Pc-o 42:4-一种用于内脏脂肪过多的生物标志物的制作方法
【专利摘要】本发明总体上涉及生物标志物领域。具体而言，本发明涉及生物标志物如PC-O 42:4，其可例如用于检测和/或定量内脏脂肪过多和/或内脏脂肪过多的变化。该生物标志物也可以用于诊断受试者生活方式的改变对内脏脂肪过多的影响。
【专利说明】PC-ο42:4 一一种用于内脏脂肪过多的生物标志物
[0001] 本发明总体上涉及生物标志物领域。具体而言，本发明涉及生物标志物如1-0-烷 基-2-酰基甘油磷酸胆碱（PC-0)42:4,其可例如用于检测和/或定量内脏脂肪过多(visceraladiposity)和/或内脏脂肪过多的变化。这种生物标志物也可用于诊断受试者 生活方式的改变对内脏脂肪过多的影响。
[0002] 过重和肥胖蔓延的持续攀升，尤其在儿童中的持续攀升使得解读它们相关的基因 组和代谢组表型变成最大的公共健康挑战之一。虽然营养不良和肥胖，如由身体质量指数 (BMI)定义的营养不良和肥胖，对预期寿命具有实质的警示，但是显然BMI在评估身体组成 方面具有相当大的局限性并且对于评估疾病风险缺乏灵敏性（Dulloo,A.G.等人（2010) Int.J.Obes. (Lond) 34Suppl2,S4-17。Dullo等人最近综述了与身体组成表型相关的健康 风险的概念的最新进展，包括（i)将BMI分割成脂肪质量（FM)指数（FM/H2)和无脂肪质量 (FFM)指数（FFM/H2)，（ii)将FFM分割成器官质量和骨骼肌质量，（iii)将FM分割成有害 脂肪和保护性脂肪，和（iv)在构成瘦体重质量的器官/组织的内部或者周围的脂肪组织扩 展和异位脂肪沉着之间的相互作用（Dulloo，A.G.等人（2010)Int.J.Obes. (Lond) 34Suppl 2,S4-17)。
[0003] 在过去的数十年间，使用本领域技术的许多研究已经鉴定了与脂肪贮存和肥胖相 关的基因和转录因子（Viguerie，N.等人（2005)Diabetologia48,123-131 ;Viguerie， Ν·等人（2005)Biochimie87，117-123;Sorensen，T.I.等人（2006)PLoS.Clin.Trials1， el2 ;Klannemark，M.等人（1998)Diabetologia41,1516-1522 ;Clement，K.等人（2007) J.Intern.Med. 262,422-430)，与基因可遗传性相关的基因和转录因子（Teran-Garcia， Μ·等人（2007)Appl.PhysiolNutr.Metab32,89-114)，并且已经提出人肠道微生物群对 肥胖发生率的影响（Backhed，F.等人（2007)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A104,979-984; Ley,R.等人（2006)Nature444,1022-1023 ;Turnbaugh，P.等人（2006)Nature444， 1027-1031)。
[0004] 但是，在相似的致肥环境和致糖尿病环境下，许多个体仍保持代谢健康和抵抗肥 胖相关的心血管疾病（CVD)风险。除了意识到与肥胖相关的疾病风险可能不是一律相同的 之外（Wildman，R.P.等人（2008)Arch.Intern.Med. 168,1617-1624)，越来越多数量的具有 正常体重的个体（身体质量指数，BMK25)表现出以前认为是过重和肥胖状态特有的心代 谢异常。最近的证据表明了区域特异的（regio-specific)身体组成如何可能决定针对代谢 疾病的个体素质，其中身体脂肪和特别地内脏脂肪分布与心代谢疾病、糖尿病、高血压、非 酒精的脂肪肝疾病和致死性的增加的风险相关。
[0005] 临床上使用腰和臀测量监测内脏脂肪过多（例如，男人>0.9 ;和女人>0.85)，但是 这具有类似的局限性，尤其是在肥胖群体中。金标准成像技术，包括磁共振成像（MRI)和计 算机断层扫描（CT)，现在对内脏脂肪库产生了区域特异的和高精确的定量。但是，由于缺乏 非侵入性的、快速和可靠的生物标志物能用于流行病学研究和由于常规分析方法不适用于 代谢的整体分析的局限性，评估与内脏脂肪相关的代谢仍然特别具有挑战性。
[0006] 过多的脂肪贮存在躯干部或男性样的区域可能在代谢上比脂肪贮存在女性样的 区域（gynoidarea)更不健康，其中胰岛素抗性作为一个关键的原因机制。因此，患者层次 化对于个性化营养和治疗管理是必须的，但是当受试者具有相似的腰臀比和获得成像设施 受限时，这个应用受到了挑战。因此，迫切需要允许以简单和可靠的方式评估内脏脂肪的存 在、与内脏脂肪相关的代谢和/或其中的变化的生物标志物。
[0007] 本发明人致力于这种需要。
[0008] 因此，本发明的目的是改良现有技术并提供满足本发明目的的和/或允许克服至 少一个当前现有技术的缺点的生物标志物。
[0009] 为了鉴定合适的生物标志物，发明人使用了代谢组学方法。
[0010] 当前认为代谢组学是表征代谢表型的一个已很好建立的体系方法，其包含多种因 素如环境、药物、膳食、生活方式、遗传学和微生物组因素的影响。不像表明生理学变化的潜 在可能性的基因表达和蛋白质组学数据，细胞、组织和器官内的代谢物和它们的动力学浓 度变化代表生理学调节进程的真正终点。
[0011] 近年来，基于代谢组学和脂类组学的发现加速了我们对疾病进程的理解，并且将 为防止和营养管理与代谢综合征相关的亚临床疾病提供新的途经。
[0012] 本发明人旨在提供区域特异的身体组成的综合的代谢表型：内脏脂肪过多。这允 许鉴定内脏脂肪过多特异的生物标志物。
[0013] 在本研究中，于40个健康肥胖女人的组中使用多个代谢终点的测量值和使用双 能X线吸收测量法（DXA)体内定量身体组成和使用计算机断层扫描（CT)的腹部脂肪分布 研究了与内脏脂肪过多相关的代谢。
[0014] 使用质子核磁共振（1HNMR)光谱学和等离子体的靶向LC-MS/MS谱和随时间的进 行而收集的24小时尿样本，发明人在具有不同内脏脂肪沉着模式的这组充分定义的肥胖 组中鉴定了内脏脂肪分布的新的代谢生物标志物。
[0015] 由此，发明人已经鉴定了新的生物标志物PC-O42:4.
[0016]PC-O是1-0-烷基-2-酰基甘油磷酸胆碱。
[0017] 对各脂质种类注解如下：[脂质类型][碳原子总数]:[双键总数]。例如，PC34:1 反映包含34个碳原子和1个双键的磷脂酰胆碱种类。
[0018]PC-O42:4因此是I-O-烧基醜基甘油憐酸胆喊42:4.
[0019] 发明人还发现PC-O42:4可以用作生物标志物来检测和/或定量内脏脂肪过多和 /或内脏脂肪过多的变化。这种诊断方法在人或动物体的体外实施。
[0020] 生物标志物的这种检测和/或定量可以在体液中实施。体液可以是例如血液，血 浆，血清或尿。
[0021] 一般地，于事先获自待测试的受试者的体液样本实施生物标志物的检测和/或定 量步骤。
[0022] 内脏脂肪也已知称为腹部脂肪，器官脂肪或腹内脂肪，并且定位于腹腔内部器官 之间中。
[0023] 内脏脂肪可以包含几种脂肪库（adiposedepot)，包括肠系膜库、附睾白色脂肪组 织（EWAT)和肾周库，以及心外膜脂肪组织和围绕肝和胃的脂肪。一般地，腹中的脂肪主要 是内脏脂肪，通常导致出名的"啤酒肚"。
[0024] 过多的内脏脂肪导致中心肥胖，其随后例如与心血管疾病、2型糖尿病、胰岛素抗 性或炎性疾病相关。这些是与过多的内脏脂肪相关的疾病的例子。
[0025] 本发明也涉及在受试者中诊断内脏脂肪过多的方法，包括确定事先获自待测试的 受试者的体液样本中的1-0-烷基-2-酰基甘油磷酸胆碱（PC_0)42:4水平，和将受试者的PC-O42:4水平与预定的参考值比较，其中所述预定的参考值基于对照群体同样的体液中 的平均PC-O42:4水平，并且其中与预定的参考值比较样本中降低的PC-O42:4水平指示 增加的内脏脂肪过多。
[0026] 内脏脂肪过多可以包括肠系膜脂肪、附睾白色脂肪组织和/或肾周脂肪，以及心 外膜脂肪组织和围绕肝和胃的脂肪。
[0027] 体液可以是例如血液、血清、血浆或尿。
[0028] 血清和/或血浆具有的优势是待测试的生物标志物的信噪比尤其高。
[0029] 尿具有的优势是能够非侵入地获得体液样本。
[0030] 不管所选择的体液是何种，本发明的方法具有的优势是自受试者获得此类体液是 一个已经很好建立了的操作程序。
[0031] 然后在身体外于体液样本中实施实际的诊断方法。
[0032] 能够使用本领域已知的任一手段检测和定量样本中的PC-O42:4水平。例如，可 以使用质谱，如UPLC-ESI-MS/MS。也可以使用其它方法，如其它光谱法，色谱法，标记技术， 或定量化学方法。
[0033] 理想的是，通过相同的方法测定样本中的PC-O42:4水平和参考值。
[0034] 预定的参考值可以基于对照群体的受试体液中的平均PC-O42:4水平。对照群体 可以是至少3个，优选地至少10个，更优选地至少50个具有相似遗传背景、年龄和平均健 康状态的一组人。
[0035] 对照群体也可以是同一人，由此预定的参考值事先获自同一受试者。这允许例如 直接比较当前生活方式和之前的生活方式对内脏脂肪过多的影响，并可以直接评估改善。[0036] 测定内脏脂肪的脂肪过多允许得出存在内脏脂肪的脂肪过多和获得相关疾病的 危险的结论。
[0037] 本发明的主题也涉及在受试者中诊断内脏脂肪过多的变化的方法，包括确定事先 获自待测试的受试者的体液样本中的PC-O 42:4水平，和将受试者的PC-O 42:4水平与 预定的参考值比较，其中所述预定的参考值基于之前获自同一受试者的同样的体液中的 PC-O 42:4水平，并且其中与预定的参考值比较样本中降低的PC-O 42:4水平指示增加的 内脏脂肪过多。
[0038] 这个方法允许随着时间来跟踪内脏脂肪的增多或减少，并且因此允许得出进展为 与内脏脂肪过多相关疾病的风险是上升或下降。
[0039] 这具有例如远在能够确定内脏脂肪实际增加或降低之前可立即获得结果的优点。 这对于激发旨在降低内脏脂肪的人特别好。显然地，减少内脏脂肪是一项艰难的任务，它通 常需要加强锻炼。Ohkawara等人建议，对于有效的内脏脂肪减少，需要每周有氧锻炼至少 10个任务的代谢当量（MET)-小时（Ohkawara，K.等人，（2007)，International journal of obesity (2005)31 (12):1786 - 1797)〇
[0040] 本发明也涉及在受试者中诊断生活方式的变化对内脏脂肪过多的影响的方法， 包括确定事先获自待测试的受试者的体液样本中的PC-O42:4水平，和将受试者的PC-O 42:4水平与预定的参考值比较，其中所述预定的参考值基于之前获自同一受试者的同样的 体液中的PC-O42:4水平，并且其中与预定的参考值比较样本中降低的PC-O42:4水平指 示生活方式的变化对内脏脂肪过多的正影响。
[0041] 这个方法具有的效果是它允许监测生活方式变化对内脏脂肪质量的影响和对有 相关疾病危险的影响。
[0042] 生活方式的变化可以是任何变化，如新的工作，不同的压力水平，新的关系，身体 活动的增加或减少，和/或总体健康的变化。
[0043] 例如，生活方式的变化可以是膳食的变化。
[0044] 膳食的变化可以是碳水化合物、脂类和/或蛋白质含量的增加或减少。它可以是 例如变化为不同地区的膳食，如地中海膳食。它也可以是总热量摄入的变化。
[0045] 因此，本发明的方法可以用来测试新的营养方案、营养产品和/或药物的有效性。
[0046] 营养产品可以是例如声称对身体脂肪、重量管理和/或内脏脂肪具有影响的产 品。
[0047] 一般地，营养产品可以是食物产品，饮料，宠物食物产品，食物补充物，营养保健品 (nutraceuticals)，食物添加剂或配方营养品。
[0048] 例如，膳食的变化可以是使用至少一种以前没有消费或者以不同量消费的营养产 品。
[0049] 由此，本发明的方法可以用来测试新的营养方案和/或营养产品的有效性。
[0050]PC-O42:4可以用作用于本发明目的的唯一标志物。
[0051] 虽然PC-O42:4作为唯一的标志物是有效地作为用于本发明诊断方法的工具，但 是如果诊断基于多于一种标志物时，所述诊断的质量和/或预测能力会提高。
[0052] 因此，用于在受试者中诊断内脏脂肪过多和/或相关疾病风险的一种或多种其它 标志物可以与PC-O42:4组合使用。
[0053] 发明人吃惊地发现其它生物标志物也能够用于检测诊断内脏脂肪过多和/或相 关疾病风险。
[0054]由此发明人鉴定了PC-O44:6,PC-O44:4,PC-O42:4,PC-O40:4,和 / 或PC-O 40:3降低的体液浓度；和/或酪氨酸和/或谷氨酰胺增加的体液浓度允许诊断内脏脂肪量 的增加和/或增加的进展为与过量内脏脂肪相关的疾病的风险。
[0055]相反地，PC-O44:6,PC-O44:4,PC-O42:4,PC-O40:4,和 / 或PC-O40:3 增加的 体液浓度；和/或酪氨酸和/或谷氨酰胺降低的体液浓度允许诊断内脏脂肪量的降低和/ 或降低的进展为与过量内脏脂肪相关的疾病的风险。
[0056] 本发明的方法因此可以进一步包括如下步骤：测定体液样本中至少一种其它生物 标志物的水平，所述其它生物标志物选自谷氨酰胺，和/或酪氨酸，PC-044:4,PC-O44:6， PC-O40:4,和/或PC-O40:3,和将受试者的至少一种谷氨酰胺，和/或酪氨酸，PC-O44:4， PC-O44:6,PC-O40:4,和/或PC-O40:3的水平与预定的参考值比较，其中所述预定的 参考值基于正常健康对照群体的体液样本中的平均谷氨酰胺，酪氨酸，PC-O44:4,PC-O 44:6，PC-0 40:4,和/或PC-O40:3水平，或者基于之前获自同一受试者的同样的体液中的 谷氨酰胺，酪氨酸，PC-O44:4，PC-0 44:6，PC-0 40:4,和/或PC-O40:3水平，并且其中与 预定的参考值比较体液样本中增加的谷氨酰胺和/或酪氨酸水平和/或降低的PC-O44:6， PC-O44:4,PC-O42:4,PC-O40:4,和/或PC-O40:3水平指示增加的内脏脂肪过多。
[0057] 本发明的方法可以包括评估至少2种，至少3种，至少4种，至少5种，至少6种， 或至少7种生物标志物。
[0058]例如，PC-O42:4 可以与PC-O44:4-起评估。
[0059]PC-O42:4 也可以与PC-O44:6 -起评估。
[0060]PC-O42:4 也可以与PC-O40:4 -起评估。
[0061]PC-O42:4 也可以与PC-O40:3-起评估。
[0062]PC-O42:4 也可以与PC-O44:4 和PC-O44:6 -起评估。
[0063]PC-O 42:4 也可以与 PC-O 44:4,PC-O 44:6,和PC-O40:4-起评估。
[0064]PC-O 42:4 也可以与 PC-O 44:4,PC-O 44:6,和PC-O40:3-起评估。
[0065]PC-O 42:4 也可以与 PC-O 44:4,PC-O 44:6,PC-O40:3,和PC-O40:4-起评估。
[0066]PC-O 42:4 也可以与 PC-O 44:4,PC-O 44:6,PC-O40:3,PC-O40:4,和谷氨酰胺 一起评估。
[0067]PC-O42:4 也可以与PC-O44:4,PC-O44:6,PC-O40:3,PC-O40:4,谷氨酰胺和 酪氨酸一起评估。
[0068] 评估多于一种生物标志物的优势在于：评估越多的生物标志物，诊断将变得越可 靠。如果例如多于1，2, 3,4, 5,6,或7种生物标志物显示如上所述的浓度升高或降低，则内 脏肥胖的存在或缺乏和内脏肥胖的程度以及相关疾病风险的预测能力更强。
[0069] 据此，发明人鉴定了能用于预测内脏脂肪过多和进展为相关疾病的风险的其它生 物标志物。
[0070] 例如，发现了与事先获得的相应参考值比较，体液中浓度增加的苯丙氨酸，亮 氨酸，异亮氨酸，棕榈酰肉碱（C16)，癸酰肉碱（C10)，辛酰肉碱（C8:l)溶血磷脂酰胆碱 (LPC)24:0,磷脂酰胆碱（PC)PC30:0,和/或PC34:4或体液中浓度降低的PC-O34:1， PC-O34:2,PC-O36:2,PC-O36:3,PC-O40:6,PC-O42:2，PC-O42:3,PC-O44:3,PC-O 44:5,PC42:0,和/或PC42:2指示增加的内脏脂肪过多和增加的相关疾病风险。
[0071]PC是磷脂酰胆碱。LPC是溶血磷脂酰胆碱。C是酰基肉碱。
[0072] 相反地，与事先获得的相应参考值比较，体液中浓度降低的苯丙氨酸，亮氨酸，异 亮氨酸，ClO(癸酰肉碱），C16 (棕榈酰肉碱），C8:1 (辛酰-肉碱）LPC24:0,PC30:0,和/ 或PC34:4 或体液中浓度增加的PC-O34:1，PC-O34:2,PC-036:2,PC-O36:3,PC-O40:6， PC-O42:2,PC-O42:3,PC-O44:3,PC-O44:5,PC42:0,和 / 或PC42:2 指示降低的内脏 脂肪过多和降低的相关疾病风险。
[0073]因此，本发明的方法还可以包括如下步骤：确定体液样本中至少一种其它生物 标志物的水平，所述其它生物标志物选自苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，ClO(癸酰肉碱）， C16(棕榈酰肉碱），C8:l(辛酰-肉碱），LPC24:0,PC30:0,PC34:4,PC-O34:1，PC-O 34:2,PC-O36:2,PC-O36:3,PC-O40:6,PC-042:2,PC-O42:3,PC-O44:3,PC-O44:5， PC42:0,和/或PC42:2,和将受试者的至少一种苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，C10，C16， C8:l，肉碱，LPC24:0,PC30:0,PC34:4,PC-O34:1，PC-O34:2,PC-O36:2,PC-O36:3， PC-040:6,PC-O42:2,PC-O42:3,PC-O44:3,PC-O44:5,PC42:0,和 / 或PC42:2 水平 与预定的参考值比较，其中所述预定的参考值基于正常健康对照群体体液样本中的平均苯 丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，CIO,C16，C8:1，肉碱，LPC24:0,PC30:0,PC34:4,PC-O34:1，PC-O34:2,PC-O36:2,PC-O36:3,PC-O40:6,PC-O42:2,PC-O42:3,PC-O44:3,PC-O 44:5,PC42:0,和/或PC42:2水平，或者基于之前获自同一受试者的同样的体液中的 苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，ClO(癸酰肉碱），C16(棕榈酰肉碱），C8:l(辛酰-肉碱）， LPC24:0,PC30:0,PC34:4,PC-O34:1，PC-O34:2,PC-O36:2,PC-O36:3,PC-O40:6， PC-042:2，PC-0 42:3，PC-0 44:3，PC-0 44:5，PC42:0,和 / 或PC42:2 水平，且其中与预定 的参考值比较，体液中增加的苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，C10,C16,C8:1，肉碱，LPC24:0， PC30:0,和/或PC34:4水平和/或体液样本中降低的PC-O34:l，PC-0 34:2，PC-0 36:2， PC-O36:3,PC-O40:6,PC-O42:2,PC-O42:3,PC-O44:3,PC-O44:5,PC42:0,和 / 或PC 42:2水平指示增加的内脏脂肪过多。
[0074] 增加的内脏脂肪过多增加了进展为与过量内脏脂肪相关的疾病的风险。
[0075] 因此，在本发明的方法中，内脏脂肪过多的程度可以用作进展为与过量内脏脂肪 相关的疾病的可能性的指示。
[0076] 同样地，内脏脂肪过多的变化可以用作进展为与过量内脏脂肪相关的疾病的上升 或下降的可能性的指示。
[0077] 与内脏脂肪过多相关的疾病是例如心代谢疾病。
[0078] 因此，本发明的方法可以用来确定进展为心代谢疾病的风险。
[0079] 另外，与内脏脂肪过多相关的疾病是例如代谢失调。典型的代谢失调是随后的肥 胖，胰岛素抗性，2型糖尿病，代谢综合征，血管疾病（高血压，冠心病），代谢肝疾病中的脂 肪肝炎，脂肪代谢障碍，肺功能障碍，炎性疾病和其它肥胖相关疾病。
[0080] 能够对任何受试者实施本发明的方法。
[0081] 有利地，可以对有进展为内脏脂肪过多和/或与内脏脂肪过多相关的疾病的风险 的受试者实施本发明的方法。
[0082] 例如，可以对正常的、过重的或肥胖的受试者实施本发明的方法。
[0083] "过重"是对成年人定义为具有25至30之间的BMI。"身体质量指数"或"BMI"意 指kg体重除以以米为单位的身高平方之比。"肥胖"是贮存在动物的脂肪组织，特别是在人 和其它哺乳动物的脂肪组织中的天然能量储备增加至与某些健康状况或增加的致死性相 关的点的状况。"肥胖的"是对成年人定义为具有大于30的BMI。
[0084] 对于PC-O42:4和任选地对于其它生物标志物，参考值优选地使用用来表征获自 试验受试者的PC-O42:4和任选地其它生物标志物水平的相同单位测定。因此，如果PC-O 42:4和任选地其它生物标志物的水平是如PC-O42:4以μmol/1(μM)所示单位的绝对 值，则参考值也是基于一般群体或基于所选择的受试者对照群体中个体的PC-O42:4以 μmol/1 (μΜ)所示单位。
[0085] 进一步地，参考值能够是单个的截止值，如中位值或均值。获得的体液样本中PC-O 42:4和任选地其它生物标志物中的参考值如平均水平、中位值水平或"截止"水平可以通 过测试一般群体或所选择的群体中大的个体样本和使用统计学模型来建立，如用于选择阳 性标准的预测值方法，或定义最适特异性（最高的真阴性率）和灵敏性（最高的真阳性率） 的接收者操作特性曲线，如Knapp，R.G.和Miller，M.C. (1992)ClinicalEpidemiologyand Biostatistics·William和Wilkins,HarualPublishingCo.Malvern,Pa.所述，其在此弓I 用作为参考。
[0086] 熟练的技术人员知道如何指定正确的参考值，因为例如所述正确的参考值随着性 另IJ、种族、遗传继承、健康状况或年龄而不同。
[0087] 作为例子，例如发明人已经在肥胖成年人受试者和在正常成年人受试者的体液如 血浆中确定了典型的参考值。
[0088] 因此，对于肥胖受试者，预定的平均参考值可以是
[0089] 对酪氨酸约68. 71μM体液，
[0090] 对谷氨酰胺约662. 67μM体液，
[0091] 对PC-O 44:6 约 1. 47μM体液，
[0092] 对PC-O 44:4 约 0· 84μM体液，
[0093] 对PC-O 42:4 约 1. 27μM体液，
[0094] 对PC-O 40:4 约 2. 65μM体液，
[0095] 对PC-O 40:3 约 1. 37μM体液，
[0096] 对苯丙氨酸约52. 97μM体液，
[0097] 对亮氨酸+异亮氨酸约193. 56μM体液，
[0098] 对ClO约 0· 19μM体液，
[0099] 对(：16约0.06以]\1体液，
[0100] 对C8:1 约 0· 03μM体液，
[0101] 对LPC24:0 约 0· 25μM体液，
[0102] 对PC30:0 约 4. 18μM体液，
[0103] 对PC34:4 约LΙΙμΜ体液，
[0104] 对PC-O34:1 约 9. 84μM体液，
[0105] 对PC-O34:2 约 11. 49μM体液，
[0106] 对PC-O36:2 约 11. 79μM体液，
[0107] 对PC-O 36:3 约 7. 20μM体液，
[0108] 对PC-O 40:6 约 3. 68μM体液，
[0109] 对PC-O 42:2 约 0· 56μM体液，
[0110] 对PC-O 42:3 约 0· 89μM体液，
[0111] 对PC-O 44:3 约 0· 21μM体液，
[0112] 对PC-O 44:5 约 2. 17μM体液，
[0113] 对PC42:0 约 0· 56μM体液，
[0114] 对PC42:2 约 0· 22μM体液。
[0115] 在正常受试者中，预定的平均参考值可以是
[0116] 对酪氨酸约75. 00μM体液，
[0117] 对谷氨酰胺约748. 27μM体液，
[0118] 对PC-O 44:6 约 L21μM体液，
[0119] 对PC-O 44:4 约 0· 50μM体液，
[0120] 对PC-O 42:4 约 L12μM体液，
[0121] 对PC-O 40:4 约 3. 24μM体液，
[0122] 对PC-O40:3 约 2· 10μM体液，
[0123] 对苯丙氨酸约49. 17μM体液，
[0124] 对亮氨酸+异亮氨酸约197. 52μM体液，
[0125] 对ClO约 0· 29μM体液，
[0126] 对(：16约0.09以]\1体液，
[0127] 对C8:1 约 0· 04μM体液，
[0128] 对LPC24:0 约 0· 77μM体液，
[0129] 对PC30:0 约 4. 10μM体液，
[0130] 对PC34:4 约L 42μM体液，
[0131] 对PC-O34:1 约 8. 20μM体液，
[0132] 对PC-O34:2 约 9. 26μM体液，
[0133] 对PC-O36:2 约 12. 67μM体液，
[0134] 对PC-O36:3 约 5. 83μM体液，
[0135] 对PC-O40:6 约 4. 45μM体液，
[0136] 对PC-O42:2 约 0· 82μM体液，
[0137] 对PC-O42:3 约 L08μM体液，
[0138] 对PC-O44:3 约 0· 22μM体液，
[0139] 对PC-O44:5 约 L82μM体液，
[0140] 对PC42:0 约 0· 65μM体液，
[0141] 对PC42:2 约 0· 35μM体液。
[0142] 用本发明的方法待测试的受试者可以例如是人或动物，特别地是哺乳动物。通常 的动物可以例如是陪伴动物，如猫或狗或农场动物。
[0143] 本领域技术人员理解他们能够自由地组合文中所述的本发明的所有特征，且不偏 离所公开的本发明的范围。具体而言，本发明的方法所述的特征可以应用至其它方法和应 用至本发明的用途且反之亦然。
[0144] 本发明的其他优点和特征从下列实施例和附图中是显而易见的。
[0145] 表1显示招募的群组的临床特征，基于通过计算机断层扫描测定的腹膜内的/腹 部的脂肪比之Iogltl值评估的他们的内脏脂肪含量分级为四个四分位。值表示为平均值 (土SD)。ALAT=丙氨酸转氨酶，ASAT=天冬氨酸转氨酶，BMI=身体质量指数，GGT=γ-谷 氨酰转肽酶，HDL-C=高密度脂蛋白胆固醇，HOM-IR=胰岛素抗性的内环境稳定模型评 估，LDL-C=低密度脂蛋白胆固醇，MAP=平均动脉血压，NEFAs=非酯化脂肪酸，TG=甘油 三酯。
[0146] 表2显示基于通过计算机断层扫描测定的腹膜内的/腹部的脂肪比之Iogltl值评 估的他们的内脏脂肪含量，对四个四分位的每一个四分位以平均值（土SD)表示的代谢物 浓度。
[0147] 图1显示使用随机森林分析，统计学重构1HNMR血浆谱，以鉴定与内脏脂肪过多 相关的代谢模式（用方框鉴定）。GPCs=甘油磷脂，PUFAs=多不饱和脂肪酸，UFAs=不饱 和脂肪酸。
[0148] 图2显示代谢物在如通过随机森林分析预测内脏脂肪的脂肪过多中的重要性和 确实性。在η= 10000个随机森林生成之后精度上合并的平均降低。较高的可变重要性对 应于精度上合并的平均降低的较高值。
[0149] 图3-1，3-2和3-3显示对每一所选代谢物，高和低内脏脂肪受试者之间的代谢物 差异。基于通过计算机断层扫描测定的腹膜内脂肪容量之Iogltl值评估的他们的内脏脂肪 含量，对每一四分位绘制数据，1 =四分位1，2 =四分位2, 3 =四分位3,4 =四分位4。 实施例
[0150] 受试者和实验设计
[0151]临床试验是在CentreHospitalierUniversitaireVaudois(CHUV，Lausanne，瑞 士）对40个健康的肥胖白种女人进行的观察研究。位于CHUV的独立的伦理委员会批准了 该研究方案。参加者的BMI在28和40之间，年龄在25岁和45岁之间，且不显示代谢疾病 特征（糖尿病2型，心血管疾病或代谢综合征）。获得的生物样本（血浆和24小时尿样本） 在代谢组学分析之前贮存在一 80°C。
[0152] 身体组成评估
[0153] 进行全身扫描，以确定腹部脂肪分布和总的身体组成。在GELunariDXA系统 (软件版本：enCOREversion12. 10. 113)上进行全身扫描，其中扫描模式通过该设备自动 确定。对于DXA测量，所有受试者穿医院服装并摘下所有金属物。使用GELunar校准仪 (calibrationphantom)每日校准iDXA单元。经过训练的操作者进行所有的扫描，按照操 作者手册来安置患者和获得数据。在一小时的约定期间，对每一受试者进行两次全身扫描， 在两次扫描之间重新安置患者。使用enCORE软件（版本14. 00. 207)分析扫描。通过enCORE 软件（自动R0I)对全身，臂，腿，躯干部，男性样的区域和女性样的区域自动确定R〇Is。有 经验的DXA操作者也证实并且当指出时重新安置ROI位置（专家R0I)。除了iDXA扫描之 夕卜，还进行腰和臀测定。
[0154]在 64 多检测项CT扫描仪（VCTLightspeed，GEMedical Systems，Milwaukee， USA)上实施CT测定。受试者以他们的臂高于他们的头和腿的仰卧位用垫子垫高地 躺着。在L4-L5椎骨水平获得腹部的单个扫描（10mm)，并分析脂肪组织的横截面积 (cross-sectional area),表示为平方厘米。使用下列的获得参数：具z轴剂量调节的 120Kv，100-200mA，和视场500mm。使用标准的核心重构5mm切片厚度的轴横断成像。定量 方法使用半交互式的市售运算法则在Advantage Window工作区（GEMedical Systems) 上分割皮下的和腹内脂肪。
[0155] 临床化学
[0156] 使用常规的实验室方法测定血浆总的、HDL和LDL胆固醇，甘油三酯，尿酸，肌酸 酐，钠和钾浓度41^1^5纟1'，661'，葡萄糖，非酯化脂肪酸，胰岛素和平均动脉血压（嫩?）。根 据之前描述的公式（Mathews等人，1985):胰岛素（μU/mL)X葡萄糖（mmol/L)/22. 5,将胰 岛素抗性状态评估为胰岛素抗性的内环境稳定模型评估（HOM-IR)。
[0157] 样本制备和1H-NMR光谱分析
[0158] 将肝素血浆样本（400 μ L)与200 μ L氘化磷酸盐缓冲液（KH2PO4终浓度为0. 2M) 导入5mm NMR管。氣用作锁物质。在配备有倒置的5mm低温探头的Bruker Avance III 600MHz光谱仪上以300K(Bruker Biospin，Rheinstetten，德国）测定代谢谱。对 每一血浆样本，获得具有水压制的标准1H-NMR-维脉冲序列（RD= 4s)，具有水压制 的Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)自旋回波序列（RD= 4s)，和编辑了扩散的序列 (diffusion-editedsequence)(RD= 4s)。对每个一维实验，使用98K数据点收集32个扫 描。在傅立叶转换之前使用T0PSPIN(版本2. 1，Bruker，德国）软件包加工1H-NMR谱。对 获得的NMR谱手工定相和基线校正，并且对于血浆谱，参照α-葡萄糖异头质子在δ5. 2396 的化学位移。通过匹配我们在机构内研发的纯化合物的NMR数据库和使用文献数据 (Fan,Τ.W. (1996)ProgressinNuclearMagneticResonanceSpectroscopy28, 161-219 ； Nicholson,J.K.等人（1995)Anal.Chem. 67, 793-811)，实现对特定代谢物的 1H-NMR 共振的分配。通过 2D1H-1HCorrelationSpectroscopY(COSY) (Hurd,R.E. (1990) J. Magn. Reson.87,422-428)>1H-1H TOtal Correlation SpectroscopY(TOCSY) (Bax, A. &Davis (1985) J.Magn.Reson. 65, 355-360)和1H-13C Heteronuclear Single Quantum Correlation (HSQC)(Bodenhausen, G. &Ruben(1980)Chemical Physics Letters 69, 185-189) NMR技术证实代谢物身份。
[0159] 用于Biocrates Life Sciences AbsoluteIDQTM试剂盒分析的样本制备
[0160] 如之前公开的那样（:R6misch-Margl，W.，C.Prehn,R.Bogumil,C.R0hring, K.Suhre，J.Adamski，用于高通量靶向代谢组学的组织样本制备和代谢物提取的方法， Metabonomics, 2011。首先在网上公开），将BiocratesLifeSciencesAbsoluteIDQTM 试剂盒用于EDTA血浆样本。按照生产商的说明书进行孔板制备以及样本施加和提取。 将10μ1终体积的血浆加样至提供的96孔板，其中含有同位素标记的内标。在Dionex Ultimate3000超高压液体色谱（UHPLC)系统（DionexAG,Olten,瑞士）上实施液相色 谱，其中所述色谱系统与安装有TurboV离子源以电喷雾离子化（ESI)模式运行的3200Q TRAP质谱仪（ABSciex;FosterCity,CA,USA)偶联。使用梯度流速 0-2. 4 分钟：30μ1/ 分钟，2. 4-2. 8分钟：200μ1/分钟，2. 9-3分钟：30μ1/分钟，通过直接输注，注射样本提 取物（20μ1)两次（以正和负ESI模式）。MS源参数设置为：脱溶剂温度（TEM) : 200°C，高 电压：-4500V(ESI-)，5500V(ESI+)，气帘（CUR)和雾化器（GS1 和GS2)气体；氮气；20, 40， 和50psi;分别地，氮气碰撞气压：5mTorr。以计划的反应监测模式（SRM)进行MS/MS获取， 其中对于该测定试验中筛选的163种代谢物具有优化的去簇电位值（potentialvalues)。 将原始数据文件（Analyst软件，版本I. 5.I;ABSciex,FosterCity,CA,USA)输入提供 的分析软件MetlQ，以计算代谢物浓度。可从BiocratesLifeSciences,Austria(http:// biocrates,com)获得所有能够检测到的代谢物的列表。
[0161] 多变量数据分析（MVA)
[0162] 使用机构内研发的排除了δ4. 68-5. 10之间的水残留信号的MATLAB常规，在 δ0. 2-10. 0的范围，将血浆NMR谱转换为22Κ数据点。在化学计量分析之前，将化学位移强 度归一化为特定范围内的所有强度的总和。使用软件包SMCA-P+(版本12. 0.LUmetrics AB，Ume&，瑞典）和机构内研发的MATLABCTheMathWorksInc.，Natick，MA，USA)惯常 程序进行化学计量分析。为了检测代谢谱之间相似性的存在，使用主要组分分析（PCA) (Wold，S.等人（1987)Chemom.Intell.Lab.Syst. 2, 37-52)，隐变量投影（Projectionto LatentStructures;PLS) (Wold，S.等人（1987)PLSMeeting，Frankfurt)和隐变量正交 投影（OrthogonalProjectiontoLatentStructures;0_PLS)(Trygg，J.&Wold(2003) J.Chemom.17,53-64)。使用7层交叉检验评估该模型的有效性（Cloarec，0·等人（2005)Anal. Chem.77, 517-526)。从7层交叉检验循环中预测的样本建立O-PLS-DA模型的分类准 确性。
[0163]通过随机森林法（RandomForests)，使用 'randomForest' 包（A.Liaw和 ^町61^1"(2002)，通过随机森林法分类和回归，1?他￥8 2(3)，18-22)，在1?环境中运行〇? DevelopmentCoreTeam(2011).用于统计学地计算机运行的语言和环境R(R:Alanguage andenvironmentforstatisticalcomputing),RFoundationforStatistical Computing),Vienna,Austria.ISBN3-900051-07-0,URLhttp://www.R-project.org/.), 分析靶向MS数据。用于验证的单变量显著性检验也在R中进行。
[0164] 由于内脏脂肪过多的非正规分布，使用下列参数用于随后的代谢组学分析：内脏 脂肪含量的log转换值，腹膜内的/皮下的脂肪比（比率1)的log转换值，或腹膜内的/ 腹部的脂肪比（比率2)的log转换值。
[0165] 表1中示出了群组的人体可测量性状和生物化学特性，基于使用CT测量的腹膜内 的/腹部的脂肪比（比率2)的Iogltl值分类在四个四分位中（Ql-4，n= 10)。禁食后的葡 萄糖（p〈0. 10)和胰岛素（p〈0. 05)，以及HOM-IR(p〈0. 05)在具有最高的内脏脂肪过多的受 试者中（Q4)，与（Ql)相比较而言更高。腹膜内的/皮下的脂肪比或腹膜内的/腹部的脂肪 比的Log转换值优选地用来根据受试者的内脏脂肪过多来对他们分类，因为这些参数显示 为独立于BMI，Hipp，腰，ALAT，MAP，和量热指数，对于腹膜内的脂肪容积的Log转换值而言 情况并非如此。有趣的是，在群组中，组之间的HDL，LDL，和总的胆固醇没有统计学差异。
[0166] 为了鉴定内脏脂肪沉着的表型特征物，使用1H-NMR和靶向LC-MS/MS代谢组学方 法分析血浆样本。对禁食后的血浆样本进行分析。收集的样本的OPLS分析显示血浆脂质 和内脏脂肪沉着之间某些细微但显著的相关（R2X:〇. 68 ;R2Y:0. 506 ;Q2Y:0. 167)。也应用随 机森林分析来证实特定的血浆脂质和内脏脂肪状态之间的该统计相关（图1)，其表明甘油 磷脂和脂肪酸饱和模式的变化标出的特定的血浆脂质重新建模。
[0167] 因此，应用靶向LC-MS/MS代谢组学来提供163种代谢物的结构信息和定量测定 值，所述163种代谢物包括氨基酸，糖类，酰基肉碱，鞘脂，和甘油磷脂。使用OPLS分析，确 定内脏脂肪的脂肪过多的代谢标签是可能的（R2X:0. 29 ;R2Y:0. 68 ;Q2Y:0. 32)。
[0168] 为了选择更坚实的标志物，使用了"out-of-bag"数据的％平均降低精度作为变量 的重要性特征。在这个方式中，确定根据受试者的内脏脂肪状态而更好地区分他们的变量 是可能的（Ql相对于Q4比较）。Ql，Q4均使用腹膜内脂肪容积比率1和比率2的log转 换值之一来评估。通过单独地考虑每一访问，也检验了该模型用于评估天之间的代谢变化 (数据未显示）。最终，保留26种代谢物为具有根据受试者内脏脂肪的脂肪过多分类他们 的重要性（图2, 3-1，3-2, 3-3)。内脏脂肪过多与增加浓度的循环氨基酸相关，所述氨基酸 包括谷氨酰胺，亮氨酸/异亮氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。这些模式与较高浓度的酰基肉碱相 关，所述酰基肉碱包括棕榈酰肉碱（C16)，癸酰肉碱（ClO)，辛酰肉碱（C8:l)，和溶血磷脂酰 胆碱LPC24:0和二酰基磷脂，包括PC30:0,PC34:4。此外，内脏脂肪过多通过消耗酰基 醋PC-O36:3,PC-O40:3,PC-O40:4,PC-O40:6,PC-O42:2,PC-O42:3,PC-O42:4,PC-O 44:3,PC-O44:4,PC-O44:6,和两种二酰基磷酸胆碱（PC42:0和PC42:2)而明显。为了 评估所述标签的每一组分的单个区分能力，在内脏脂肪的脂肪过多组之间实施了Wilcoxon 秩和检验（在表2中根据检验的描述符，S卩比率2的IoglO值，列出了所有的代谢物）。
[0169] 图2总结了使用内脏脂肪含量的IoglO值，比率1的IoglO值或比率2的IoglO 值，所选择的生物标志物和在内脏脂肪过多的分类中它们的权重。在交叉验证模式中这些 标志物显示对内脏脂肪具有灵敏性和0. 90的特异性（Sencv，Specv)。
[0170]表 1:
[0171]
【权利要求】
1.生物标志物，其中所述生物标志物是PC-0 42:4。 2. PC-0 42:4的用途，用作生物标志物来检测和/或定量内脏脂肪过多和/或内脏脂肪 过多的变化。
3.在受试者中诊断内脏脂肪过多的方法，包括 -在事先获自待测试的受试者的体液样本中确定PC-0 42:4水平，和 -将受试者的PC-0 42:4水平与预定的参考值比较，其中所述预定的参考值基于对照 群体同样的体液中的平均PC-0 42:4水平，并且其中与预定的参考值比较样本中降低的 PC-0 42:4水平指示增加的内脏脂肪过多。
4. 在受试者中诊断内脏脂肪过多的变化的方法，包括 -确定事先获自待测试的受试者的体液样本中的PC-0 42:4水平，和 -将受试者的PC-0 42:4水平与预定的参考值比较，其中所述预定的参考值基于之前 获自同一受试者的同样的体液中的PC-0 42:4水平，并且其中与预定的参考值比较样本中 降低的PC-0 42:4水平指示增加的内脏脂肪过多。
5. 在受试者中诊断生活方式的变化对内脏脂肪过多的影响的方法，包括 -确定事先获自待测试的受试者的体液样本中的PC-0 42:4水平，和 -将受试者的PC-0 42:4水平与预定的参考值比较，其中所述预定的参考值基于之前 获自同一受试者的同样的体液中的PC-0 42:4水平，并且其中与预定的参考值比较样本中 增加的PC-0 42:4水平指示生活方式的变化对内脏脂肪过多的积极影响。
6. 根据权利要求5的方法，其中所述生活方式的变化是膳食的变化。
7. 根据权利要求6的方法，其中所述膳食的变化是使用至少一种以前没有消费或者以 不同量消费的营养产品。
8. 根据权利要求6或7的方法，用来测试新的营养方案的有效性。
9. 根据权利要求3至8中任一项所述的方法，还包括步骤 -确定体液样本中至少一种其它生物标志物的水平，所述其它生物标志物选自谷氨酰 胺，酪氨酸，？〇044:4，？〇0 44:6，卩(：-0 40:4，和？(：-0 40:3，和 -将受试者的谷氨酰胺，酪氨酸，PC-0 44:4,PC-0 44:6,PC-0 40:4,和PC-0 40:3之 至少之一的水平与预定的参考值比较，其中所述预定的参考值基于正常健康对照群体的体 液样本中的平均谷氨酰胺，酪氨酸，PC-0 44:4，PC-044:6，PC-0 40:4,和/或PC-0 40:3水 平，或者基于之前获自同一受试者的同样的体液中的谷氨酰胺，酪氨酸，PC-0 44:4,PC-0 44:6，PC-0 40:4,和/或PC-0 40:3水平，并且其中与预定的参考值比较体液样本中增加的 谷氨酰胺和/或酪氨酸水平和/或降低的PC-0 44:6,PC-0 44:4,PC-0 42:4,PC-0 40:4， 和/或PC-0 40:3水平指示增加的内脏脂肪过多。
10. 根据权利要求3至9中任一项所述的方法，其中所述生物标志物的水平是通过 iH-NMR和/或质谱测定样本和参照物而确定的。
11. 根据权利要求3至10中任一项所述的方法，其中所述体液是血浆或血清。
12. 根据权利要求3至11中任一项所述的方法，其中所述内脏脂肪过多的程度对于进 展为与过量内脏脂肪相关的疾病的可能性是指示性的。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述与过量内脏脂肪相关的疾病是心代谢疾病 和/或代谢失调。
14. 根据权利要求3至13中任一项所述的方法，其在正常、过重或肥胖受试者中实施。
15. 根据权利要求3至14中任一项所述的方法，其中所述受试者是人或陪伴动物，如猫 或狗。
【文档编号】G01N33/92GK104380114SQ201380031038
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年6月10日 优先权日:2012年6月12日
【发明者】F-P·马丁, I·蒙托柳鲁拉, P·A·盖, S·A·D·莱兹 申请人:雀巢产品技术援助有限公司