专利名称：一种非水相酶法制备甘油磷酸胆碱(gpc)原料的工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物法制备甘油磷酸胆碱技术领域，具体涉及一种利用能够水解卵磷脂中两条脂肪酸链的磷脂酶从而在非水相的体系中催化酯链的断裂来制备GPC的方法。
背景技术：
甘油磷酸胆碱(GPC)是机体内磷脂代谢的产物之一。在体内，GPC最重要的生理 功能在于穿过血脑屏障，为乙酰胆碱和磷脂酰胆碱(PC)的生物合成提供必要的胆碱。乙酰胆碱是中枢神经系统中重要的神经传递介质，帮助脑部完成学习、记忆和认知活动，且能控制浅睡眠和肌动活动，甚至可以修复早期老年失智症患者已部分受损的认知能力。增加体内磷脂酰胆碱的合成数量，有助于抵抗年龄增长而引起的细胞膜受损和末梢神经功能的衰 退。良好的乙酰胆碱和磷脂水平有助于脑血管的健康。GPC对于脑部中风、颅与脑部损伤患者的康复、青少年身体成长、提高记忆力等方面也具有一定的功效。此外，GPC也是合成特殊磷脂的很好中间体。甘油磷酸胆碱(GPC)属于磷脂酰胆碱类，国外已将GPC作为一种治疗痴呆症的药物用于临床，同时在保健品市场上，50%含量的GPC产品也已经面世，售价13. 99美元/500mg。在国内，GPC类药物还处于研发阶段，没有进入工业生产。纯净的GPC呈白色粉末状或无色透明粘稠状，极性较强，能溶于水、甲醇、乙醇等极性溶剂，不溶于乙酸乙酯、正己烷。目前化学法制备GPC已进行过较多的研究，且得率较高，但化学法制备方法存在一些缺点，如反应条件难控制，所需试剂价格昂贵，环境污染较大等。而酶法反应所用物质毒性较小，具有高度专一性，反应条件较温和，适合药物的工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非水相酶法制备甘油磷酸胆碱(GPC)原料的工艺，该工艺选择合适的反应体系，以适合磷脂酶在界面反应的本质特征以及使底物达到最大的溶解性，然后在该反应体系中用磷脂酶催化卵磷脂甘油骨架上两条脂肪酸链的断裂，生成所需产物GPC。本发明的非水相酶法制备甘油磷酸胆碱(GPC)原料的工艺，采用下述步骤取卵磷脂溶解于庚烷溶剂，再向其中滴加含有磷脂酶Al和醋酸/醋酸盐缓冲液的含酶溶液，并将其置于3(T6(TC下恒温搅拌反应2飞h，取出反应液，加入萃取剂进行萃取，萃取后，取水相浓缩、烘干，即得GPC产品；所述卵磷脂中磷脂酰胆碱的含量不低于50% ;所述萃取剂为CH3OH和蒸馏水的混合溶剂。其中，优选地,所述卵磷脂(g):庚烧溶剂(ml):含酶溶液(ml) =1 : 8^8. 5 :O. 2、. 6，更优选地，所述卵磷脂(g):庚烷溶剂(ml):含酶溶液(ml)=l : 8.2 : 0.5。所述含酶溶液中磷脂酶Al与醋酸/醋酸盐缓冲液的体积比优选为1:0.5 5，更优选地，所述含酶溶液中磷脂酶Al与醋酸/醋酸盐缓冲液的体积比为1:4。所述醋酸/醋酸盐缓冲液的pH值可以为3·0、3·5、4·0、5·0等，优选pH为5.0。所述反应在40°C下恒温搅拌4h为佳。所述萃取剂中CH3OH和蒸馏水的体积比优选为I: f 3，更优选为1:1.5。所述萃取剂的量为反应液体积的1 4倍。本发明中，磷脂酶催化磷脂酰胆碱反应生成GPC和脂肪酸(FA)，只利用单一的酶通过酰基转移异构化就能使卵磷脂甘油骨架上的2条酯酰基水解，避免使用双酶催化，节约了成本。磷脂酶催化水解磷脂是一个界面反应，反应界面的大小直接影响到反应速度和水解程度。磷脂酶法改性可以分为有机相反应体系和水相反应体系两类。有机溶剂的存在改善了反应体系的粘度和分散性，加速反应进行。磷脂酶可从一种微生物源(如米曲霉)中离析获得。对于工业目的，由微生物中提取然后浓集的磷脂酶有出售。本发明所选的磷脂 酶是一种羧酸酯水解酶，它具有既对磷脂结构又对三甘油酯结构的固有活力，因此同时具有脂肪酶活性和磷脂酶活性，但是在一定的反应体系中，会优先表现出一种特定的酶活。该磷脂酶是一类催化磷脂sn-Ι位酰基水解的酶族，反应生成GPC和脂肪酸(FA)。磷脂酶催化水解磷脂是一个界面反应，反应界面的大小直接影响到反应速度和水解程度。它是一种羧酸酯水解酶，它具有既对磷脂结构又对三甘油酯结构的固有活力，因此同时具有脂肪酶活性和磷脂酶活性，但是在一定的反应体系中，磷脂酶会优先表现出一种特定的酶活。本发明中，磷脂酶对甘油骨架Sn-I位具有水解活性，反应生成的Sn-I-LPC (失去Sn-I位脂肪酸链的溶血磷脂酰胆碱)在一定的反应体系中极不稳定，迅速通过酰基转移发生异构化为Sn-2-LPC，生成的Sn-2-LPC被进一步水解生成GPC. Imol卵磷脂经酶催化反应生成2mol脂肪酸和ImolGPC.反应方程式为PC+H20 — GPC+FA。本发明的反应体系中主体试剂是庚烷，非水相生物催化介质体系包括水-表面活性剂-有机溶剂组成的低水含量的油包水(W/0)微乳液反胶束系统；反胶束是表面活性剂溶解于非极性溶液中形成一个围绕极性核的纳米聚集体，为一种低水含量的油包水微乳液。极性核中的水不同于普通水，其黏度较高，酸性和极性比普通水低，其中的水可以溶解原本不溶的物质。在反胶束体系中，酶在w/o界面起催化作用，在该体系形成过程中，界面张力起着重要的作用，而表面活性剂的存在可以使w/o界面张力下降，这样更有利于酶在界面上的催化效率。表面活性剂卵磷脂也是该反应的底物，这就避免了因引入新的表面活性剂而增加反应液的纯化困难。同时卵磷脂亲脂性较强，在有机相中能充分溶解，所以该体系增加了底物的溶解性能，使反应过程中的传质阻力减小，更有利于反应的进行。而酶被包裹在微乳的“水池”中，既保证了酶催化反应的必须水，又减少了有机溶剂对酶活性的影响；卵磷脂作为反应的底物，随着反应的进行，底物不断被消耗，到一定时间不足以维持反胶束体系，反应结束后，反应体系已破坏,反应生成的目标产物GPC是强极性物质，水溶性强。如果直接向反应液中加水，理论上会与原反应液的有机试剂分层，那么亲脂性物质就会进入有机相，而GPC进入水相，通过分液漏斗就可将GPC与亲脂性物质分离，但由于反应液还存在未反应的底物卵磷脂，它是表面活性剂，在萃取过程可能导致乳化，所以不能保证每次萃取都会分层，重现性不好，本发明采取的萃取剂为CH3OH与H2O,充分振荡，其中目的产物GPC在下层中。本发明提出了一种非水相酶法制备甘油磷酸胆碱(GPC)原料的工艺，该工艺选择了合适的反应体系，以适合磷脂酶在界面反应的本质特征以及使底物达到最大的溶解性，然后在该反应体系中用磷脂酶催化卵磷脂甘油骨架上两条脂肪酸链的断裂，反应液经有机溶剂萃取等分离纯化过程，可制备得到较高产量和纯度的产物GPC。本发明从根本上改变了国内现有的GPC的生产工艺，以温和的条件高效地制备出了品质优良的产物GPC。
附图为本发明所得GPC经HPLC-ELSD检测的色谱图。
具体实施例方式实施例I
取5g大豆卵磷脂(PC50)超声溶解于41ml庚烷溶剂，再向其中滴加含有2. 5ml磷脂酶Al和IOml pH5. O的醋酸/醋酸钠缓冲液的含酶溶液，并将其置于40°C下恒温搅拌反应4h，取出反应液，再取与反应液等体积的萃取剂即CH3OH和蒸馏水的混合溶剂进行萃取(萃取剂中CH3OH和蒸馏水体积比1:1. 5)，取下层水相浓缩、烘干，即得GPC产品；反应液经萃取初步纯化后得到的GPC粗品可用TLC法进行定性分析检测选择展开剂为二氯甲烷甲醇 三乙胺=35:60: 5，样品经点样展开后，通过与GPC标准品对照，计算其Rf值为O. 28。同时，样品HPLC分析结果为GPC的出峰时间为7. 482min,相对含量为58%，如附图所示；分析条件为固定相为C18柱；流动相为5%的甲醇；检测器为蒸发光散射检测器(ELSD);流速为
O.5ml/min ;检测器温度110°C。样品在进样前需用膜过滤，以防堵塞色谱柱。实施例2
取5g蛋黄卵磷脂(PC70)超声溶解于41ml庚烷溶剂，再向其中滴加含有2. 5ml磷脂酶Al和5ml pH4. O的醋酸/醋酸钠缓冲液的含酶溶液，并将其置于40°C下恒温搅拌反应4h，取出反应液，再取与反应液等体积的萃取剂即CH3OH和蒸馏水的混合溶剂进行萃取(萃取剂中CH3OH和蒸馏水体积比1:1.5)，萃取后，取水相浓缩、烘干，即得GPC产品；反应液经萃取初步纯化后得到的GPC粗品可用TLC法进行定性分析检测。首先选择合适的展开剂，使样品中GPC和杂质在薄层板上能有效分开，经过摸索，最后确定展开剂为二氯甲烷甲醇三乙胺=35:60:5。样品经点样展开后，通过与GPC标准品对照，计算其Rf值为O. 28。同时，样品HPLC分析结果为GPC的出峰时间为7. 482min,相对含量为56% ;分析条件为固定相为C18柱；流动相为5%的甲醇；检测器为蒸发光散射检测器(ELSD);流速为O. 5ml/min ;检测器温度110°C。样品在进样前需用膜过滤，以防堵塞色谱柱。实施例3
取5g大豆卵磷脂(PC70)超声溶解于41ml庚烷溶剂，再向其中滴加含有2. 5ml磷脂酶Al和5ml pH4. O的醋酸/醋酸钠缓冲液的含酶溶液，并将其置于40°C下恒温搅拌反应4h，取出反应液，再取反应液体积3倍的萃取剂即CH3OH和蒸馏水的混合溶剂进行萃取(萃取剂中CH3OH和蒸馏水体积比1:1.5)，萃取后，取水相浓缩、烘干，即得GPC产品；反应液经萃取初步纯化后得到的GPC粗品可用TLC法进行定性分析检测。首先选择合适的展开剂，使样品中GPC和杂质在薄层板上能有效分开，经过摸索，最后确定展开剂为二氯甲烷甲醇三乙胺=35:60:5。样品经点样展开后，通过与GPC标准品对照，计算其Rf值为O. 28。同时，样品HPLC分析结果为GPC的出峰时间为7. 482min,相对含量为56% ;分析条件为固定相为C18柱；流动相为5%的 甲醇；检测器为蒸发光散射检测器(ELSD);流速为O. 5ml/min ;检测器温度110°C。样品在进样前需用膜过滤，以防堵塞色谱柱。
权利要求
1.一种非水相酶法制备甘油磷酸胆碱(GPC)原料的工艺，其特征在于采用下述步骤取卵磷脂溶解于庚烷溶剂，再向其中滴加含有磷脂酶Al和醋酸/醋酸盐缓冲液的含酶溶液，并将其置于3(T60°C下恒温搅拌反应2飞h，取出反应液，加入萃取剂进行萃取，萃取后，取水相通过旋转蒸发仪浓缩、烘干，即得GPC产品；所述卵磷脂中磷脂酰胆碱的含量不低于50% ;所述萃取剂为CH3 OH和蒸馏水的混合溶剂。
2.如权利要求I所述的非水相酶法制备甘油磷酸胆碱(GPC)原料的工艺，其特征在于所述卵磷脂(g):庚烷溶剂(ml):含酶溶液(ml)=l : 8^8.5 : O. 2 0. 6。
3.如权利要求2所述的非水相酶法制备甘油磷酸胆碱(GPC)原料的工艺，其特征在于所述卵磷脂(g):庚烷溶剂(ml):含酶溶液(ml)=l : 8.2 : 0.5。
4.如权利要求2所述的非水相酶法制备甘油磷酸胆碱(GPC)原料的工艺，其特征在于所述含酶溶液中磷脂酶Al与醋酸/醋酸盐缓冲液的体积比为1:0. 5 5。
5.如权利要求4所述的非水相酶法制备甘油磷酸胆碱(GPC)原料的工艺，其特征在于所述含酶溶液中磷脂酶Al与醋酸/醋酸盐缓冲液的体积比为1:4。
6.如权利要求I所述的非水相酶法制备甘油磷酸胆碱(GPC)原料的工艺，其特征在于所述醋酸/醋酸盐缓冲液的pH为5. O。
7.如权利要求I所述的非水相酶法制备甘油磷酸胆碱(GPC)原料的工艺，其特征在于所述反应在40°C下恒温搅拌4h。
8.如权利要求I所述的非水相酶法制备甘油磷酸胆碱(GPC)原料的工艺，其特征在于所述萃取剂中CH3OH和蒸馏水的体积比为1:广3。
9.如权利要求8所述的非水相酶法制备甘油磷酸胆碱(GPC)原料的工艺，其特征在于所述萃取剂中CH3OH和蒸馏水的体积比为1:1.5。
10.如权利要求I所述的非水相酶法制备甘油磷酸胆碱(GPC)原料的工艺，其特征在于所述萃取剂的量为反应液体积的Γ4倍。
全文摘要
本发明公开了一种非水相酶法制备甘油磷酸胆碱(GPC)原料的工艺，其采用步骤为取卵磷脂溶解于庚烷溶剂，再向其中滴加含有磷脂酶A1和醋酸/醋酸盐缓冲液的含酶溶液，并将其置于30~60℃下恒温反应，反应液进行萃取后，取水相浓缩、烘干，即得GPC产品；所述卵磷脂中磷脂酰胆碱的含量不低于50%；所述萃取剂为CH3OH和蒸馏水的混合溶剂。本发明提出了一种非水相酶法制备甘油磷酸胆碱(GPC)原料的工艺，该工艺选择了合适的反应体系，可制备得到较高产量和纯度的产物GPC，从根本上改变了国内现有的GPC的生产工艺，以温和的条件高效地制备出了品质优良的产物GPC。
文档编号C12P13/00GK102757989SQ20111010316
公开日2012年10月31日 申请日期2011年4月25日 优先权日2011年4月25日
发明者张洪斌, 曹明成, 毛慧芳 申请人:合肥工业大学, 曹明成