磷酸胆碱偶联物和相应抗体的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种测定抗磷酸胆碱自身抗体、尤其是抗磷酸胆碱的IgM自身抗体，从而鉴定有患缺血性心血管疾病风险的患者的方法。本发明提供了一种药物组合物，其包含磷酸胆碱偶联物(主动免疫)或特异性针对磷酸胆碱偶联物的抗体制剂，例如单克隆抗体(被动免疫)，本发明还提供了用这些组合物作为主动免疫或被动免疫的免疫原治疗或预防动脉粥样硬化的用途。
【专利说明】磷酸胆碱偶联物和相应抗体
[0001]本申请是国际申请日为2005年04月15日的申请号为200580019701.9的中国发明专利申请“磷酸胆碱偶联物和相应抗体”的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及动脉粥样硬化和缺血性心血管疾病的治疗和风险评估领域。
【背景技术】
[0003]动脉粥样硬化是一种慢性疾病，引起大动脉和中等大小动脉的最内层(内膜)增厚。它使血流缓慢，并可以在由受感染血管供血的器官中引起缺血和组织破坏。动脉粥样硬化是导致心肌梗塞等心血管疾病、中风和外周动脉疾病的主要原因。它是西方国家的主要死因，预计不出二十年，将成为全球最主要的死亡原因。
[0004]这种疾病始于血管的细胞外基质中积累脂蛋白，主要是低密度脂蛋白(LDL)。这些LDL颗粒聚集并发生氧化。氧化后的LDL具有促炎特性和毒性，引起血管损伤。动脉粥样硬化在很多方面代表了对这种损伤的一种反应，包括炎症和纤维变性。
[0005]1989年,Palinski及其同事鉴定出人体内抗氧化型LDL的循环自身抗体。这一发现提示，动脉粥样硬化可能是由抗氧化型脂蛋白的免疫反应引起的自身免疫病。同一时期，多个实验室开始寻找抗氧化型LDL抗体滴度与心血管疾病之间的关系。但这些研究没有得出明确的结论。目前已经有针对氧化型LDL表面众多不同表位的多种抗体，但这些表位的结构尚不清楚。因此，术语〃氧化型LDL抗体〃是指多种不同抗体的未知混合物，而不是指一种特殊的抗体。
[0006]众所周知，动脉硬化病灶存在持续炎症，其特征是免疫活性细胞被活化，产生炎性细胞因子。已经确认的风险因素，例如高血压、血脂、糖尿病和吸烟都很可能促进这种炎症反应，但这种现象的发生机制尚不明确，存在多种互不相干的排他性可能性。已经有人提出多种可以引起该免疫反应的自身抗原，包括氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)和热休克蛋白(HSP)2，3。有关免疫反应在动脉粥样硬化中的作用的现有信息提示一种复杂的关系。其中一种情况是，在动物模型中进行免疫接种，以便影响动脉粥样化的形成。当使用HSP时，动脉粥样硬化增加，当以oxLDL作为抗原时，动脉粥样硬化减少45。
[0007]aOxLDL在人类疾病中的作用似乎比较复杂。此前有人证实，aOxLDL在健康对照人群中的水平高于临界高血压(borderline hypertension,一种早期心血管疾病6)人群。近期研究与该发现是一致的7’8。另一方面，有多位研究者报道，aOxLDL在人类心血管疾病(CVD)中升高，尤其是在晚期疾病中2’3’9’1(1。实例之一是系统性红斑狼疮(SLE)以及与CVD极高风险有关的自身免疫病。有CVD病史的SLE-患者aOxLDL水平明显升高n。这些在某种程度上相互矛盾的结果可能主要是由于:LDL-氧化的不同方法和状态在抗原性方面产生差异。疾病阶段和风险系数变化谱都倾向于与抗体水平相关。
[0008]氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)本身具有多种促炎特性，包括活化T细胞12，13，单核细胞/巨噬细胞和内皮细胞14_16。OxLDL还在来自动脉粥样硬化病灶的免疫活性细胞中促进炎症17。但要注意，oxLDL也可以缓解急性炎症反应，并替代促进更低级的慢性炎症，这在动脉粥样硬化中可见18。有趣的是，oxLDL的多种生物学活性是由oxLDL中的血小板活化因子(PAF)-样脂质引起的19_21。
[0009]磷酸胆碱(phosphorylcholine, PC)不仅是血小板活化因子PAF(它在与PAF-受体相互作用时是必需的)等炎症性磷脂和oxLDL中的主要成分，还可以作为肺炎链球菌(S.Pneumoniae)等多种细菌的免疫原成分22。而且，PC由凋亡细胞表达2’23。
[0010]在US5455032中，在用于提供抗感染(例如肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae))的免疫保护的疫苗中使用磷酸胆碱偶联物。Binder等人最近对小鼠中肺炎球菌疫苗的研究24显示，免疫接种减少了动脉粥样硬化灶的形成。有研究发现，由动脉粥样硬化小鼠产生的多种抗oxLDL自身抗体与提供抗常见感染性病原体(包括肺炎链球菌)的保护作用的抗体有相同的结构。在小鼠、而非人类中的研究并未提供任何关于特异性的信息，也未能提示，IgM抗-磷酸胆碱抗体在动脉粥样硬化中是比相应IgG抗体明显更为重要的保护因子。此外，磷酸胆碱偶联物未被用于肺炎球菌疫苗中。
[0011]另一项研究25显示,抗磷酸胆碱抗体水平在牙周病(periodontal diseases)患者体内升高。其结论是，磷酸胆碱是与牙周菌群中生物相关的重要的口腔抗原，而抗-PC抗体水平的升高是牙周患病的结果。至今尚无动脉粥样硬化的抗体和可能的保护作用或进展的任何息。
[0012]目前已有多篇关于动脉粥样硬化的免疫接种治疗的文献被公开(如W02002080954和WOO168119)，但这些是基于使用脱脂载脂蛋白B的肽片段或抗T细胞受体alpha/beta链的抗体。有一篇文献(W09908109)描述了用抗脂蛋白表面氧化作用特异性表位的单克隆抗体检测动脉粥样硬化斑的方法。与该方法不同的是，本发明的方法使用磷酸胆碱偶联物检测受试者样品中的IgM或IgG等抗体。
[0013]发明简述
[0014]本发明涉及药物组合物及其在治疗、预防动脉粥样硬化，例如治疗、预防或缓解动脉粥样硬化的进一步进展方面的用途，所述药物组合物包含磷酸胆碱偶联物、或特异性针对磷酸胆碱偶联物的抗体制剂，例如单克隆抗体。本发明还涉及磷酸胆碱偶联物或所述抗体制剂，例如单克隆抗体在制备药物组合物中的用途，所述偶联物或抗体制剂可以与佐剂组合或者不与佐剂组合。本发明还涉及诊断有无抗体，例如IgM或IgG抗体的方法,所述抗体与患缺血性心血管病风险的增加或降低相关。
[0015]本发明第一方面提供了药物组合物在制备免疫接种和治疗哺乳动物动脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病的药物中的用途，所述药物组合物包含至少一种磷酸胆碱偶联物，或特异性针对磷酸胆碱偶联物的抗体制剂，例如单克隆抗体，所述哺乳动物包括人。所述药物是用于对动脉粥样硬化有致免疫特性或治疗特性的免疫接种。
[0016]本发明第二方面提供了免疫接种和治疗哺乳动物动脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用药物组合物，所述药物组合物包含至少一种磷酸胆碱偶联物，或特异性针对磷酸胆碱偶联物的抗体制剂，例如单克隆抗体，所述哺乳动物包括人。所述药物组合物是用于对动脉粥样硬化有致免疫特性或治疗特性的免疫接种。
[0017]磷酸胆碱偶联物是指磷酸胆碱组分与载体相连，优选通过间隔臂(spacer)相连。作为结构性组件的磷酸胆碱可包括磷酸胆碱衍生物。合适的磷酸胆碱偶联物实例可参见US5, 455，032，见上文。例如，US5，455，032提供了这样的磷酸胆碱偶联物，其中磷酸胆碱组分借助直链烷基和酰胺键与各种不同的免疫学载体相连。所述磷酸胆碱偶联物可以是，例如人血清白蛋白(HSA)-或匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)-磷酸胆碱偶联物或牛血清白蛋白(BSA)-磷酸胆碱偶联物(例如见实施例)。PC-BSA(磷酸胆碱-牛血清白蛋白)可以从Biosearch Technologies, INC (Ca, USA)购买。HSA-BSA可以通过化学方法偶联，所述方法举例如下:
[0018]可以按照Chesebro, B.在 Biochemistryll, (1972) 766 中所述方法，以含 10% 钮!的活性碳(charcoal)作为催化剂,使O-(4_硝基苯基-磷酰基)-胆碱(Sigma N5879)与氢气在Iatm进行还原反应，大量产生O- (4-氨基苯基磷酰基)-胆碱(I)。
[0019]用EDC(1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)_碳二亚胺)的MES液(pH4)使(I)与 HAS 偶联,方法基本如 Padilla, N.D.等在 J.Tmmun..Methods293 (2004) 1-11 中所述。偶联的HAS可以通过对经过缓冲的盐水(pH7.4)透析而被分离。
[0020]载体可以是，例如，蛋白质、脂质或聚合物。载体可以是乳胶珠，例如实施例中所述。
[0021]所述药物可以用于注射给药。
[0022]本发明另一方面提供了在先任一方面定义的一或多种磷酸胆碱偶联物在制备免疫治疗或治疗缺血性心血管疾病的药物组合物中的用途，可以与佐剂组合或不与佐剂组
口 ο
[0023]本发明又一方面提供了预防性治疗或治愈性治疗哺乳动物的方法，所述哺乳动物是指患有动脉粥样硬化或者有患缺血性心血管病的风险的哺乳动物，例如人，所述方法包括施用治疗有效量的至少一种磷酸胆碱偶联物、或特异性针对磷酸胆碱偶联物的抗体制剂，例如单克隆抗体。
[0024]本发明还涉及确定有无抗磷酸胆碱的抗体，例如抗磷酸胆碱的IgM或IgG抗体的方法，所述抗体与患缺血性心血管病风险的增加或降低相关。
[0025]本发明又一方面提供了用磷酸胆碱偶联物诊断有无抗体，例如IgM或IgG抗体的方法，所述抗体与患缺血性心血管病风险的增加或降低相关。
[0026]故而本发明还有一方面提供了磷酸胆碱偶联物在评估患者发生或进展缺血性心血管疾病的风险的方法中的用途，在所述方法中，评估所述患者的与磷酸胆碱偶联物反应的抗体，例如IgM或IgG抗体的水平。
[0027]磷酸胆碱偶联物已经在上文中描述。磷酸胆碱可以与载体通过间隔臂相连。所述载体可以是蛋白质，这可以是KLH(匙孔血蓝蛋白)或人血清白蛋白(HSA)。所述载体可以是乳胶珠。
[0028]所述患者的与磷酸胆碱偶联物反应的抗体，例如IgM或IgG抗体的水平可以用免疫分析方法评估。合适的免疫分析方法的实例在下文中描述，并且是本领域技术人员在任何情况下都明显可以得知的。
[0029]可能需要测定与oxLDL或MD-LDL反应的抗体以及测定与磷酸胆碱偶联物反应的抗体，例如IgM或IgG抗体。或者，或进一步地，可能需要测定HSP70，HDL, TNF和/或HSP60的水平(见实施例)以及测定与磷酸胆碱偶联物反应的抗体，例如IgM或IgG抗体的水平。[0030]发明详述
[0031]以下实施例旨在举例说明本发明，不应认为是对权利要求所概括的保护范围作任何限制。本文提到的文献都引入作为参考。
[0032]这里描述了一例测定与缺血性心血管疾病患病风险升高或降低相关的抗磷酸胆碱IgM抗体存在与否(或水平)的方法。也可以用本领域已知的其它方法。类似的方法可以用于测定抗磷酸胆碱IgG抗体的存在与否(或水平)。
[0033]测定抗磷酸胆碱的IgM抗体存在与否的方法
[0034]用酶联免疫吸附法测定抗PC-BSA的I gM抗体。
[0035]微量滴定板用PC-BSAQO μ g/ml;例如可以购自BiosearchTechnologies, INC (Ca, USA)的磷酸盐缓冲液(PBS)包被。用PBS洗板，然后将板用2%BSA溶液封闭。血清样品用0.2%BSA-PBS稀释(1:30)。将微量滴定板40°C保温过夜，洗板。添加碱性磷酸酶偶联的山羊抗-人IgM(用样品缓冲液稀释成1:7000)，IOOul/孔，40°C保温过夜。洗板后，添加碱性磷酸酶底物，将板于室温避光保温60min，进行显色。在分光光度计中读取405nm处的吸光度。
[0036]测试了磷酸胆碱的不同载体(carrier)和间隔臂(spacer)。载体不限于举例的这些。也可以用本领域已知的其它载体，如蛋白质、脂质或聚合物，例如乳胶珠。载体可以参见上文中提到的US5，455，032。
[0037]由本发明方法检测到的IgM或IgG抗体还可以结合含有暴露在表面的磷酸胆碱(PC)的化合物中的PC,例如溶血磷脂酰胆碱(IysoPC; see, forexample, Kim et al, J ExpMed.2002S印2; 196(5):655-65)中的PC。因此，本发明的方法可以检测与溶血磷脂酰胆碱结合的IgM或IgG抗体。
[0038]合成磷酸胆碱偶联物和制备药物组合物
[0039]将乳胶珠(0.20 μ m或0.81 μ m)悬浮在PBS中，与10 μ g/ml磷酸胆碱-BSA溶液混合过夜。然后将这些珠离心，用缓冲液洗数次，用10 μ g/ml BSA溶液封闭。再洗一次,然后将这些珠重悬于适当的缓冲液中达到适当的浓度，冰箱保存备用。
[0040]带有连接臂的磷酸胆碱也可以借助重氮苯基(diazophenyl)与KLH(匙孔血蓝蛋白)偶联。更优选按照 Chesebro, B.和 Metzger, H.(1972)Biochem.11:776 的方法合成 PC的P-硝基苯基-6-(0-磷酸胆碱)羟基己酸酯衍生物。先将P-硝基苯基-6-(0-磷酸胆碱)羟基己酸酯溶于干乙腈(100mg/ml)，再迅速将其加入KLH中。使衍生物和KLH在4°C混合过夜，然后透析除去未结合的间隔臂和作为离去基团(leaving group)的p_硝基苯(nitrophenylate)。
[0041]将所得磷酸胆碱偶联物悬浮在合适的缓冲液中，制得注射液，其可以直接用于免疫接种。
[0042]用磷酸胆碱偶联物进行免疫接种
[0043]BALB/c小鼠腹腔注射(1.P.) 200 μ g[p-硝基苯基_6-(0_磷酸胆碱)轻基己酸酯-KLH]进行免疫接种，按照建议的免疫分析方法，在所述小鼠血浆中检测到高滴度的识别磷酸胆碱的IgM抗体。
[0044]抗磷酸胆碱偶联物的单克隆抗体
[0045]单克隆抗体可以用本领域已知的任何标准方法制备。例如，可参见“BrilesDE，Forman C，Hudak S，Claflin JL.Ant1-phosphorylcholine antibodies of theT15idiotype are optimally protective against Streptococcus pneumoniae.JExpMed.1982; 156:1177-85，，或“T15PC binding monoclonal antibodies retain specificitywhen they switch from IgM to IgG.，Spira，Gad;Aguila，Hector L ;Scharffj MatthewD.Fac.Med.，Techniton-1srael Inst.Technol.，Haifa, Israel.Journal of Immunology (I988)，140(8)，2675-80。
[0046]其它抗磷酸胆碱偶联物抗体可以用本领域已知的方法制备。例如，可以按照以下的描述，用磷酸胆碱偶联物进行亲和纯化，制得人免疫球蛋白制剂的具有aPC活性的部分(subfraction)。静脉免疫球蛋白制剂(如IGIV; Baxter等)是市面上可以买到的高纯度IgG制剂，可以用于治疗不具有抗体生成能力或者抗体生成能力极低的患者。免疫球蛋白制剂包括可以从以下厂家购买到的那些:Baxter (US) eg Gammagard?, Isiven (Antimo
Naples, Italy),Omrix (Te1-Hashomer，Israel) , Miles(Biological ProductsDivision, West Heaven,CT),Sclavo(Lucca, Italy), Sandoz(Novartis, Basel, Swizerlan
d) eg Sandoglobulin?, l5iotest Diagnostic Corporation (Devilie, NJ) ? 免疫球蛋白制
剂的实例有 Gammagard S/D?, Gammar IV?, Gammar-P IV?, Gammimune N?, Iveegam?,
Panglobulin?, Polygam S/D?, Sandoglobulin?, Venoglobulin?。免疫球蛋白制剂通
常包含一些 IgM，还含有 IgG。Gammagard? 中有很少量 IgM。Pentaglobin(Biotest)是富含IgM的制剂，可用于治疗SARS。具有aPC活性的部分可包含IgG和IgM 二者，或者可以选择主要包含IgG (例如，用Gammagard?等富含IgG的制剂开始，和/或选择IgG)；或主要包含IgM(例如,用Pentaglobin等富含IgM的制剂开始,和/或选择IgM)。
[0047]具有磷酸胆碱偶联物特异性的抗体制剂结合未被偶联的磷酸胆碱，也可以结合含有暴露的磷酸胆碱(PC)的化合物中的PC、例如溶血磷脂酰胆碱(IysoPC;参见，例如，Kimet al, J Exp Med.2002S印2; 196 (5): 655-65)中的PC。因此，具有磷酸胆碱偶联物特异性的抗体制剂也可以结合溶血磷脂酰胆碱。
[0048]动脉粥样硬化受试者中的IgM免疫球蛋白水平
[0049]在动脉粥样硬化风险因子相关研究中，测定高血压患者(舒张压(diastolicpressure) > 95mmHg)中抗磷酸胆碱的IgM自身抗体的基础水平和4年后水平。结果概述如下:
[0050]在刚加入试验时的77例受试者(35%)和4年随访后的84例受试者(38%)中检测到颈动脉斑(Carotid plaque)。该研究共包括218例受试人。中膜-内膜厚度(MT)的增加在随访组中比在那些刚加入试验时具有高血清水平的抗PC IgM(75th* 90th百分点)的患者中少见。MT增加者与减少者之间抗-磷酸胆碱IgM抗体水平均值有显著性差异(638.8 ±219.6 比(vs.) 734.8 ±266.9，p=.004)。
[0051]抗PC的IgM自身抗体与MT变化之间的关系与年龄、吸烟习惯、阿替洛尔(atenolol)或拉西地平(Iacidipine)治疗以及血脂都无关。IgM自身抗体也与IgG水平无关。
[0052]因而本发明的一个实施方案是， 用磷酸胆碱偶联物制备药物组合物，以便在动脉粥样硬化的治疗或预防中应用。所述偶联物可以是磷酸胆碱与蛋白质或聚合物相连。所述药物组合物优选经注射给药。
[0053]本发明建议的主动免疫方法将可以调节自身抗体的滴度，从而在对抗动脉粥样硬化发生方面起到积极有利的作用。
[0054]本发明另一实施方案是，用识别磷酸胆碱偶联物的抗体制剂(例如单克隆抗体)制备药物组合物，以便在动脉粥样硬化的治疗或预防中应用。所述单克隆抗体可以用本领域已知的方法制备。
[0055]本发明另一实施方案是，提供一种用磷酸胆碱偶联物检测抗磷酸胆碱抗体(例如IgM或IgG抗体)存在与否的方法，所述抗体与患缺血性心血管病风险的增加或降低相关。优选的方法是免疫分析方法。所述方法可以用于评估患者发生或进展缺血性心血管疾病的风险。
[0056]具体地，本发明涉及以下方面:
[0057]项1.药物组合物在制备免疫接种和治疗哺乳动物动脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病的药物中的用途，所述药物组合物包含至少一种磷酸胆碱偶联物，或特异性针对磷酸胆碱偶联物的抗体制剂，例如单克隆抗体，所述哺乳动物包括人。
[0058]项2.免疫接种和治疗哺乳动物动脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病的方法，所述方法包括对所述哺乳动物施用药物组合物，所述药物组合物包含至少一种磷酸胆碱偶联物，或特异性针对磷酸胆碱偶联物的抗体制剂，例如单克隆抗体，所述哺乳动物包括人。
[0059]项3.项I的用途或项2的方法，其中所述药物是用于通过注射来施用的药物或者所述组合物通过注射来施用。
[0060]项4.在先任一项的用途或方法，其中磷酸胆碱与载体经由间隔臂连接。
[0061]项5.项4的用途或方法，其中所述载体是蛋白质。
[0062]项6.项5的用途或方法，其中所述蛋白质是KLH(匙孔血蓝蛋白)或人血清白蛋白(HSA)。
[0063]项7.项4的用途或方法，其中所述载体是乳胶珠。
[0064]项8.在先任一项定义的一或多种磷酸胆碱偶联物在制备免疫治疗或治疗缺血性心血管疾病的药物组合物中的用途，所述偶联物可以与佐剂组合或不与佐剂组合。
[0065]项9.预防性治疗或治愈性治疗哺乳动物的方法,所述哺乳动物是指患有动脉粥样硬化或者有患缺血性心血管病的风险的哺乳动物，例如人，所述方法包括施用治疗有效量的至少一种磷酸胆碱偶联物、或特异性针对磷酸胆碱偶联物的抗体制剂，例如单克隆抗体。
[0066]项10.用磷酸胆碱偶联物诊断有无IgM或IgG抗体的方法，所述抗体与患缺血性心血管病风险的增加或降低相关。
[0067]项11.项10的方法，其中磷酸胆碱与载体经由间隔臂连接。
[0068]项12.项11的方法，其中所述载体是蛋白质。
[0069]项13.项12的方法，其中所述蛋白质是KLH(匙孔血蓝蛋白)或人血清白蛋白(HSA)。
[0070]项14.项11的方法，其中所述载体是乳胶珠。
[0071]项15.项10-14之一的方法，其中所述试验是免疫分析。[0072]项16.磷酸胆碱偶联物在评估患者发生或进展缺血性心血管疾病的风险的方法中的用途，在所述方法中，评估所述患者的与磷酸胆碱偶联物反应的IgM或IgG抗体的水平。
【专利附图】
【附图说明】
[0073]图1A:用β 2GPI, PS和CL抑制抗体(IgM)与经过PC白蛋白包被的ELISA-板的结合。通过不同抗原与PC白蛋白包被板的结合来抑制。为研究aPC的特异性，按照试验部分所述进行竞争试验。结果用均值土SD表示。
[0074]图1B:用β 2GPI, PS和CL抑制抗体(IgG)与经过PC白蛋白包被的ELISA-板的结合。通过不同抗原与PC白蛋白包被板的结合来抑制。为研究aPC的特异性，按照试验部分所述进行竞争试验。结果用均值土SD表示。
[0075]图2A:用oxLDL和MDA-LDL抑制抗体(IgM)与经过PC白蛋白包被的ELISA-板的结合。通过不同抗原与PC白蛋白包被板的结合来抑制。为研究aPC的特异性，按照试验部分所述进行竞争试验。结果用均值土SD表示。
[0076]图2B:用oxLDL和MDA-LDL抑制抗体(IgG)与经过PC白蛋白包被的ELISA-板的结合。通过不同抗原与PC白蛋白包被板的结合来抑制。为研究aPC的特异性，按照试验部分所述进行竞争试验。结果用均值土SD表示。
[0077]图3:从IGIV提取的aPC对巨噬细胞中oxLDL摄取的影响
[0078]测试了两组:巨噬细胞加oxLDL，巨噬细胞加已经与从IVIG提取的aPC预保温的oxLDLο
[0079]巨噬细胞+-oxLDL (共107个细胞):
[0080]弱染色37/107=34.58% 强染色 10/107=9.35% 总染色阳性 47/107=43.93%
[0081]巨噬细胞+Dil-oxLDL+aPC-组(检查了 156个细胞):
[0082]弱染色37/156=23.72% 强染色 2/156=1.28% 总染色阳性 39/156=25%
[0083]图3A示Dil-标记的oxLDL染色。图3B显示无标记的oxLDL的染色。
[0084]图4:将高血清滴度抗磷脂抗体(aPL)与人免疫球蛋白集合物Gammagard?.饨保温对膜联蛋白V与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的结合的影响:培养24小时后进行流式细胞术分析
[0085]
【权利要求】
1.磷酸胆碱偶联物在制备用于评估人类患者发生或进展心血管疾病的风险的试剂盒中的用途，其中所述试剂盒是评估所述患者的与磷酸胆碱偶联物反应的抗体的水平的试剂盒。
2.权利要求1的用途，其中所述心血管病是缺血性心血管病。
3.权利要求1的用途，其中所述心血管病是动脉粥样硬化。
4.权利要求1-3之一的用途，其中所述试剂盒是评估所述患者的与磷酸胆碱偶联物反应的IgM抗体的水平的试剂盒。
5.权利要求1-3之一的用途，其中所述试剂盒是评估所述患者的与磷酸胆碱偶联物反应的IgG抗体的水平的试剂盒。
6.权利要求1-5之一的用途，其中磷酸胆碱偶联物是与载体连接的磷酸胆碱，优选经由间隔臂连接。
7.权利要求6的用途，其中所述载体是蛋白质。
8.权利要求7的用途，其中所述蛋白质是KLH(匙孔血蓝蛋白)或人血清白蛋白(HSA)。
9.权利要求6的用途，其中所述载体是乳胶珠。
10.权利要求1-9之一的用途，其中所述试剂盒是进行免疫分析的试剂盒。
【文档编号】C07K16/44GK103743898SQ201310484529
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2005年4月15日 优先权日:2004年4月15日
【发明者】乌尔夫.德费尔, 约翰.弗罗斯特加德 申请人:阿瑟拉生物技术公司