长效干扰素-α及其改造方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及蛋白质工程领域，具体涉及融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉 及由具有人干扰素 Ct活性的融合蛋白及其编码基因的改造优化，以及该融合蛋白的表达 方法和在制备治疗病毒性肝炎以及其它抗病毒药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 干扰素 -a (IFN-α )是一种具有多种功能的免疫活性糖蛋白，具有良好的抗病 毒、抗肿瘤等作用。重组人干扰素长期用于病毒性肝炎和肿瘤的治疗，在乙肝和丙肝治 疗中具有不易抗药、效果持久等特点，是目前各国抗病毒治疗指南中的一线药物。传统重组 人干扰素 α由于分子量较小（ISkDa)，容易被肾小球过滤以及血清蛋白酶降解，从而造成 在人体中的半衰期较短，导致频繁注射给药和副作用较大等缺点。为了克服这个缺点，先灵 複雅（Schering-Plough,现被默克公司收购）和罗氏公司（Roche)先后开发了聚乙二醇 (PEG)化的长效干扰素（商品名分别为：配乐能、派罗欣），成功将其半衰期延长了 10倍以 上。
[0003] 除了 PEG化以外，HAS或Fc融合蛋白可以通过与FcRn的相互作用以及增大 蛋白质分子量等方式来延长重组蛋白的半衰期。临床研究证实，HAS融合的长效干扰 素 -a Albufero(Human Genome Sciences)虽然半衰期比派罗欣有所延长，但是其活性太 低，用量太大，造成安全隐患。这个现象提示，如能开发出生物活性与派罗欣相当、半衰期 又适当延长的新型长效干扰素-α，那么将具有较强的市场竞争力和广阔的前景。目前已 经有数个Fc融合蛋白长效药物上市，如全球畅销药Enbrel (TNFR-Fc)。最近百健艾迪公司 (Biogen Idec)开发的重组VID因子和K因子与抗体Fc段的融合蛋白均成功获得FDA批准上 市，极大的鼓舞了 Fc融合技术用于开发长效融合蛋白药物的信心。
[0004] 本课题组研究人员经过长期的研究积累，利用IgGl的Fc片段与IFNa -2b连接 构成融合蛋白IFN-α/Fe,以提高IFN-α的体内半衰期。此前已经初步完成了长效干扰素 IFN-a /Fe的理化性质的鉴定，抗病毒活性的研究和大鼠体内半衰期研究，并已经获得相关 发明专利（肖卫华、王磊，授权公告号：CN 1944463 B)。但是Fc片段结构复杂，具有二硫键 和糖基化修饰，往往需要采用哺乳动物细胞进行表达，产业化成本昂贵。为了解决生产成本 的问题，我们利用毕赤酵母表达系统来生产的IFN- a /Fe融合蛋白。但是抗体分子的Fc段 存在N-糖基化位点，不过这个位点并不影响其与FcRn的结合。
【发明内容】
[0005] 在本发明中，为了避免酵母甘露糖型的糖基化修饰潜在的抗原性，本发明进一步 对Fc片段的297位糖基化位点（N)进行了基因定点突变（N突变成Q)，并在IFN- a与Fc 连接处引入了一段免疫惰性的柔性肽，构建出糖基化位点突变并含有柔性连接肽的新长效 干扰素 a (IFN-a/Fc-MD)。最近有研究指出（Tianlei Ying, et al·，Soluble Monomeric IgGlFc, J. Biol. Chem. 2012, 287:19399-19408)，Fe 片段与 FcRn 的结合并不依赖于其双 链结构，且考虑到干扰素分子本来就是以单体形式发挥生物学作用，故本研究又构建了 单链Fc片段与IFNa-2b的融合蛋白（IFN-a/Fc-SC)。本发明完成了上述两种新型的 IFN-a /Fe融合蛋白的设计、构建、表达和纯化，并将其与此前构建的IFN-a /Fe融合蛋白 IFNa 2b_Fc γ I (IFN-a /Fc-WT)以及市场上的派罗欣（PEG-IFN-a )进行药效学和药代动 力学的比较，以确定最优的蛋白设计形式（三种IFN-a /Fe融合蛋白的结构示意图如图1 所示）。
[0006] 具体地，本发明涉及以下各项：
[0007] 1. -种长效干扰素 -a融合蛋白，其由干扰素 -a分子与IgGl抗体分子Fe段突 变体连接而成，其中，所述突变为IgGl第297位天冬酰胺突变成谷氨酰胺。
[0008] 2.根据第1项所述的长效干扰素-a融合蛋白，其中所述IgGl抗体分子Fe段的 铰链区氨基酸被柔性多肽替代。
[0009] 3.根据第2项所述的长效干扰素-a融合蛋白，其中
[0010] I)Fe段的铰链区N-末端8个氨基酸EPKSCDKT(SEQ ID NO: 1)被替换为 GGGGSGGG(SEQ ID N0:2);或
[0011] 2)Fc段的铰链区N-末端15个氨基酸EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID N0:3)被替换成 免疫惰性软肽 GGGGSGGGGS(SEQ ID N0:4)。
[0012] 4.根据第3项所述的长效干扰素-a融合蛋白，其中
[0013] 在1)的情况下，所述IgGl抗体分子Fe段是人IgGl第231 (Ala)至447 (Lys)位 的氨基酸序列；
[0014] 在2)的情况下，所述IgGl抗体分子Fe段是人IgGl第224至447位的氨基酸序 列。
[0015] 5.根据第1项所述的长效干扰素-α融合蛋白，所述干扰素-α是人干扰 素 -a 2b。6.根据第3项所述的长效干扰素-α融合蛋白，其氨基酸序列为以下各项之一：
[0016] 1)SEQ ID NO ：5 ；
[0017] 2)SEQIDN0:6。
[0018] 7.编码第1-6项中任一项所述的长效干扰素-α融合蛋白的基因。
[0019] 8.根据第7项所述的基因，其核酸序列为SEQ ID NO :7或SEQ ID NO :8。
[0020] 9.包含第7项所述的基因的重组表达载体、转基因细胞系和重组菌，所述细胞系 优选为毕赤酵母系。
[0021] 10.第1-6项任一项所述的长效干扰素-α融合蛋白用于制备药物的用途，所述药 物用于提高机体免疫力，抗病毒或抗肿瘤。
[0022] 本发明的IFN- a /Fc-MD的抗病毒活性略高于IFN- a /Fc-WT，略低于商品化长 效干扰素派罗欣PEG-IFN- α (相当于PEG-IFN- α的66 %~85 %活性），但是大鼠体内 循环半衰期显著长于派罗欣PEG-IFN-α，并可推测在人体内将更加显著的长于派罗欣 PEG-IFN-a ;同时，本发明的IFN-a /Fc-SC的抗病毒活性高于商品化长效干扰素派罗欣 PEG-IFN- a (相当于PEG-IFN- α的158 %~186 %活性）和IFN- a /Fc-WT，尽管在大鼠体 内循环半衰期略低于派罗欣PEG-IFN-a，但是可以推测在人体内的循环半衰期将长于派罗 欣 PEG-IFN-α。
【附图说明】
[0023] 图1.三种不同结构形式的IFN-a /Fe融合蛋白示意图；
[0024] 图2. IFN- a /Fc-WT融合蛋白表达克隆筛选；
[0025] (A)DB, Dot blot,点杂交；（B)WB :Western blot，免疫印记（抗人 Fe 抗体）；
[0026] 图3. IFN- a /Fc-WT融合蛋白发酵表达；
[0027] ㈧发酵过程中菌体生长曲线；
[0028] (B)目的蛋白累积时间点检测；
[0029] 图4. IFN- a /Fe融合蛋白纯化与理化鉴定；
[0030] (A) IFN- a /Fe 融合蛋白纯度 SDS-PAGE 检测；
[0031] (B) IFN- a /Fe 融合蛋白 IFN- α 片段和 Fe 片段 Western blot 检测；
[0032] (C) IFN- a /Fe融合蛋白糖基化修饰PAS染色检测；
[0033] 图5. IFN- a /Fe融合蛋白抗病毒活性检测：
[0034] (A) WISH-VSV系统测定IFN- a /Fe融合蛋白抗病毒活性；
[0035] ⑶MDBK-VSV系统测定IFN- a /Fe融合蛋白抗病毒活性；
[0036] 图6. IFN- a /Fe融合蛋白刺激PBMC转录OASl活力比较；
[0037] 图7. IFN- a /Fe融合蛋白抗肿瘤细胞增殖活性检测；
[0038] 图8. IFN-a /Fe融合蛋白大鼠体内循环半衰期检测。
【具体实施方式】
[0039] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0040] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从标注的商业途径得到。
[0041] 下述实施例中的所有引物合成和测序工作均由上海生工完成；毕赤酵母相关载体 和菌株均来源于 Invitrogen (Life technologies);培养基配方参见 Pichia Expression Kit，A Manual of Methods for Expression of Recombinant Proteins in Pichia pastoris，Invitrogen) 〇
[0042] 实施例1、新型长效干扰素 IFN- a /Fe的融合蛋白表达载体构建
[0043] 一、IFN- a /Fe融合基因的扩增
[0044] 以本实验室之前构建并保存的质粒pPIC9K-Kex-IFNa 2b_Fc γ 1 (详情参见王磊 等，Chin J Biotech 2008, January 25 ;24(1) :53-62)为模板，使用引物 a-Fw和Fc-Rv(所 有引物序列见表1)，扩增目的基因。扩增产物同样采用核酸凝胶回收试剂盒（Axygen公司， 以下同）回收。此基因产物两端带有BamH I和EcoR I酶切位点，命名为IFN-a /Fc-WT。
[0045] 使用质粒pPIC9K-Kex_IFN a 2b_Fc γ 1为模板，使用三对引物a -Fw与SC-Rv、 SC-Fw与M-Rv、M-Fv与Fc-Rv分别扩增目的基因的三个片段。PCR程序设定为：94°C 2分 钟，94°C 30秒，55°C 40秒，72°C 60秒，以上程序32个循环，72°C 10分钟。扩增产物采用凝 胶回收试剂盒回收，操作步骤参见试剂盒说明。将回收所得三段基因混合作为模板，以引 物对a -Fw与Fc-Rv拼接完整基因。PCR程序设定为：94°C 5分钟，94°C 30秒，55°C 40秒， 72°C 120秒，以上程序32个循环，72°C 10分钟。扩增产物同样采用核酸凝胶回收试剂盒回 收。此基因产物两端带有BamH I和EcoR I酶切位点，命名为IFN-a/Fc-SC。