀释变性剂使该酶重折叠。对于后者，可以通过破坏细胞，例如超声处理或渗压休克，释放周质间隙的内容物并回收该酶，从周质间隙中回收该酶。如果酶分泌到营养培养基中，可直接从培养基中回收。
然后可利用本领域周知的常规技术回收细胞产生的酶，包括但不限于离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发、差异溶解度(例如硫酸铵沉淀)、层析(例如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)或电泳法(例如制备、等电聚焦(IEF))(参见，例如《蛋白质纯化》(Janson和Ryden编写，1989)；Scopes，《蛋白质纯化原理与实践》(1994)；Sambrook等人，同上文；Ausubel等人，同上文)。
在一个优选实施方案中，将酶纯化为包含便于快速亲和纯化的融合元件的融合蛋白。有用的纯化融合元件包括组氨酸和谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签。可包含一个蛋白酶识别位点，如凝血酶或因子Xa识别位点，使得能从融合元件上切下希望的蛋白质产物。可用于构建基因融合表达系统的载体能商品获得，如从Amersham Pharmacia Biotech，Inc.(Piscataway，NJ)购得。
文献中描述了可用于分离甘油发酵酶的特异蛋白质纯化方法(参见，例如，Seyfried等人，J.of Bact.1785793-96(1996)(甘油脱水酶)；Tobimatsu等人，J.of Bact.1814110-13(1996)(甘油脱水酶)；Johnson等人，J.of Bact.1692050-54(1987)(1，3-丙二醇氧化还原酶))。例如，Seyfried等人描述了用维生素B12-琼脂糖树脂作为亲和基质纯化甘油脱水酶。5.6 将甘油生物转化为1，3-丙二醇的方法本发明提供将甘油转化为1，3-丙二醇的生物方法。在此使用时，将甘油转化为1，3-丙二醇的“生物”方法是使用生物催化剂(如甘油发酵酶)作为微生物的组分或在无细胞酶催化反应系统中使用它的方法。特别是，本发明提供能在高温下进行，由嗜热生物和/或热稳定酶催化的生物转化方法。在一个优选实施方案中，该方法在高于50℃时、更优选地在高于60℃时进行，使用能将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热微生物。
在一个非限制性实施方案中，该方法使用一种自然表达热稳定甘油发酵酶全互补序列的嗜热微生物，表达的酶足以催化甘油发酵为1，3-丙二醇中的所有反应步骤，例如1，3-丙二醇氧化还原酶、甘油脱水酶和/或二醇脱水酶。在一个特别优选的实施方案中，用一种C.viterbiensis菌株，例如JW/MS-VS5T株，作为生物催化剂。
在一个备选实施方案中，该方法使用一种重组微生物，优选地一种嗜热重组微生物，它经过遗传构造可表达一种或多种外源热稳定甘油发酵酶。嗜热微生物的例子包括芽孢杆菌属、栖热菌属、硫化叶菌属、热厌氧杆菌属、热分枝菌属和喜热菌属的成员。在本说明书中使用时，术语“外源”是指该酶由一种异源多核苷酸编码序列(即对于嗜热宿主生物不是天然的或内源的多核苷酸序列)编码。在一个优选实施方案中，异源多核苷酸序列编码一种来源于C.viterbiensis的热稳定甘油发酵酶，或与这种酶同源的酶。在一个特别优选的实施方案中，异源多核苷酸序列来源于一种C.viterbiensis菌株。
任选地，在本发明的方法中使用的嗜热微生物能产生辅因子腺苷-钴胺素(辅酶B12)。必要时，能引入B12合成基因，微生物和/或培养基中能补充维生素B12。
本发明提供一种用本发明的嗜热生物将甘油生物转化为1，3-丙二醇的发酵方法。应当优化发酵条件，平衡成本收益与产量和效率。商业发酵方法的发展一般逐步进行，开始时用小瓶，然后用小发酵罐(10加仑以下)、中度大小的发酵罐(可达几百加仑)，最后用大规模发酵罐(数千加仑)。在每一生产阶段，调节发展条件以最小成本产生最大产量。培养基的有机和无机组成，以及pH、温度和氧浓度，是使生产效率达到最大的主要变化因素。甚至在分批培养过程中，为了达到最大产量，发酵过程中条件常常变化，并且在发酵过程中监测条件，以确保重要参数保持在允许的限制内。在加入生产过程中使用的微生物菌株之前，反应室和底物溶液应当灭菌。当在较低温度下发酵时，反应物感染微生物污染物容易导致用于产生产物的菌株的竞争性置换，具有明显的不利结果。本发明的一个重要优点是，利用嗜热生物和/或热稳定酶，能在大多数可能的污染物不能存活的高温下进行反应。
发酵培养基的组成必须包括支持微生物生长和希望的产物形成所必需的养分。必需的养分包括碳源、氮源和磷。根据经济及生物基础选择特定营养来源。根据发酵方法的性质，可在发酵开始时加入所有原材料，或者可以在过程中向微生物中逐渐补加养分。
反应物的pH可大大影响发酵。参与形成希望的产物的酶全都具有最大活性的最适pH范围和保持活性的有限pH范围。发酵罐中生物的快速生长能快速改变培养基的pH。例如，酸(如乙酸)的积累能使未缓冲的培养基的pH急剧降低，抑制或终止希望的发酵产物的产生。为了防止这些改变，应当缓冲发酵培养基以防止pH改变。另外，一般连续监测反应溶液的pH，需要时加入酸或碱，以保持在可接受的允许限度内。在使用JW/MS-VS5T株的发酵过程中，培养基的pH应当保持在约5.0-7.8，优选地约pH 6.0-6.5。
也应当仔细调节反应温度，以达到最佳产量。能用加热盘管保持升高的温度，以达到最佳的产物形成率，并抑制微生物污染物的感染。加热盘管也能用于对发酵容器的定期灭菌。能在符合微生物活性和生存力的任何温度下进行发酵。在一个优选实施方案中，在至少40℃、优选地至少50℃、最优选地至少60℃或更高的温度下进行本发明。在使用JW/MS-VS5T株的发酵过程中，温度应当保持在33-64℃，优选地50-64℃，最优选地57-64℃。
除了营养和环境参数外，发酵过程可以设计为分批过程，类似于用微生物培养物接种含有培养液的摇瓶，或是连续流动过程，类似于恒化器。方法设计的选择取决于希望的产物生产和回收的经济情况。与分批过程相比，流通发酵罐更易于被不希望的生物污染，这使得质量控制难以保持，特别是在适中温度下进行发酵时。然而，流通设计具有可生产能以恒定速度回收的连续产物的优点。由于它们是自然的，分批方法需要一定的启动时间来起始发酵过程，需要一定的温育时间使发酵产物积累，需要一定的回收时间使产物与培养基和微生物细胞分离。
在本发明的另一个实施方案中，能用该方法将可发酵碳底物而不是甘油转化为1，3-丙二醇。在一个非限制性实施方案中，可以通过向微生物中重组导入甘油转化为1，3-丙二醇所必需的热稳定1，3-丙二醇产生酶的互补物，构建能将可发酵碳底物(如单糖，如葡萄糖，或多糖)转化为甘油的嗜热微生物，使之产生1，3-丙二醇。这些酶可来源于能将甘油转化为1，3-丙二醇的嗜热生物，例如C.viterbiensis。美国专利号5,686,276叙述了向非嗜热生物中重组构建甘油发酵为1，3-丙二醇所需酶活性的技术，在此引用作为参考。
此外，能构建本发明的一种重组微生物，使之将不是甘油的碳源发酵为1，3-丙二醇。这些生物的使用是有利的，特别是对于由便宜的碳源(如葡萄糖或可发酵多糖)生产1，3-丙二醇。例如，可以构建能将甘油发酵为1，3-丙二醇的微生物，使之能将糖酵解中间产物(如二羟丙酮磷酸盐)转化为甘油，从而允许将来自非甘油来源的碳引入发酵途径中。WO98/21340(在此引用作为参考)叙述了通过用含有编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因和编码甘油-3-磷酸磷酸酶的基因之一或两者的表达盒转化合适的宿主细胞，由重组生物产生甘油的方法。这些生物能将单糖(如葡萄糖)发酵为甘油。这些生物，或者实际上是可产生这些酶或备选甘油合成途径酶的任何遗传工程生物，能作为宿主细胞用于利用本发明的组合物和方法将甘油进一步发酵为1，3-丙二醇。此外，WO98/21339(在此引用作为参考)叙述了可表达编码甘油-3-磷酸脱氢酶、甘油-3-磷酸酶、甘油脱水酶和1，3-丙二醇氧化还原酶的基因，从而能将葡萄糖和其它糖转化为1，3-丙二醇的工程重组微生物。因此，本领域技术人员能利用这一策略由任何碳底物生产1，3-丙二醇，它能被转化为甘油、二羟丙酮、甘油氧化状态的C3化合物(例如甘油-3-磷酸)或二羟丙酮氧化状态的C3化合物(例如二羟丙酮磷酸或甘油醛3-磷酸)(参见，例如，WO98/21339)。
在本发明的另一个实施方案中，可以构建使用的重组嗜热生物，使之表达或以提高的水平表达一种能抑制甘油发酵酶失活的蛋白质。例如，能用WO98/21341(在此引用作为参考)所述的技术引入能逆转甘油脱水酶的底物介导失活的酶的表达。
在含有将被转化为1，3-丙二醇的碳底物(优选地作为唯一的或主要的碳源)的培养基中实施本发明的方法。在一个优选实施方案中，使用一种基础培养基，其中甘油作为唯一或主要的碳源。除了合适的碳源外，发酵培养基必须含有合适的矿物质、盐、辅因子、缓冲液和本领域技术人员公知适于培养物生长和提高产生1，3-丙二醇所需的酶活性的其它成分。应当特别注意Co(II)盐和/或维生素B12或其前体。以下实施例中列出了在C.viterbiensis将甘油转化为1，3-丙二醇中使用的合适培养基的具体非限制性实例。
本发明的方法能在需氧或厌氧条件下进行，厌氧或微需氧条件是优选的。在一个特别优选的实施方案中，该方法在氮或氩空气下进行，例如在比例为80∶20的N2/CO2空气下进行。也可加入能与培养基中的分子氧反应并除去它们的化学药品。例如，巯基醋酸钠能与游离氧反应，并从溶液中除去它。类似地，氨基酸半胱氨酸和含有巯基的其它化合物也能用来从培养基中清除分子氧。对于液体培养物，可以用氮使培养基起泡，以除去空气和痕量的氧，之后密封培养容器，以防止氧气再次进入。
另外，也可以用厌氧培养室排除空气中的氧。厌氧室的常见形式(如Gas Pak系统)可产生氢，它在厌氧室内作为催化剂与氧反应，产生水。该系统中也产生二氧化碳，以占据氧气转化为水所消耗的气体体积。
可以通过对培养基进行高压液相层析(HPLC)分析直接鉴定1，3-丙二醇。例如，能用0.01N硫酸的流动相以等度方式在分析离子交换柱上分析发酵培养基。此外，1，3-丙二醇也能用其它合适的分析技术鉴定，包括但不限于气相色谱法(GC)和气相色谱-质谱法(GC-MS)。
1，3-丙二醇能用本领域技术人员公知的技术从发酵培养基中纯化，包括蒸馏、离心、过滤和层析分离。例如，通过对反应混合物进行有机溶剂抽提、蒸馏和柱层析，能从细胞培养基中获得丙二醇，如美国专利号5,356,812所述，在此引用作为参考。对于这种方法，一种特别优秀的有机溶剂是环己烷，如美国专利号5,008,473所述。
此外，也能在使用吸附到或结合于载体(如纤维素)的酶和/或微生物细胞的发酵系统中产生1，3-丙二醇。结合的及这样固定的酶作为固体表面催化剂。然后使一种含有反应底物(如甘油)的溶液通过固体表面。温度、pH和氧浓度设置为最佳水平，以达到最大转化率。当希望的转化包括一个代谢步骤，例如甘油转化为1，3-丙二醇形成过程中的一种中间物，或这种中间物转化为1，3-丙二醇，这一类型的方法是特别合适的。当需要多种酶活性将初始底物转化为希望的产物时，这种方法更加复杂。该培养基一般必须包含催化所需的任何辅助因子，如酶辅因子(例如维生素B12)和还原相当物。能用上文所述的技术从发酵培养基中纯化希望的产物。当使用这些固定系统时，提供保持酶活性和使酶失活或损失减到最小的条件是重要的。当在这类固定系统中使用全细胞而不是无细胞酶时，在过程中保持微生物的生存力是重要的。使用固定细胞的该方法一般包括加入必要的生长底物。
根据本发明的方法使得甘油能被基本上化学计量地转化为1，3-丙二醇。1，3-丙二醇的产量通常为由3摩尔甘油产生2摩尔1，3-丙二醇的数量级。在本说明书中，基本上被理解为至少80％、优选地至少95％的甘油消耗。
本发明的方法和组合物产生的1，3-丙二醇在生产聚酯和薄膜中有用。例如，Whinfield和Dickson用1，3-丙二醇作为原材料合成了聚(对苯二甲酸1，3-丙二酯)(PPT)。PPT的物理性质优于一般可购得的聚酯聚(对苯二甲酸乙二酯)(PET)。例如，美国专利号5,340,909和5,872,204叙述了合成PPT的其它方法，在此引用作为参考。也能合成其它聚合物。
下列实施例是为了说明，而不是限制本发明。6实施例C.viterbiensis模式株JW/MS-vS5T的分离6.1 材料与方法6.1.1 生物来源该菌株从1997年6月从靠近意大利Viterbo的Bagnaccio泉区淡水温泉中收集的混合沉淀/水样品中分离。采样点的温度为63℃，pH为6.6-6.7。Canganella等人，J.Basic Microbiol.359-19(1995)更全面地描述了这些条件，在此引用作为参考。
6.1.2 培养基与培养用于富集、分离和培养的基础培养基按照改进Hungate技术在N2/CO2(80∶20)气相下制备，如Ljungdahl等人《工业微生物与生物技术手册》(Demain和Solomon编写，1896)所述。基础培养基含有(每升去离子水)0.5g(NH4)2SO4、0.5g NH4Cl、2.0g KH2PO4、0.04g MgCl2·6H2O、0.04g CaCl2·2H2O、4.2g NaHCO3、0.13g Na2S·9H2O、0.13g半胱氨酸-HCl、0.3g酵母提取物、0.001g刃天青、3.0g甘油、2ml维生素溶液(如Wolin等人，J.Biol.Chem.2382882-86(1963)所述)和1ml痕量元素溶液。痕量元素含有(mmol/l)2.0(NH4)2FeSO4·6H2O、1.0CoCl2·6H2O、1.0(NH4)2Ni(SO4)2·6H2O、0.1Na2MoO4·2H2O、0.1Na2WO4·2H2O、0.5ZnSO4·7H2O、0.01CuCl2·2H2O、0.5Na2SeO3、0.1H3BO3、0.5MnCl2·4H2O和0.01 AlK(SO4)2·12H2O。调节pH为6.0(25℃时)。富集物和纯培养物通常在Hungate管中的10ml培养基中在N2/CO2(80∶20)空气下生长。除非另外指出，所有温育均在60℃下进行。
6.1.3 生长的测定通过在600nm波长下测量光密度的增加测定细菌的生长(spectronic21，Bausch & Lomb，Rochester，NY)。
6.1.4 pH和温度范围为了确定生长的pH范围，用815 MP型pH计(Fisher Scientific，Pittsburg，PA)在25℃时测量pH。在pH25℃6.0的基础培养基中，用温度梯度培养箱(Scientific Industries，Inc.，Bohemia，N.Y.)在振摇(15spm)下测量生长的温度范围。
6.1.5 底物利用用补充了高压灭菌或过滤除菌的底物代替甘油的基础培养基测试生物利用不同底物的能力。培养物温育两周，通过测量光密度监测其生长。
6.1.6 电子受体在含有甘油(3g/l)作为底物的基础培养基中研究不同电子受体的可能的用途。由高压灭菌的贮存液中加入不同电子受体。基础培养基中生长的培养物用作接种物(10％ v/v)。通过测定亚硝酸盐产生(对于硝酸盐)、硫化物产生(对于硫酸盐和元素硫)或颜色改变(AQDS)监测电子受体(10mM)的利用。
6.1.7 抗生素敏感性通过向含有100g/ml过滤除菌的抗生素的新鲜基础培养基中转移指数生长的培养物测定对抗生素的敏感性。培养物温育两周。
6.1.8 显微镜检查常规检查用光学显微镜进行(PM 10AD型，Olympus Optical Co.，Ltd，东京，日本，配有相差光学装置)。透射电镜检查用100CX型电子显微镜进行(JEOL，东京，日本)。进行超薄切片的样品用乙酸双氧铀和柠檬酸铅制备，用于后染色，如Spurr，J.Ultrastruc.Res.2631-43(1969)所述。革兰氏染色用Hucker的方法进行(Doetsch，《普通微生物学方法手册》(Gerhardt等人编写，1981))。
6.1.9 分析技术甘油、葡萄糖、短链有机酸和乙醇的测定如以前Svetlitshnyi等人，Int.J.Syst.Microbiol.461131-37(1996)所述经高压液相层析(HPLC)进行。分子氢用气相色谱分析(Svetlitshnyi等人)。亚硝酸盐的产生用Boehringer Mannheim的酶分析试剂盒(目录号905608)测定。硫化物用Cord-Ruwisch，J.Microbiol.Methods 433-36(1985)的方法测定。
6.1.10 DNA的G+C含量按照使用说明书用QIAGEN基因组DNA纯化方法分离纯化DNA。酶促消化DNA，如Whitman等人，Syst.Appl.Microbiol.7235-240(1986)和Mesbah等人，Int.J.Syst.Bacteriol.39159-167(1989)所述通过HPLC分离核苷测定鸟嘌呤+胞嘧啶(G+C)含量。
6.1.11 16S rRNA基因序列测定和系统发生分析基因组DNA的提取、16S rRNA基因的PCR扩增和纯化PCR产物的测序如Rainey等人，Int.J.Syst.Bacteriol.4628-96(1996)所述进行。序列反应产物经乙醇沉淀纯化，并用310型遗传学分析仪(AppliedBiosystems，Foster City，Calif.)电泳。利用ae2编辑程序(Maidak等人，Nucleic acids Res 27171-173(1999))，将该研究中获得的16S rRNA基因序列与以前测定的可从公开数据库中获得的低G+C革兰氏阳性序列对比。PHYLIP软件包的程序包括DNADIST和NEIGHBOR，用于系统发生分析(Felsenstein(1993)，系统发生推理软件包，3.5.1版，华盛顿大学遗传学系，西雅图)。用Jukes等人在《哺乳动物蛋白质代谢》(Munro编写，1969)中的方法计算进化距离。用1000上引导数据组和PHYLIP软件包(Felsenstein，同上文)的SEQBOOT、DNADIST和CONSENSE程序再次分析树状结构。
6.1.12 核苷酸序列保藏号本研究中测定的16S rRNA基因序列由GenBank保藏为保藏号AF181848。系统发生分析中使用的参照16S rRNA基因序列的保藏号和菌株名称如下掘越氏厌氧分枝菌(Anaerobranca horikoshii)DSM9786T(U21809)、解糖热解纤维素菌(Caldicellulosiruptorsaccarolyticus)ATCC 43494T(L09178)、Caloramator coolhaasii DSM12679 AF104215、发光喜热菌(Caloramator fervidus)ATCC432045T(L09187)、印度喜热菌(Caloramator indicus)ACM3982T(X75788)、解蛋白喜热菌(Caloramator proteoclasticus)DSM10124T(X90488)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)ATCC19398T(M59085)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)ATCC13124T(M59103)、甘油穆尔氏菌(Moorella glycerini)DSM11254T(U82327)、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)LJDT(M59121)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermoautotrophica DSM 1974T(L09168)、普氏产醋杆菌(Oxobacter pfennigii)DSM 3222T(X77838)、产乙醇热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)ATCC 31550T(L09162)、、热产硫磺热厌氧杆菌(Thermoanaerobacter thermosulfurigenes) ATCC3374T(L09171)、速生热分枝菌(Thermobrachium celere)DSM 8682X99238、解脂热分枝菌(Thermosyntropho lipolytica)DSM11003T(X99980)。
6.2 结果6.2.1 富集和分离含甘油的基础培养基用大约10％(w/v)的样品接种，并在60℃下温育。另外，pH7.5和pH9.0的相同组成的培养基用样品接种(每个10％(w/v))。只有在pH6.0时才获得利用甘油的富集培养物。在之后的转移后(10％ v/v)，制备该富集培养物的稀释系列，并用软琼脂覆盖层(由含0.8％琼脂的基础培养基组成)平板接种于固体基础培养基(1.5％琼脂)上。挑取单克隆，在相同组成的液体培养基中传代培养，通过HPLC测定1，3-丙二醇的形成。为了随后的平板接种，用基础培养基及Kell等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.9981-88(1981)所述的已知成分复杂培养基重复该方法几次。当培养物在振摇下温育时，在液体培养基中的生长大大增强。在将菌落转移到振摇下的60℃液体基础培养基中后，获得甘油发酵培养物，它被认为是纯的，被命名为JW/MS-VS5T株。
6.2.2 菌落和细胞形态学在含基础培养基的平板上，在7-10天后出现菌落。一旦适应在平板上生长，随后在新鲜平板上划线在2-3天后产生菌落。菌落是均一的圆形、白色的，直径1.0-1.5mm。JW/MS-VS5T株的细胞是直的到略微弯曲的杆状，直径0.4-0.6mm，长度2.0-3.0mm。细胞主要单个存在。利用光学显微镜没有观察到运动性的迹象。利用不同生长阶段的细胞，负染后进行的电镜分析未能显示鞭毛的存在。在任何生长阶段都没有观察到孢子的出现。
6.2.3 革兰氏染色反应和革兰氏类型细胞只在指数生长早期革兰氏染色阳性。JW/MS-VS5T株的超薄切片显示厚的肽聚糖，因而认为生物是革兰氏阳性的，Wiegel，Int.J.Syst.Bacteriol.47651-56(1997)。这种定位与16S rRNA测序数据一致，后者将该生物归于梭菌属-芽孢杆菌属分支。除了肽聚糖外，还发现了另一个外层，它可能代表S层，但是EM显微照片不能显示任何几何排列。
6.2.4 温度与pH范围pH25℃ 6.0时JW/MS-VS5T株生长的温度范围为33-64℃，最适温度为58℃(
图1)。在67℃或低于33℃时不能检测到生长。该菌株在pH25 ℃为5.0-7.8时生长，最适为pH25℃6.0-6.5(图2)。在pH25℃4.7和pH25℃8.0时未检测到生长。在最适条件下的最短倍增时间为2.8小时。
6.2.5 底物利用与发酵产物利用的底物包括甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、纤维二糖、乳糖、半乳糖、甘露糖(20mM)、淀粉和酵母提取物(5g/l)。JW/MS-VS5T株不能利用木糖、阿拉伯糖、乙酸盐、乳酸盐、甲酸盐、甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、丙酸盐、丙酮、琥珀酸盐、乙二醇、1，2-丙二醇、苯酚、苯甲酸盐和H2/CO2。
如表1所示，甘油发酵产生乙酸盐和1，3-丙二醇作为唯一的有机代谢产物。没有检测到可测量的C1-C3醇、1，3-丙二醇之外的二醇或乙酸之外的有机酸。在这些培养物中产生显著含量的H2。
获得的发酵模式提示根据下列方程式的一种甘油转化3甘油 2 1，3-丙二醇+乙酸盐+CO2+H26.2.6 电子受体在甘油作为底物存在下，JW/MS-VS5T株不能还原硝酸盐(10mM)、无定形氧化Fe(III)(90mM)、9，10-蒽醌-2，6-二磺酸(AQDS)、硫酸盐(10mM)或沉淀的或升华的So(30mM)。在任何这类电子受体的存在下不能实现1，3-丙二醇的产生。在气相中使用O2(20％v/v)，JW/MS-VS5T株不能生长。
6.2.7 抗生素敏感性氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、利福平和卡那霉素在100mg/ml培养基的浓度时完全抑制生长。加入相同浓度的链霉素和四环素导致生长延迟。
6.2.8 DNA碱基组成基因组DNA的G+C含量为32mol％(HPLC)。
6.2.9 16S rRNA基因序列对比测定了含长度为1480个核苷酸的JW/MS-VS5T株的几乎全部16SrRNA基因序列。两个数据组用于系统发生分析。数据组1含有在该研究中测定的序列和从低G+C革兰氏阳性菌中选择的参照序列，而数据组2含有新的序列和可从数据库中获得的喜热菌属和热分枝菌属的5个种的序列。基于数据组1的系统发生分析(含有位点98与位点1469(大肠杆菌位点，Brosius等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 754801-4805(1978))之间的1206个确定的核苷酸)显示新的分离株聚簇为以前所述的喜热菌属和热分枝菌属辐射内的不同谱系(图3)。JW/MS-VS5T株与以前所述的喜热菌属和热分枝菌属的种有91.7％-94.1％的16S rRNA基因序列相似性，与数据组1所含且图3所示的其它分类群的序列有83.4％-87.1％的相似性。第二个数据组含有新分离株的序列和喜热菌属和热分枝菌属的其它5个种的序列，并含有位点38与位点1469(大肠杆菌位点，Brosius等人，同上文)之间的1393个确定的核苷酸，用它来计算该簇的分类组之间的成对相似性值。JW/MS-VS5株与以前所述分类组之间的16S rRNA基因序列相似性为91.3-93.7％。在喜热菌属/热分枝菌属簇内，在JW/MS-VS5株与速生热分枝菌之间发现最高的序列相似性值(93.7％)。图5所示的对这些分支的引导分析明显地支持喜热菌属/热分枝菌属簇，以及该组与Collins等人，Int.J.Swiss P.Bacteriol.44812-826(1994)所述梭菌属簇I的关系。
根据系统发生分析(图3)显然，该菌株与速生热分枝菌和3个喜热菌属的种最相关，它们构成了系统发生树的革兰氏阳性芽孢杆菌-梭菌分支内的不同簇。这4个种是显示低G+C含量的嗜热、化能有机营养厌氧菌，这也适用于JW/MS-VS5T株。表2显示了该簇中所见5个种的形态学和生理性质的对比。
表1.JW/MS-VS5T株的甘油发酵底物 形成的产物[mM] 碳回收率[％]消耗的甘油[mM]1，3-丙二醇 乙酸盐 H216.2 11.2 4.8 6.5 99用于在基础培养基中培养JW/MS-VS5T株的甘油的初始浓度为33mM。
表2.本研究中使用的菌株的选择特性JW/MS-VS5T，速生热分枝菌，和喜热菌属的种发光喜热菌、印度喜热菌和解蛋白喜热菌。
特性菌株 孢子 温度范围 最适温 最适甘油 最短倍增 G+C含量形成 度 pH 利用时间(h) [mol％]JW/MS-VS5T-≥33-≤6458 6.0-6.5 + 2.80 32速生热分枝菌*-＞(37-45)- 62-67 8.0-8.5 - 0.17 30-31＜(70-80)印度喜热菌- ＞37-＜8060-65 8.1 NR 0.33 25发光喜热菌+ ＞37-＜8068 7.0-7.5 NR 0.75 39解蛋白喜热菌 + ≤30-＜6855 7.0-7.5 NR 0.50 31NR未报道*不同菌株7 实施例JW/MS-VS5T中dhaB样基因的检测7.1 材料与方法用肺炎克雷伯氏菌dhaB基因作为阳性对照通过PCR方法表征JW/MS-VS5T。使用4组引物(a)dhaB1，包括dhaB15’GGA ATT CAGATC TCA GCA ATG AAA AGA TCA AAA CG(SEQ ID NO1)和dhaB13’GCT CTA GAT TAT TCA ATG GTG TCG GG(SEQ IDNO2)；(b)dhaB2，包括dhaB25’GGA ATA CAG ATC TCA GCA ATGCAA CAG ACA ACC C(SEQ ID NO3)和dhaB23’GCT CTA GATCAC TCC CTT ACT AAG TCG(SEQ ID NO4)；(c)dhaB3，包括dhaB35’GGA ATT CAG ATC TCA GCA ATG AGC GAG AAA ACCATG C(SEQ ID NO5)和dhaB33’GCT CTA GAT TAG CTT CCT TTACGC AGC(SEQ ID NO6)；和(d)dhaX，包括dhaX5’AGG TGG TGCGGA TCC TGT CGA ATC CCT A(SEQ ID NO7)和dhaX3’GAT ACGAGA TCT TTA ATT CGC CTG ACC GGC CAG TAG CAG(SEQ IDNO8)。所有引物均购自GIBCO BRL。PCR反应在Hot Start PCR管(Molecular Bio-Products，Inc.)中进行，使用100μl PCR反应试剂。每100μl PCR反应液含有2μl细菌培养物，20μl 1mM dNTPs，10μl10×PCR缓冲液(100mM KCl，100mM(NH4)2SO4，200mMTris-Cl(pH8.75)，20mM MgSO4，1％Triton，1mg/ml BSA)-[Stratagene，La Jolla，CA]，3μl每2条相对引物组(10 OD/μl)，和1μl Pfu DNA聚合酶(2.5U/μl)-[Stratagene，La Jolla，CA]。在自动热微循环仪(MJ Research)中在3种不同退火温度下进行PCR扩增以检测最佳条件。最终条件如下最初5个循环的变性(94℃，1.5mm.)、低严格性退火(37℃，1.5mm.)和延伸(72℃，2.5mm.)。在最初的循环后，在较高退火严格性下进行另25个循环变性(94℃，1.5mm.)、退火(55℃，1.5mm.)和延伸(72℃，2.5mm.)。向每个样品中加入10μl 10×DNA加样染料，在琼脂糖凝胶上电泳15μl每种PCR产物。
7.2 结果阳性对照如所料的产生合适的带。未知微生物显示与dhaB1和dhab3相同大小但与dhaB2和dhaX大小不同的模糊的DNA带。模糊的带可能是由于PCR引物与靶基因的低同源性。这些结果表明，JW/MS-VS5T可能携带一种dhaB样基因，它与肺炎克雷伯氏菌中的dhaB具有相同或相似的功能。8 实施例JW/MS-VS5T甘油脱水酶活性的体外测定检测甲苯处理的JW/MS-VS5T株细胞将甘油转化为3-羟基丙醛(3-HPA)和将1，2-丙二醇转化为丙醛的能力。
8.1 材料与方法细胞在补充有0.5g/l酵母提取物和3g/l甘油的矿物盐培养基pH6.8中60℃厌氧生长。厌氧收获细胞，在液氮中-70℃贮存。
融解冷冻的细胞，在手套箱中在厌氧条件下用甲苯处理。甲苯处理包括下列步骤(a)用1ml 50mM KPO4pH8.0洗涤细胞；(b)在Eppendorf5415C离心机中以14000转/分离心细胞6分钟；(c)用1.5ml 50mM KPO4pH8.0洗涤细胞；(d)再次在Eppendorf 5415C离心机中以14000转/分离心细胞6分钟；(e)用2ml 50mM KPO4pH8.0再溶解细胞；(f)加入20μl甲苯；(g)剧烈振荡15分钟；(h)在Eppendorf 5415C离心机中以14000转/分离心细胞10分钟；(i)用2ml 50mM KPO4pH8.0洗涤细胞；(j)在Eppendorf 5415C离心机中以14000转/分离心细胞6分钟；(k)重复步骤(i)和(j)；(l)用50mM KPO4pH8.0再溶解甲苯处理的细胞；(m)在600nm下测量溶解的细胞的吸光度；(n)细胞贮存在-70℃下。
反应混合物含有(1.0ml)15mM KPO4，pH8.0；0.25M KCl；200mM甘油或1，2-丙二醇；甲苯处理的细胞，0.38OD600；和12μM辅酶B12。反应物在60℃下厌氧温育，在图4所示的时间取样。向50μl甲苄基噻唑啉酮腙(MBTH)溶液(6mg/ml于375mM甘氨酸-HCl pH2.7中)中加入100μl样品，100℃加热3分钟，在冰上冷却30秒，通过以14000转/分离心5分钟澄清。
然后通过用如下C8-反相HPLC系统检测产物分析澄清的上清液(a)柱子是15×4.6cm Supelco，Supelcosil LC-8-DB，3μM颗粒大小；(b)溶剂A是0.1％TFA；(c)溶剂B是90％乙腈，0.08％TFA；(d)梯度是(时间[分钟]/％B)0/0，7/45，17/65，22/100，24/100，25/0，30/0；(e)排出体积是20μl；(f)注射器牵拉速度是833.3μl/分钟；(g)在305nm下检测，以500nm为参照；(h)样品波长的带宽是4，参照波长的带宽是80。利用该系统，3-HPA的滞留时间是8.7分钟，丙醛为10.7分钟。
8.2 结果图4显示了60℃时甘油转化为3-HPA和1，2-丙二醇转化为丙醛的时程。结果表明，甘油脱水酶在60℃(生物的生长温度)时有活性。该酶被甘油但不被1，2-丙二醇灭活。文献中报道了其它甘油脱水酶的类似的灭活。然而，来自克雷伯氏菌属的甘油脱水酶在60℃时无活性。实际上，未报道甘油脱水酶在60℃时有活性。9 生物保藏物和序列表简述C.viterbiensis模式株JW/MS-VS5T在1999年8月27日按照国际专利程序微生物保藏物识别的布达佩斯条约的条款由ATCC保藏，命名为ATCC PTA-584。“ATCC”是指位于12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 U.S.A的美国典型培养物保藏中心国际保藏所。命名是指保藏物的保藏号。
JW/MS-VS5T株的16S rDNA序列在Genbank数据库中保藏为保藏号AF181848。
等同前面所述说明书足以使本领域技术人员实施本发明。实际上，对于分子生物学、生物技术或相关领域技术人员明显的实施本发明的上述方法的许多修改也在下列权利要求书的范围之内。
权利要求
1.在嗜热生物中将甘油转化为1，3-丙二醇的一种方法，该方法包括提供一种可将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热生物；和在可产生1，3-丙二醇的条件下培养该嗜热生物。
2.权利要求1的方法，其还包括收集嗜热生物产生的1，3-丙二醇的步骤。
3.权利要求2的方法，其还包括将1，3-丙二醇聚合为聚合物的步骤。
4.权利要求3的方法，其中该聚合物是聚(对苯二甲酸1，3-丙二醇酯)(PPT)。
5.权利要求1的方法，其中嗜热生物是Caloramator viterbiensis。
6.权利要求5的方法，其中嗜热生物来源于保藏为ATCC号PTA-584的生物。
7.一种由甘油生产1，3-丙二醇的方法，该方法包括将甘油与一种热稳定脱水酶温育，从而将甘油转化为3-羟基丙醛；和加入能将3-羟基丙醛还原为1，3-丙二醇的还原剂。
8.权利要求7的方法，其中3-羟基丙醛还原为1，3-丙二醇由热稳定的1，3-丙二醇氧化还原酶催化。
9.权利要求7或8的方法，其还包括收集1，3-丙二醇的步骤。
10.权利要求9的方法，其还包括将1，3-丙二醇聚合为聚合物的步骤。
11.权利要求10的方法，其中该聚合物是聚(对苯二甲酸1，3-丙二醇酯)(PPT)。
12.权利要求8的方法，其中热稳定的脱水酶来源于一种嗜热生物。
13.权利要求12的方法，其中该嗜热生物是Caloramatorviterbiensis。
14.权利要求12的方法，其中该嗜热生物来源于保藏为ATCC号PTA-584的生物。
15.一种来源于C.viterbiensis的分离的热稳定甘油发酵酶。
16.一种分离的热稳定甘油发酵酶，其来源于保藏为ATCC号PTA-584的生物。
17.一种分离的热稳定甘油发酵酶，它与来源于C.viterbiensis的热稳定甘油发酵酶同源。
18.权利要求11、12或13的分离的热稳定甘油发酵酶，它是一种脱水酶。
19.权利要求18的酶，它是甘油脱水酶。
20.权利要求15、16或17的酶，它是1，3-丙二醇氧化还原酶。
21.一种分离的Caloramator viterbiensis培养物或细胞。
22.权利要求21的分离的培养物或细胞，其中培养物或细胞的基因组与保藏为ATCC号PTA-584的生物的基因组至少95％相同。
23.权利要求21的分离的培养物或细胞，其中培养物或细胞的基因组与保藏为ATCC号PTA-584的生物的基因组至少99％相同。
24.权利要求21的分离的培养物或细胞，其中培养物或细胞的16SrDNA与保藏为ATCC号PTA-584的生物的16S rDNA至少95％相同。
25.权利要求21的分离的培养物或细胞，其中培养物或细胞的16SrDNA与保藏为ATCC号PTA-584的生物的16S rDNA至少99％相同。
26.权利要求21的分离的培养物或细胞，它是保藏为ATCC号PTA-584的生物的后代。
27.一种克隆编码热稳定甘油发酵酶的多核苷酸序列的方法，该方法包括将与已知甘油发酵酶基因一部分同源的多核苷酸探针与来自怀疑含有嗜热生物的环境样品的多核苷酸分子杂交；和分离与该多核苷酸探针结合的多核苷酸序列。
28.权利要求27的方法，其中用第二个多核苷酸探针以聚合酶链反应扩增与该多核苷酸探针结合的多核苷酸序列。
29.权利要求27或28的方法，其中热稳定甘油发酵酶来源于确定可将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热生物。
30.权利要求29的方法，其中该嗜热生物是Caloramatorviterbiensis。
31.权利要求30的方法，其中多核苷酸探针与已知dhaB基因的一部分同源。
32.权利要求31的方法，其中dhaB基因来自克雷伯氏菌属。
33.权利要求29的方法，其中至少一种多核苷酸探针选自SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。
34.权利要求33的方法，其中该多核苷酸探针和第二种多核苷酸探针是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
35.权利要求33的方法，其中该多核苷酸探针和第二种多核苷酸探针是SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。
36.一种克隆编码热稳定甘油发酵酶的多核苷酸序列的方法，该方法包括用来自一种嗜热生物的DNA转化不能在甘油上厌氧生长的靶生物；和通过在甘油上厌氧生长，鉴定转化的靶生物，其含有编码可将甘油转化为1，3-丙二醇的酶的多核苷酸序列。
37.权利要求36的方法，其中热稳定甘油发酵酶来源于确定为可将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热生物。
38.权利要求37的方法，其中该嗜热生物是Caloramatorviterbiensis。
39.权利要求38的方法，其中Caloramator viterbiensis来源于保藏为ATCC号PTA-584的生物。
40.一种分离可催化甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热生物的方法，该方法包括在含有甘油作为主要碳源的培养基中温育含有嗜热生物的样品；和分离至少一种可将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热生物。
41.权利要求40的方法，其中在约40℃-约100℃的温度下温育样品。
42.权利要求40的方法，其中在厌氧条件下温育样品。
43.权利要求40的方法，其中样品从温度约为50℃-约100℃的自然来源获得。
44.权利要求40的方法，其还包括检测嗜热生物产生1，3-丙二醇的步骤。
45.权利要求40的方法，其还包括确定嗜热生物产生乙酸盐的步骤。
全文摘要
本发明涉及生产1,3－丙二醇的改进的方法和试剂。更具体而言,本发明提供能催化甘油发酵为1,3－丙二醇的新型嗜热生物和热稳定酶。本发明也涉及分离这些嗜热生物的方法,克隆编码这些酶的多核苷酸的方法,编码这些酶的多核苷酸,和利用这些酶和生物生产1,3－丙二醇的方法。
文档编号C12N9/02GK1382219SQ00814743
公开日2002年11月27日 申请日期2000年9月22日 优先权日1999年9月24日
发明者M·瑟费尔德, J·维戈尔, G·怀特狄 申请人:金克克国际有限公司, 佐治亚州大学研究基金会