一种酶法制备甘油磷酸胆碱的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酶法制备甘油磷酸胆碱的方法。
【背景技术】
[0002]L-α -甘油磷酸胆碱(CAS号28319-77-9)是自然界中天然存在的物质，是由构成生物细胞膜的主要磷脂成分磷脂酰胆碱(PC)去除2个脂肪酸产生的水溶性物质。甘油磷酸胆碱在生物体内广泛存在，是人的母乳及体液的组分之一。2009年的食品药品分类修订中，将甘油磷酸胆碱定义为食品。近年来科学研宄表明L-α-甘油磷酸胆碱还具有重要的医药价值，它能够改善和提高脑部的认知能力，在青少年的生长发育和记忆力提高等方面都具有一定的功效，甚至还可以在一定程度上修复早期的阿尔茨海默症引起的认知能力损伤。目前L-α-甘油磷酸胆碱在医药中主要应用于消化系统药物和肝病辅助用药。这些重要的医药和保健价值，使得L-α -甘油磷酸胆碱在医药和保健食品领域有着越来越广泛的应用，其市场需求也越来越大。
[0003]天然存在的L-α-甘油磷酸胆碱非常少，一般只存在于动物的器官和乳汁中，更多的需求只能通过工业生产来满足。近年来研宄表明可通过天然磷脂中的PC为原料，去除分子中的脂肪酸(脱酰基)而获得L-a-GPC。磷脂和甘油磷酸胆碱对热均不稳定，因此，以PC为底物通过水解或醇解反应制备L- a -GPC时需要在相对温和的条件下进行。有研宄利用四丁基氢氧化铵为催化剂，水解卵磷脂制备L- a -GPC，工艺过程复杂，成本较高，不易实现规模化生产。与化学法相比，生物酶法反应条件温和，工艺简单，适合商业化规模生产。专利(申请号201010248594.X)公开了利用磷脂酶水解卵磷脂制备甘油磷酸胆碱的方法，可以在水相中将磷脂酰胆碱转化成甘油磷酸胆碱。
[0004]由于磷脂酶A水解磷脂中的脂肪酸时对其具有位置专一性，例如磷脂酶Al专一性地水解PC中Sn-1位脂肪酸，而产生大量的Sn-2溶血磷脂；磷脂酶A2专一性地水解Sn_2位的脂肪酸，产生大量的Sn-1溶血磷脂；继续催化溶血磷脂发生水解时需要先进行一步酰基转移，才能将剩余的脂肪酸全部水解下来。这就使得GPC的产生速率和PC利用程度非常依赖于反应中间产物溶血磷脂酰胆碱(LPC)酰基转移的速率，而研宄表明，在较低的温度下溶血磷脂中酰基转移的速率非常缓慢。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种酶法制备甘油磷酸胆碱的方法。偏甘油酯脂肪酶是脂肪酶的一种，具有特殊的底物特异性，可以催化甘油二酯(DAG)和单甘油酯(MAG)发生反应，不能催化甘油三酯(TAG)发生反应。本研宄经过大量的试验证实部分偏甘油酯脂肪酶在适宜的反应条件下可以水解或醇解溶血磷脂中的脂肪酸酰基。该方法采用偏甘油酯脂肪酶和磷脂酶联合催化磷脂中的磷脂酰胆碱与水或其他羟基供体发生反应生产制备L-α -甘油磷酸胆碱，反应产物经过分离纯化后即可得到L-α -甘油磷酸胆碱。该方法可以显著提高酶的催化效率、产品的得率和底物的利用率。
[0006]本发明目的通过以下技术方案实现:
[0007]一种酶法制备甘油磷酸胆碱的方法，包括以下步骤:
[0008](I)将含有磷脂酰胆碱的磷脂与羟基供体、磷脂酶、偏甘油酯脂肪酶混合后，进行水解或醇解反应；所述磷脂酶为磷脂酶A和磷脂酶B中的一种或两种的混合物；
[0009](2)分离反应产物，回收甘油磷酸胆碱。
[0010]所述偏甘油酯脂肪酶为偏甘油酯脂肪酶Lipase SMGl和Lipase G中的一种或两种的混合。
[0011]所述磷脂酶和偏甘油酯脂肪酶的质量比为0.1:1?1:10 ;所述磷脂酶的质量分数为0.1?1% O
[0012]步骤(I)所述反应的时间为30?120分钟，pH为4-8，温度为10_50°C。所述pH可通过添加已知的缓冲液实现。
[0013]所述反应的时间为45?60分钟，pH为6_8，温度为20-50°C。
[0014]所述反应的温度为30-45 °C。
[0015]所述羟基供体为水或短链一元醇。
[0016]所述羟基供体与磷脂酰胆碱的摩尔比不低于2:1。
[0017]所述磷脂酶不包括磷脂酶C和磷脂酶D。
[0018]本发明所采用的磷脂可以是来源于大豆磷脂、蛋黄磷脂、虾油磷脂中的一种或一种以上的混合物，也可以是通过酶法或物理、化学法纯化后的磷脂混合物。所述酶一起添加至反应体系中，可控制酶催化反应条件(如温度、PH、搅拌时间和底物摩尔比)，进而优化出特定的磷脂底物适用的反应参数组合。
[0019]本发明所采用的回收甘油磷酸胆碱的方法可以是溶剂萃取、柱层析，也可以是一种方法以上的综合使用。
[0020]本发明与现有技术相比，具有如下优点:
[0021]本发明涉及磷脂酶和偏甘油酯脂肪酶一起用于酶反应，催化底物中磷脂酰胆碱去除脂肪酸酰基制备甘油磷酸胆碱。当采用偏甘油酯脂肪酶与磷脂酶一起使用时磷脂酰胆碱的转化率、酶反应速率和甘油磷酸胆碱的得率远高于磷脂酶单独使用时，其中底物中的磷脂酰胆碱的转化率可以达到95%以上，反应持续时间可以少于一个小时。
【具体实施方式】
[0022]以下通过实施例更详细地介绍本发明的实施。在所述实施例中，所有百分比均以质量计。本发明所用偏甘油酯脂肪酶Lipase SMGl为实验室自制，已被Wang ff-f, Li T1QinX-1j Ning Ζ-χ, Yang B，Wang Y-h.Product1n of lipase SMGland its applicat1n insynthesizing diacylglyecrol[J].Journal of Molecular Catalysi s B:Enzymatic2012 ;77:87-91文献公开，申请人向社会提供。
[0023]对比实施例1
[0024]取20g的磷脂混合物(PC含量为85 %，LPC的含量为0.7%，GPC的含量为0.1%，由蛋黄磷脂提取制得)，添加500ml的pH为6.5的缓冲液(0.25M柠檬酸-NaOH)，添加0.2g的磷脂酶Lecitase Ultra(诺维信公司产品，具有磷脂酶Al活力)，并将混合物均质I分钟。将反应混合物在40°C下正常搅拌I小时。然后利用液相色谱分析酶反应产物得到PC的含量为17.2%，LPC的含量为24.7%, GPC的含量为38.6%, GPC的得率为45.4%。
[0025]对比实施