一种磷酸二胆碱化壳聚糖盐及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于抗菌高分子材料技术领域，具体涉及一种磷酸二胆碱化壳聚糖盐及其 应用。
【背景技术】
[0002] 致病性细菌、真菌等微生物严重威胁着人类的身体健康和生命安全，人们一直致 力于研制安全高效的抗菌剂，用于有效地抑制病菌的生长，防止病菌的传播和感染。抗菌剂 可分为无机抗菌剂、有机抗菌剂、天然抗菌剂和合成高分子抗菌剂4大体系。传统的抗菌 剂，如抗生素等，存在诸如对人体有毒，在自然条件下不易降解而影响环境安全，病菌产生 耐药性等缺点，极大地限制了其广泛应用，尤其是在医疗卫生和健康护理领域。因此研制开 发一种对人体无毒且环境友好的高效抗菌剂势在必行。
[0003] 抗菌高分子材料具有长效、广谱抗菌作用，不会诱导病菌产生耐药性，且成本较 低，近年来受到广泛关注。目前研究较多的主要有聚季铵盐、聚卤胺、聚胍、聚季膦盐、壳聚 糖及其衍生物等多种阳离子型高分子抗菌剂。大量研究致力于通过优化高分子的结构，包 括分子量、阳离子基团种类、亲疏水性等，来增强高分子抗菌剂的杀菌活性，同时维持其生 物安全性，即提高抗菌高分子材料的杀菌选择性。
[0004] 壳聚糖是甲壳素的部分或全部脱乙酰基产物，其基本结构单元是氨基葡萄糖残 基，具有无毒、可生物降解、生物相容和抗菌性等许多优点。但壳聚糖在pH > 6. 0的水中溶 解性差，限制其抗菌应用，尤其是在生理环境条件下的使用。季铵化是增强壳聚糖水溶性和 抗菌性的常用改性方法，可以是将壳聚糖骨架上的氨基修饰为季铵盐，如N，N，N-三甲基壳 聚糖（TMC)，或在壳聚糖骨架之外引入季铵基团，如N-[ (2-羟丙基-3-三甲基氨基）丙基] 壳聚糖（HTCC);还可对壳聚糖季铵盐进一步化学修饰改善其抗菌性。但壳聚糖季铵化在提 高其水溶性和抗菌性的同时往往也会增大其细胞毒性，限制了其在医疗卫生和健康护理产 品中的使用。采用细胞膜仿生技术构建的带正电荷的壳聚糖仿生衍生物有望克服现有技术 的不足，获得在生理环境下具有良好生物相容性的抗菌材料。
【发明内容】
[0005] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种磷酸二胆碱化壳聚 糖盐。
[0006] 本发明的另一目的在于提供磷酸二胆碱化壳聚糖盐的应用。
[0007] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0008] 所述的磷酸二胆碱化壳聚糖盐的分子结构如式I所示：
[0009]
[0010] 式I;
[0011] 其中，x/n = 0~0. 2,即壳聚糖的脱乙酰度为80%~100%;磷酸二胆碱基团的取 代度为y/n，不小于25 %;更优选为y/n = 25 %~75% ;n为结构式中重复单元数；R (反离 子R)优选为卤素离子、硝酸根、醋酸根或果酸根离子等。
[0012] 所述的磷酸二胆碱化壳聚糖盐的制备方法，包括如下步骤：
[0013] 将壳聚糖改性得到的6-0-三苯基甲醚化壳聚糖（CsTr)溶于反应介质；加入双取 代胆碱膦酸酯，其中6-0-三苯基甲醚化壳聚糖（CsTr)中的氨基与膦酸酯的摩尔比为1 : (2~10)，（0~40) °C搅拌反应4~24h ;旋干溶剂，加入甲酸，室温搅拌0. 5~6h ;旋干甲 酸，用生理盐水和去离子水透析，冷冻干燥，得到磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐。
[0014] 所述的壳聚糖改性得到的6-0-三苯基甲醚化壳聚糖（CsTr)按照文献 "S. J. Nishmura, 0· Kohgo, K. Kurita, Macromolecules 24 (1991) 4745-4748. " 中的制备方法 制备得到；
[0015] 所述的反应介质优选为二甲基乙酰胺、三乙胺和四氯化碳的混合溶液；其中每 IOOmL二甲基乙酰胺中含有1~IOg的6-0-三苯基甲醚化壳聚糖，其中三乙胺、四氯化碳与 6-0-三苯基甲醚化壳聚糖的氨基摩尔比例优选为6 :4 :1 ;
[0016] 所述的每IOOmL二甲基乙酰胺中优选含有1~2g的6-0-三苯基甲醚化壳聚糖；
[0017] 所述的6-0-三苯基甲醚化壳聚糖（CsTr)中的氨基与膦酸酯的摩尔比优选为1 : (3 ~8);
[0018] 所述的搅拌反应的条件优选为0~40°C搅拌反应12~24h ;
[0019] 所述的室温搅拌的时间优选为2~6h ;
[0020] 所述的双取代胆碱膦酸酯由氯化胆碱和对苯氧基膦酸酯按摩尔比2 :1在二甲亚 砜/吡啶混合溶剂中反应2小时制得；
[0021] 本发明所述的磷酸二胆碱化壳聚糖盐在制备抗菌药物或抗菌材料中的应用。
[0022] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0023] 本发明所述的磷酸二胆碱化壳聚糖盐在生理环境条件下具有显著的广谱抗菌效 果，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，且对正常细胞无毒，不产生溶血，在医疗及健康护 理领域有重要的应用价值。
【附图说明】
[0024] 图1是磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐的1H NMR谱图。
[0025] 图2是磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐的31P NMR谱图。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0027] 实施例1磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐合成
[0028] 取200mg由壳聚糖（x/n = 0)改性得到的6-0-三苯基甲醚化壳聚糖（CsTr)溶于 IOmL无水二甲基乙酰胺，同时加入0. 42mL的三乙胺和0. 19mL的四氯化碳；缓慢加入0. 46g 双取代胆碱膦酸酯，其中CsTr中的氨基与膦酸酯的摩尔比为1 :3, (TC搅拌反应12小时；旋 干溶剂，加入甲酸，室温搅拌2小时；旋干甲酸，用生理盐水和去离子水透析，冷冻干燥，得 到磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐。其中磷酸二胆碱基团的取代度为25%，核磁氢谱（ 1H NMR) 如图1所示；31P NMR谱图如图2所示。
[0029] 实施例2磷酸二胆碱化壳聚糖醋酸盐的制备。
[0030] 取300mg由壳聚糖（x/n = 0. 1)改性得到的6-0-三苯基甲醚化壳聚糖（CsTr) 溶于30mL无水二甲基乙酰胺，同时加入0. 63mL的三乙胺和0. 29mL的四氯化碳；缓慢加入 1.84g双取代胆碱膦酸酯，其中CsTr中的氨基与膦酸酯的摩尔比为I :8,40°C搅拌反应24 小时；旋干溶剂，加入甲酸，室温搅拌6小时；旋干甲酸，用醋酸钠水溶液和去离子水透析3 天，冷冻干燥，得到磷酸二胆碱化壳聚糖醋酸盐。其中磷酸二胆碱基团的取代度为75 %。 [0031 ] 实施例3磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐的抑菌性能评价
[0032] 以大肠杆菌（Escherichia coli)(市售）（革兰氏阴性菌）和金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)(市售）（革兰氏阳性菌）为细菌模型，采用两倍稀释法测定实施 例1制备的磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐（取代度=25% )在37°C，pH = 7条件下的最低 抑菌浓度（MIC)。结果是：磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐对大肠杆菌的MIC = 15 μ g/mL，对金 黄色葡萄球菌的MIC = 20 μ g/mL。磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐表现出良好的抗菌性。
[0033] 实施例4磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐的细胞相容性评价
[0034] 以小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3(赛业（广州）生物科技有限公司）为细胞模型， 与不同浓度的实施例1制备的磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐（取代度=25% )共孕育24小 时，采用MTT法测定其增殖率。结果表明：浓度小于等于2000 μ g/mL的磷酸二胆碱化壳聚 糖盐酸盐（取代度=25% )共培养的NIH/3T3增殖率都大于75%，即磷酸二胆碱化壳聚糖 盐酸盐（取代度=25% )的IC5。值大于2000 μ g/mL，表明其具有良好的细胞相容性。
[0035] 实施例5磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐的溶血率评价
[0036] 取新鲜兔红细胞（RBCs)(新西兰大白兔，由广东省医学动物实验中心提供）lmL， 用 9mL HEPES(10mM HEPES，150mM NaCl，pH 7)稀释，1000 g离心 5min后用移液枪弃上清液， 重复2次，弃去上清液后再加入29mL HEPES配置成3. 3 % V/V的RBCs溶液。取1块96孔 板，每孔移入90 μ L RBCs溶液，加入10 μ L系列浓度（最大浓度：2000 μ g/mL)的实施例1 制备的磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐（取代度=25% )，HEPES溶液作为阴性对照组，1% v/ V Triton X-100溶液作为阳性对照组，37°C IOOrpm下孵育lh。将96孔板置于孔板离心机 中以1000 rpm离心10min后每孔取出10 μ L上清液加入每孔含有90 μ L HEPES的新96孔 板，酶标仪以405nm读数。溶血率计算公式如下：
[0038] 式中A为实验组吸光度值，A。为阴性对照组吸光度值，A1。。为阳性对照组吸光度值。
[0039] 结果表明：浓度小于等于2000 μ g/mL的磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐（取代度= 25% )的溶血率均小于2%，表明其具有良好的血液相容性。
[0040] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种磷酸二胆碱化壳聚糖盐，其特征在于：其分子结构如式I所示：其中，x/n = 〇~〇. 2,即壳聚糖的脱乙酰度为80%~100%;磷酸二胆碱基团的取代度 为y/n，不小于25% ;n为结构式中重复单元数；R为卤素离子、硝酸根、醋酸根或果酸根离 子。2. 权利要求1所述的磷酸二胆碱化壳聚糖盐的制备方法，其特征在于包括如下步骤： 将壳聚糖改性得到的6-0-三苯基甲醚化壳聚糖溶于反应介质；加入双取代胆碱膦酸 酯，搅拌反应；旋干溶剂，加入甲酸，室温搅拌；旋干甲酸，用生理盐水和去离子水透析，冷 冻干燥，得到磷酸二胆碱化壳聚糖盐酸盐。3. 根据权利要求2所述的磷酸二胆碱化壳聚糖盐的制备方法，其特征在于： 所述的6-0-三苯基甲醚化壳聚糖中的氨基与膦酸酯的摩尔比为1 : (2~10)。4. 根据权利要求2所述的磷酸二胆碱化壳聚糖盐的制备方法，其特征在于： 所述的搅拌反应的条件为〇~40°C搅拌反应4~24h。5. 根据权利要求2所述的磷酸二胆碱化壳聚糖盐的制备方法，其特征在于： 所述的室温搅拌的时间为0. 5~6h。6. 根据权利要求2所述的磷酸二胆碱化壳聚糖盐的制备方法，其特征在于： 所述的反应介质为二甲基乙酰胺、三乙胺和四氯化碳的混合溶液；其中每l〇〇mL二甲 基乙酰胺中含有1~l〇g的6-0-三苯基甲醚化壳聚糖，其中三乙胺、四氯化碳与6-0-三苯 基甲醚化壳聚糖的氨基摩尔比例为6 :4 :1。7. 权利要求1所述的磷酸二胆碱化壳聚糖盐在制备抗菌药物或抗菌材料中的应用。
【专利摘要】本发明公开一种磷酸二胆碱化壳聚糖盐及其应用，属于抗菌高分子材料技术领域。本发明的磷酸二胆碱化壳聚糖盐在生理环境条件下具有显著的广谱抗菌效果，包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，且对正常细胞无毒，不产生溶血，在医疗及健康护理领域有重要的应用价值；可应用于制备抗菌药物或抗菌材料。
【IPC分类】A61P31/04, C08B37/00
【公开号】CN105384835
【申请号】CN201510769660
【发明人】曾戎, 曹兆羽, 屠美, 赵剑豪
【申请人】暨南大学
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年11月11日