人干扰素α类似物和干扰素τ的低毒长循环的嵌合体的制作方法

专利名称：：人干扰素α类似物和干扰素τ的低毒长循环的嵌合体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种聚合物修饰的干扰素a的蛋白类似物，还涉及一种体内去除率较低的低毒人干扰素a类似物，以及使用这些类似物的治疗方法。
背景技术：
：干扰素(IFNs)分为两个不同的组I型干扰素，包括IFNa、IFN(3、IFNt和IFNco(还称作IFNaII);II型干扰素，表示为IFNy(reviewedbyDeMaeyer,E.,etal.，INTERFERONSANDOTHERREGULATORYCYTOKINES,JohnWileyandSons,NewYork(1988))。人干扰素a(HuIFNa)为I型干扰素，由大约25个已知的不同亚型组成。这些人干扰素a为具有广谱抗病毒、抗增殖和免疫调节功能的高度多效性细胞因子。特别地，它们能够抑制多种含有RNA和DNA的病毒的复制；还能够抑制恶性细胞的生长；并影响多种致癌基因的表达；以及激活天然杀伤细胞。HuIFNa的亚型HuIFNa2已经被用于治疗多种病毒性疾病和癌症。然而，在被施以具有疗效所需的剂量时，患者经常产生包括"感冒症状"、不适、厌食、中性粒细胞减少症和肝功能异常在内的副作用。很多患者由于无法忍受这样的副作用从而放弃了使用干扰素a的治疗。人们尝试提供一种不会引起副作用的干扰素a，结果开发了，例如，混合干扰素(hybridIFNs)、组合干扰素a(consensusIFNa)和长效干扰素(long-actinginterferons),例如聚乙二醇化的干扰素a(pegylatedIFNa)。被聚乙二醇(PEG)修饰的干扰素a的例子包括聚乙二醇化的干扰素a-2b(PEGIntmn②)和a-2a(Pegasys⑧)，其中12kDa的聚乙二醇或40kDa的支链聚乙二醇各自分别与干扰素a连接。然而，这些聚乙二醇修饰的干扰素a的安全性与相应的天然蛋白的安全性相似或更差(BukowskiR.M.etal.,Cancer,95(2):389-96(2002);BukowskiR.M.etal.,JournalofClinicalOncology;20(18):3841-3949(2002);Motzer，R丄etal.，J.Clin.Oncol"19(5):1312-9(2001);TongM丄，JournalofInterferonandCytokineResearch,18:81-86(1998);YaoG.B.etal，JournalofGastroenterologyandHepatolog"15:1165-1170(2000);HeathcoteE丄etal，N.Engl.J.Med.，343(23):1673-80(2000);TongMJ.etal.,Hepatology;26(3):747画54(1997》。最普遍报道的不良反应为恶心、厌食、乏力和发冷，这些症状的发生是与剂量相关的。另外，长期治疗期间，在PEGIntror^的施用剂量为7.5吗/kg或更高时，观察到了包括严重的乏力、神经毒性、肝功能异常和骨髓抑制在内的剂量限制性毒性(BukowskiR.M.etal.，Cancer;95(2):389-96(2002))。甚至所有的患者都无法忍受剂量大于9吗的组合干扰素a，需要对一些患者减少剂量以完善石开究(YaoG.B.etal.，JournalofGastroenterologyandHepatolog.，15:1165-1170(2000))。因此，现有的聚乙二醇化形式的干扰素a和组合干扰素a无法解决干扰素治疗中的毒性问题。在该领域中，需要改良的聚合物修饰的干扰素a。
发明内容一方面，提供了一种组合物，该组合物含有与至少一种亲水聚合物链共价结合的天然人干扰素a的蛋白类似物。在一实施方式中，所述亲水聚合物链为聚乙二醇。所述聚乙二醇可以为直链的或支链的。在另一实施方式中，所述蛋白类似物为天然人干扰素a-d的蛋白类似物。在另一实施方式中，所述蛋白类似物为天然人干扰素a-2b的蛋白类似物。在另一实施方式中，所述蛋白类似物的氨基酸序列在位点19、20、22、24和27中的一个或多个位点上与天然人干扰素a-2b的氨基酸序列不同。在一优选实施方式中，所述蛋白类似物具有如SEQIDNO:48所示的序列。另一方面，提供了一种病毒感染的治疗方法。该方法包括以能够有效地治疗感染的给药量对患有病毒感染的患者使用与至少一种亲水聚合物链共价结合的天然人干扰素a的蛋白类似物进行给药。在一实施方式中，所述病毒感染选自肝炎病毒感染、人乳头瘤病毒感染、疱疹病毒感染和人免疫缺陷病毒感染。在一具体实施方式中，所述肝炎病毒感染为丙型肝炎病毒感染或乙型肝炎病毒感染。在一实施方式的方法中，所述蛋白类似物可以通过肠道外进行给药。在一实施方式中，所述给药的方式可以为至少每周一次。给药剂量可以进行调整，但在一实施方式中，所述蛋白类似物的给药剂量为每周至少200^ig。在一替代性的实施方式中，所述蛋白类似物可以以450或900吗的给药剂量来每周给药一次或每两周给药一次。又一方面，提供了一种病毒感染的治疗方法。该方法包括对患有病毒感染的患者使用与至少一种亲水聚合物链共价结合的天然人干扰素a的蛋白类似物进行给药，该蛋白类似物的给药频率使该蛋白类似物的血浆浓度基本上保持稳定，由此所述施药对肝细胞没有细胞毒性作用。在又一实施方式中，提供了一种药物组合物，该组合物含有化学修饰的药用蛋白；还提供了一种试剂盒，该试剂盒含有所述药物组合物。在另外一个实施方式中，提供了一种使用在此描述的组合物通过例如抑制肿瘤生长或病毒复制来治疗疾病的方法或治疗自身免疫性疾病的方法。另一方面，提供了一种增生性病变(proliferativedisorder)的治疗方法。该方法包括以能够有效地治疗病变的给药量对患有增生性病变的患者使用与至少一种亲水聚合物链共价结合的天然人干扰素a的蛋白类似物进行给药。图1显示了成熟的人IFN(xD、成熟的羊IFNt和8个称作IFNa-N0至IFNa-N7的IFNa类似物的前27个N-末端氨基酸残基的比对；图2为用于制备指定的IFNa类似物IFNa-N0至IFNa-N7的载体的图表;构建编码每种类似物的合成基因并将该合成基因插入至pPICZa载体中，得到称作NLV的表达载体；编码每种类似物的合成基因是通过将含有预期的核苷酸替换的长度约为150个碱基对的寡核苷酸形成片段按顺序结合而得到的。然后将核苷酸片段连接至构建体的Xhol/EcoRI位点，从而在pPICZa载体背景中得到不同的类似物；图3为示例性的混合干扰素融合蛋白的示意图；图4A-4B为柱状图，该柱状图显示了通过一定浓度的IFNa2b(IntronA，空白柱，图4A)、IFNa类似物IFNa2b-N7(带点的柱，图4A);或IFNa2b-N7-PEG(40kDa)(带点的柱，图4B)、IFNa2a-PEG(40kDa)(Pegasys,空白柱，图4B)培养的人外周血单核细胞的具体细胞死亡百分数；图5A-5B显示了IFNa2b-N7(SEQIDNO:48,带点的柱)禾卩IFNa2b(IntronA，空白柱)(图5A);以及PEG(40kDa)-IFNa2b-N7(带点的柱)和IFNa2a-PEG(40kDa)(Pegasys，空白柱)(图5B)对原发性人肝细胞的影响，该原发性人肝细胞在检测代谢活性之前在干扰素存在的情况下培养7天；图6显示了以107U/kg的剂量给药PEG(40kDa)-IFNa2b-N7(正方形)或IFNa2a-PEG(40kDa)(Pegasys气菱形)之后，鼠的血药浓度(ng/ml)与给药后的时间(小时)之间的函数关系；图7A显示了裸鼠被植入肾癌细胞并以每周三次的剂量给药IFNa类似物IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)(106和107U/Kg)或IntronA(106和107U/Kg)后，从植入起至第28天中检测到的肿瘤体积曲线图下的面积；图7B显示了裸鼠被植入肾癌细胞并以每周三次的剂量给药PEG(40kDa)-IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)(106和107U/Kg)或Pegasys(106和107U/Kg)后，从植入起至至28天之间检测到的肿瘤体积曲线图下的面积；图8A显示了植有人乳腺癌肿瘤移植物的鼠体内肿瘤的体积(mm"与由下列物质治疗后的时间(天)之间的函数关系生理盐水(菱形)、每周107U/kg剂量的PEG(40kDa)-IFN(x2b-N7(正方形)、每两周107U/kg剂量的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7(三角形)和每两周108U/kg齐U量的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7(圆形)；图8B为柱状图，该柱状图显示了裸鼠被植入原发性乳腺癌肿瘤细胞(HCC1954)并以每两周107禾Q1()Su/kg的剂量，或以每周1(^U/kg的剂量给药PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的从移植后第四天起至第28天之间检测到的肿瘤体积曲线图下的面积。序列说明SEQIDNO:l为人干扰素a(HuIFNa)的残基19-27之间的氨基酸序列。SEQIDNO:2为羊干扰素t(OvIFNt)的残基19-27之间的氨基酸序列。SEQIDNO:3为人干扰素ad的残基11-27之间的氨基酸序列。SEQIDNO:4为羊干扰素t的残基11-27之间的氨基酸序列。SEQIDNO:5为人干扰素ad的残基6-27之间的氨基酸序列。SEQIDNO:6为羊干扰素t的残基6-27之间的氨基酸序列。SEQIDNO:7为人干扰素a的残基1-27之间的氨基酸序列。SEQIDNO:8为羊干扰素的残基1-27之间的氨基酸序列。SEQIDNO:9为成熟人干扰素a(IFNa-d;GenBankAccessionNo.J00210,PIDg386796)的氨基酸序列。SEQIDNO:10为干扰素a类似物IFNad-NO的氨基酸序列。SEQIDNO:ll为干扰素a类似物IFNad-N0的残基1-27之间的氮基酸序列。SEQIDNO:12为干扰素a类似物IFNad-Nl的氨基酸序列。SEQIDNO:13为干扰素a类似物IFNad-Nl的残基1-27之间的氨基酸序列。SEQIDNO:14为干扰素a类似物IFNad-N2的氨基酸序列。SEQIDNO:15为干扰素a类似物IFNad-N2的残基1-27之间的氨基酸序列。SEQIDNO:16为干扰素a类似物IFNad-N3的氨基酸序列。SEQIDNO:17为干扰素a类似物IFNad-N3的残基1-27之间的氨基酸序列。SEQIDNO:18为干扰素a类似物IFNad-N4的氨基酸序列。SEQIDNO:19为干扰素a类似物IFNad-N4的残基1-27之间的氨基酸序列。SEQIDNO:20为干扰素a类似物IFNad-N5的氨基酸序列。SEQIDNO:21为干扰素a类似物IFNad-N5的残基1-27之间的氨基酸序列。SEQIDNO:22为干扰素a类似物IFNad-N6的氨基酸序列。SEQIDNO:23为干扰素a类似物IFNad-N6的残基1-27之间的氨基酸序列。SEQIDNO:24为干扰素a类似物IFNad-N7的氨基酸序列。SEQIDNO:25为干扰素a类似物IFNad-N7的残基1-27之间的氨基酸序列。SEQIDNO:26为成熟羊干扰素t(OvIFNt)(oTP-1;GenBankAccessionNo.Y00287;PIDgl358)的氨基酸序列。SEQIDNO:27为编码类似物IFNad-NO的合成基因的核苷酸序列。SEQIDNO:28为接头1的核苷酸序列。SEQIDNO:29为接头2的核苷酸序列。SEQIDNO:30为Nl类似物的残基1-27之间的核苷酸序列，正义链(forwardstrand)。SEQIDNO:31为片段N1的核苷酸序列，反义链(reversestrand)。SEQIDNO:32为片段N2的核苷酸序列，正义链。SEQIDNO:33为片段N2的核苷酸序列，反义链。SEQIDNO:34为片段N3的核苷酸序列，正义链。SEQIDNO:35为片段N3的核苷酸序列，反义链。SEQIDNO:36为片段N4的核苷酸序列，正义链。SEQIDNO:37为片段N4的核苷酸序列，反义链。SEQIDNO:38为片段N5的核苷酸序列，正义链。SEQIDNO:39为片段N5的核苷酸序列，反义链。SEQIDNO:40为片段N6的核苷酸序列，正义链。SEQIDNO:41为片段N6的核苷酸序列，反义链。SEQIDNO:42为片段N7的核苷酸序列，正义链。SEQIDNO:43为片段N7的核苷酸序列，反义链。SEQIDNO:44与SEQIDNO:26的第5和6位的氨基酸残基被修饰的成熟羊干扰素t的氨基酸相对应。SEQIDNO:45与SEQIDNO:26所示的羊干扰素T的前37个氨基酸残基相对应。SEQIDNO:46与SEQIDNO:44所示的修饰的羊干扰素t的前37个氨基酸残基相对应。SEQIDNO:47为包括来自干扰素t的C-末端区域和来自另一个干扰素的区域的混合干扰素蛋白的序列。SEQIDNO:48与在此称作IFNa2b-N7类似物的干扰素a类似物的氨基酸序列相对应，其中，IFNa2b的N-末端区域的19、20、22、24、27位氨基酸被羊干扰素t的相应残基所取代。SEQIDNO:49为人干扰素a2b的氨基酸序列。具体实施方式I、定义干扰素a是指分离的干扰素a蛋白家族的任何成员，例如，具有SEQIDNO:9所示氨基酸序列的IFNaD，具有SEQIDNO:49所示氨基酸序列的腿a2b。简写为IFNt或interferon-^的干扰素t是指任何与已知IFNt的氨基酸序列具有高于70%、优选高于80%、更优选高于90%的氨基酸同源性的分离的干扰素蛋白家族的成员(例如，Ott，etal.，J.InterferonRes"11:357(1991);Helmer,etal.,J.Reprod.Fert.,79:83(1987);Imakawa，etal.，Mol.Endocrinol,3:127(1989);Whaley，etal"J.Biol.Chem.，269:10846(1994);Bazer，etal,WO94/10313(1994))。干扰素t已经在多种反刍动物中进行了鉴定，所述反刍动物包括但不限于牛(5ov/"e取，Z/e/menS.D.,/7义'S3(79S7人/maA:awa，AT"Mo/.￡"<aocWwo/""9:532(7卵柳、羊(OWwe平)、麋牛(OW/zos5p.)、长颈鹿(G7ra加Ge"5awA^4cce肌'ow肌W050)、马(五《"wsca&a〃tw)、斑马(&w附6w/r/^〃/,(7ew5"wA:v4cce肌'owwo.M7005ft27)、河马(/f一o;o/譜wj5/.)、大象(丄o;cocfo"tos/.)、骆鸵(丄/a附"g/ama)、山羊(Capra印"G^"5""Aj函细磨.超57讽葡573",葡473W,招573",超57332,」735733/,爿"57330'^K5573M,」"5732&爿K557327)和鹿(Cen^aes/.)。这些物种中，许多物种的干扰素t的核苷酸序列在公共数据库和/或文献中都有报道(例如，参见，Ao6^1s'兄MW"/">//"&z/era"C"oA:/"eA".，/S:S05羊干扰素t(OvIFN"是指具有如SEQIDNO:26所示的氨基酸序列的蛋白，还指具有不显著地影响蛋白活性的氨基酸替换和改变(如中性氨基酸替换)的蛋白，如SEQIDNO:44所示的干枕素t蛋白。更普遍地说，羊干扰素t蛋白是指与SEQIDNO:26所示的序列具有大约80%、更优选90%的序列同源性的蛋白。例如，通过严格的氨基酸比对或使用多种商用程序中的一种来确定序列的同源性。"成熟蛋白"是指移除其前导序列后的干扰素蛋白。例如，成熟的干扰素t蛋白序列起始于干扰素t氨基酸全序列的残基Cys24，相当于成熟蛋白序列的Cysl。当多核苷酸序列或片段具有与能够分离出该多核苷酸序列或片段的序列或片段相同的核苷酸序列时，该多核苷酸序列或片段可以分离自另一个多核苷酸序列或片段。例如，如果插入物的多核苷酸序列与选择的人类基因的多核苷酸序列相同，那么细菌质粒含有分离自所选择的人类基因的插入物。同样，当多肽序列或片段具有与能够分离出该多肽序列或片段的序列或片段相同的氨基酸序列时，该多肽序列或片段可以分离自另一个多肽序列或片段。对于两个氨基酸序列，百分率(％)同源性是指当对序列进行最佳比对并且没有由于缺失而被罚分时，两个氨基酸序列的残基同源性的百分率。换句话说，如果需要在第一条序列中插入缺失从而与第二条序列进行最佳比对时，所述同源百分率仅仅通过与相应的氨基酸残基配对的残基进行计算(即，计算并不考虑第二条序列中位于第一条序列缺失位置的残基)。最佳比对是指给出最高同源百分率分数的比对。相对较短的多肽的比对可以目测进行，或者可以使用"GENEWORKS"程序进行比对。选择性地，可以使用敏感度(ktup)为1的局部比对程序LALIGN、缺省参数和缺省点突变模型(defaultPAM)进行比对。"保守取代"是指一种类型的氨基酸被同一类型的氨基酸所取代，所述类型由普通生理化学氨基酸侧链特性以及自然界中发现的同源蛋白中较高的取代频率所决定(由标准的频率变换打分矩阵(Dayhofffrequencyexchangematrix)所决定)。氨基酸侧链分为六种类型，包括I型(Cys)、II型(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)、III型(Asn、Asp、Gln、Glu)、IV型(His、Arg、Lys)、V型(Ile、Leu、Val、Met)和VI型(Phe、Tyr、Trp)。例如，Asp对另一种III型残基如Asn、Gln或Glu的取代为保守取代。"非保守取代"是指一种类型的氨基酸被另一种类型的氨基酸所取代，例如，II型残基Ala被III型残基如Asp、Asn、Glu或Gin所取代。"类似物"是指通过如下方式得到的与分离的天然蛋白序列相关的多肽:对天然蛋白的N-末端和/或C-末端进行一个或多个氨基酸的缺失或插入；在天然多肽的一个或多个位点进行一个或多个氨基酸的缺失或插入；或者，在天然多肽的一个或多个位点进行一个或多个氨基酸的取代。例如，该类似物可以通过遗传多态性或人工处理得到。所述人工处理的方法为本领域技术人员所公知。"融合"蛋白是指通过将第一个蛋白的至少一个邻近(contiguous)部分连接至第二个不同的蛋白的至少一个邻近部分而构建的蛋白。将融合蛋白类似物假定为天然蛋白，其中所述融合蛋白具有两种不同干扰素的嵌合体序列。因此，在融合蛋白类似物中，在含有嵌合体的一个或两个邻近部分，一个或多个氨基酸残基可以被替换、删除或插入至该构成部分的天然序列中。术语"蛋白"和"多肽"可以互换使用，是指氨基酸聚合体而并不特指具有特定长度的氨基酸聚合体。例如，该术语还包括多肽的表达后的修饰，例如糖基化、乙酰化和磷酸化等。"共轭化合物"是指包括连接或结合有第二化合物的第一化合物的化合物。"增生性病变"是指特征在于快速产生新细胞的病变或疾病，包括但不限于肿瘤或癌症。II、低毒、长循环人干扰素(X类似物一方面，提供了通过共价键与至少一种亲水聚合物链结合的天然人干扰素a蛋白类似物。可以使用多种人干扰素ct蛋白类似物，在此部分将描述各种例子。在以下部分、部分III中，将对使这些天然人干扰素a类似物与亲水聚合物共价结合的方法进行描述。A、干扰素a类似物蛋白在第一个示例性实施方式中，提供了一种天然人干扰素a蛋白的类似物，其中，该类似物的与天然干扰素a的残基序列1-27相对应的氨基酸序列在位点19、20、22、24和27存在区别，前提是相对于位点22的氨基酸残基为Ser、Thr、As、Gln或Gly不会使该类似物的序列不同于相对应的天然干扰素a。例如，在培养过程中分析人单核细胞或肝细胞时，与天然干扰素a相比，这种类似物的毒性较低。图1显示了成熟的人干扰素aD(GenBankAccessn.J00210,PIDg386796;SEQIDNO:9)和成熟的羊干扰素<SEQIDNO:26)的前27个N-末端氨基酸残基，其中粗体显示不一致的残基。包括源自羊干扰素T的特定氨基酸替换的人干扰素aD类似物可以通过如美国专利No.6,204,022所描述的方法制得，该专利的全文在此一并引入作为参考。图1还显示了称作IFNa-N0至IFNa-N7(SEQIDNO:11、13、15、17、19、21、23、25)的几种人干扰素aD类似物的氨基酸残基1-27。N-末端部分的氨基酸残基1-27对应于如图1所示的类似物片段并且蛋白剩余部分(氨基酸残基28-166)对应于IFNaD的人干扰素a类似物蛋白在此表示为SEQIDNOs:10、12、14、16、18、20、22和24。这些干扰素a类似物在此均可预期使用，其中优选包括IFNa-N7类似物片段的蛋白类似物。使用如图2所示的载体，这些类似物的制备在实施例1中进行了简要的描述。更加详细的制备方法在美国专利No.6,204,022中进行了描述。在美国专利No.6，204，022中还描述了这些类似物的体外细胞毒性检测，表明氨基酸残基位点19、20、22、24和27与降低成熟干扰素aD的细胞毒性有关。位点19、20、22、24和27中的一个或多个位点的氨基酸替换降低了细胞毒性，并保留了成熟的天然干扰素a的预期治疗性能。在实施例IB中描述了另一种干扰素a类似物蛋白，其中，人干扰素a2b(SEQIDNO:49，AccessionNo.AAP20099)的氨基酸残基位点19、20、22、24和27被修饰，从而在这些位点中含有相应的羊干扰素t残基。该人干扰素a2b类似物蛋白在此定义为SEQIDNO:48。特别地，人干扰素a2b的以下氨基酸残基进行了如下修饰A19—D，Q2Q—R，R22—N，I24—L和F27—H。更普遍的是，预期了基于各种干扰素a亚型的干扰素a类似物。所述天然干扰素a蛋白可以被修饰为包括一种或多种的以下替换以得到干扰素a类似物成熟人干扰素a的19位氨基酸可以被成熟羊干扰素t的19位Asp或者同类残基Asn、Gin或Glu所替换；成熟人干扰素a的20位氨基酸可以被成熟羊干扰素t的20位Arg或者同类残基His或Lys所替换;成熟人干扰素a的22位氨基酸可以被成熟羊干扰素t的22位Asn或者同类残基Asp、Gin或Glu所替换；成熟人干扰素a的24位氨基酸可以被成熟羊干扰素t的24位Leu或者同类残基Val或Met所替换；成熟人干扰素a的27位氨基酸可以被成熟羊干扰素T的27位His或者同类残基Arg或Lys所替换。这种替换能够有效的降低人干扰素a蛋白的毒性而并不显著改变预期的治疗性能。包括一些额外的示例性人干扰素a类似物蛋白的改变位点的其它示例性序列包括在此定义的序列SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和SEQIDNO:6。最优选的实施方式为包括选自19-27位点中的一个或多个位点具有残基替换的人干扰素a类似物。在另一实施方式中，提供了一种干扰素a类似物，其中，一种或多种氨基酸残基(i)位于如图1所示的残基19-27的区域；(ii)残基与成熟干扰素t(优选为成熟羊干扰素t)不同，该残基被成熟干扰素t的残基所替换。例如，其中成熟人干扰素a(SEQIDNO:l，SEQIDNO:49)的19-27位氨基酸被成熟羊干扰素t(SEQIDNO:2)的19-27位氨基酸所取代的类似物蛋白导致成熟的人干扰素a的位点19、20、22、24和27发生改变，而剩余的成熟人干扰素a序列保持不变。这些例子相对应的类似物在此被称作IFNad-N7(SEQIDNO:24)和IFNa2b陽N7(SEQIDNO:48)。在另一实施方式中，所述人干扰素a类似物蛋白包括被人干扰素a位点19、20、22和27上的一个或多个氨基酸取代的非保守氨基酸残基。所述取代包括但不限于III型氨基酸(特别是Asp)取代位点19的氨基酸；IV型氨基酸(特别是Arg)取代位点20的氨基酸；III型氨基酸(特别是Asn)取代位点22的氨基酸；IV型氨基酸(特别是His)取代位点27的氨基酸。在另一实施方式中，所述取代可以包括V型氨基酸(特别是Leu)取代位点24的氮基酸。示例性类似物包括成熟人干扰素a位点19-27之间的残基序列被SEQIDNO:2所定义的9-mer所替换的取代。特别地，成熟人干扰素a位点19-27之间的残基序列为SEQIDNO:l。所述SEQIDNO:2所定义的9-mer对应于成熟羊干扰素t的19-27位残基，包括与人干扰素a位点19、20、22、24和27不同的残基。在另一实施方式中，类似物包括成熟人干扰素a位点11-27之间的残基序列被SEQIDNO:4所定义的17-mer所替换的取代。特别地，成熟人干扰素a位点11-27之间的残基序列为SEQIDNO:3。所述SEQIDNO:4所定义的17-mer对应于成熟羊干扰素t的11-27位残基，包括与人干扰素a位点ll、13、14、16、19、20、22、24和27不同的残基。在另一实施方式中，类似物包括成熟人干扰素a位点6-27之间的残基序列被SEQIDNO:6所定义的22-mer所替换的取代。特别地，成熟人干扰素a位点6-27之间的残基序列为SEQIDNO:5。所述SEQIDNO:6所定义的22-mer对应于成熟羊干扰素t的6-27位残基，包括与人干扰素a位点6、7、8、11、13、14、16、19、20、22、24和27不同的残基。应当理解为，虽然所描述的低毒人干扰素a类似物为成熟蛋白，即它们起始于干扰素全序列的24位Cys残基(相对于成熟蛋白的1位Cys);但是包括前导序列即起始于初始甲硫氨酸的干扰素a类似物也是适合的。所述人干扰素a类似物中的前导序列可以来自人干扰素a、羊干扰素t或其它I型干扰素。如上文所描述的，与天然的人干扰素T相比，这些人干扰素a类似物的毒性降低，并且在大多情况下可以具有与天然的人干扰素a相同的生物活性。B、干扰素a类似物蛋白融合或混合蛋白在另一实施方式中，被亲水聚合物化学修饰的干扰素a蛋白为融合蛋白，该融合蛋白包括干扰素a蛋白和干扰素t蛋白。如即将进行描述的，干扰素a如IFNaD或IFNa2b的N-末端或-末端可以被源自IFNt的具有任意长度的氨基酸残基邻近片断所修饰。将对几种示例性实施方式进行详细的描述，但是应当理解这些实施方式只是示例性的例子，对本领域技术人员而言，其它融合或混合蛋白也明显可用。在此所用的术语融合或混合是指将第一蛋白的片段连接至第二蛋白的片段的意思。这些融合或混合蛋白落入更通用的术语干扰素a类似物蛋白的定义之内。设计了包括第一片段和第二片段的融合蛋白，该第一片段含有干扰素t蛋白的N-末端氨基酸序列，第二片段含有非干扰素t的I型干扰素多肽的C-末端氨基酸序列。这两个片段连接于成熟干扰素多肽的约8位和37位残基之间的部分。在另一普通实施方式中，这两个片段连接于与成熟干扰素多肽的约8位和28位残基之间相对应的部分。在另一普通实施方式中，这两个片段连接于与成熟干扰素多肽的约8位和22位残基之间相对应的部分。在另一普通实施方式中，这两个片段连接于与成熟干扰素多肽的约8位和16位残基之间相对应的部分。如在此一并引入作为参考的美国专利No.5，939，286所描述的，干扰素t的N-末端区域与干扰素t的毒性降低有关，因此，在融合或混合蛋白中使用干扰素t的N-末端区域引起了人们的极大关注。参考附图3，由嵌合体核苷酸分子编码的混合干扰素融合蛋白或多肽40具有N-末端42和C-末端44。所述融合蛋白由第一片段46(N-末端)和第二片段48(C-末端)构成。所述N-末端片段包括由嵌合体核苷酸分子的5'端片段编码的干扰素t多肽的N-末端氨基酸序列。所述C-末端片段包括非干扰素t的I型干扰素多肽的C-末端氨基酸序列、和由嵌合体核苷酸分子的3'端片段编码的干扰素t多肽的氨基酸序列。这两个片段连接或拼接于与成熟干扰素多肽的8位和37位氨基酸残基之间的部分相对应的作为连接区域的连接点50。值得注意的是，成熟的干扰素t多肽一般以半胱氨酸起始于全序列(包括前导序列并起始于甲硫氨酸)的第24位氨基酸。所述连接区域一般包括在干扰素t(SEQIDNO:45和SEQIDNO:46)多肽的N-末端的37个氨基酸中。几种干扰素t、干扰素a和干扰素p克隆的成熟氨基酸序列在1-37位氨基酸之间的比对表明这些序列中最高程度的趋异性发生在接近于N-末端的位置。特别地，序列间最高程度的趋异性位于l-16位氨基酸之间，中等程度的趋异性位于17-28位氨基酸之间。不同的I型干扰素的29-37位氨基酸之间的区域相对保守。结合本领域技术人员所公知的功能分析方法(如抗病毒、抗增殖和细胞毒性分析)，可以通过使用与干扰素<1-37)的长链或短链区域相对应的多肽或编码该多肽的DNA序列来鉴定最佳连接，即上游序列(朝N-末端或5'端)与干扰素t相对应并且下游序列(朝C-末端或3'端)与另一个干扰素如干扰素a或干扰素p相对应的氨基酸残基位点。例如，含有干扰素T的1-28位氨基酸和源自非干扰素T的I型干扰素的剩余氨基酸的混合或嵌合体干扰素预期具有与干扰素T相关的低毒特性和与I型干扰素相关的正常生物活性。例如，IFNt/IFN(x融合混合干扰素可以降低IFNa的毒性但是不会影响IFNoc的抗病毒特性。可以选择作为干扰素融合蛋白的前8-37个氨基酸的示例性序列包括与INFT的以下邻近片段相对应的序列:1-8，1-9，1-10，1-11，1-12，1-13，1-14，1-15，1-16，1-18，l-i9，i-20，1-21，i-22，1-23，1-24，1-25，1-26，1-27，1-28，1-29，1-30，1-31，1-32，1-33，1-34，1-35，1-36和1-37。可以理解的是，这些邻近的片段能够被如保守氨基酸的替换所修饰，这也在此处考虑的融合蛋白的范围之内。所述剩余序列(即，由嵌合体核苷酸分子的3'端片段编码的"第二"C-末端片段的氨基酸序列)可以选自任何合适的非干扰素t的I型干扰素多肽，例如，干扰素a(例如，a-l或a-2)、干扰素(3、干扰素Q)、混合干扰素或组合干扰素(consensusinterferon)。非干扰素t的I型干扰素的序列为本领域技术人员所公知。组合干扰素的示例性序列为本领域技术人员所公知(美国专利No.4，897，47D。示例性的干扰素a的序列如欧洲专利No.88622、美国专利No.4，820，638、美国专利No.4，780，530和美国专利No.4,748,233所示。另外的干扰素a和卩的序列如Fish，E.N.，J.InterferonRes.12:257-266(1992)中所示。合适的序列还可以通过GenBank或其它公共序列存储系统得到。3'端或C-末端片段起始的非干扰素t的I型干扰素的氨基酸残基位点的检测可以通过亲本序列的最佳比对并进行连接来实现，从而使得到的嵌合体干扰素分子的序列与以下序列完全对齐(i)干扰素t亲本序列的5'端或N-末端片段；禾叩i)非干扰素T的I型干扰素亲本序列的3'端或C-末端片段。当然，所述亲本序列就是指衍生出5'端或N-末端片段和3'端或C-末端片段的干扰素序列。一般地，3'端或C-末端片段起始的非干扰素t的I型干扰素t的残基位点为随着5'端或N-末端干扰素t片段的最后一位氨基酸残基的位点。例如，在前10个氨基酸具有SEQIDNO:26所示的前10个氨基酸的序列的混合干扰素融合蛋白中，剩余的氨基酸可以具有成熟干扰素a(例如，Fish，Id所描述的IFN-aCom)除去其前IO个氨基酸后的序列。另一个例子为前28个氨基酸具有SEQIDNO:44所示的前28个氨基酸的序列，剩余的氨基酸具有天然的成熟干扰素如IFNaD(SEQIDN0:9)的序列。应当理解为，虽然所描述的干扰素融合蛋白为"成熟"蛋白，即它们起始于干扰素全序列的第24位残基，但本发明还包括含有前导序列即起始于初始甲硫氨酸的融合蛋白和编码该融合蛋白的嵌合体核苷酸分子。干扰素融合蛋白中的前导序列可以来自干扰素t或非干扰素t的I型干扰素。另外，应当理解为，第一和第二片段的序列均可以为"共有"序列。换句话说，5'片段的序列可以不与天然的干扰素t相对应，而与通过将对齐的序列和多种不同的干扰素t进行对比而得到的共有序列相对应。同样，3'片段的序列可以不与天然的非干扰素t的I型干扰素相对应，而与通过将对齐的序列和多种不同的非干扰素t的I型干扰素进行对比而得到的共有序列相对应。选择性地，每个片段的序列均可以与"内部一致(internally-consistent)"序列相对应，即，与其中各个位点含有在IFNt(N-末端片段)或非IFNt的I型IFN(C-末端片段)的至少一个自然生成的亚型的该位点上发现的残基的序列相对应，而最终的序列既不与任何自然生成的亚型相对应也不与任何共有序列相对应。例如，如果长度为3个氨基酸的两个亚型具有序列"CRS"和"CKG"，那么内部一致序列为"CRG"。此外，应当理解为，预期得到了复合嵌合体，例如含有一个以上的源自IFNt的不连续区域和/或一个以上的源自另一种适合干扰素的区域的嵌合体。例如，这种嵌合体出现在含有第二片段(C-末端)的非干扰素t的I型干扰素本身为混合干扰素的情况中，例如，由干扰素a和干扰素P形成的混合干扰素(美国专利No.4758428)，由干扰素a-l和a-2形成的混合干扰素(美国专利No.4892743)，或由干扰素a和co形成的混合干扰素(美国专利No.4917887)。嵌合体核酸分子可以合成得到或通过标准的分子生物学手册和操作得到。通过使用标准的重组方法(例如，在DNA序列中设计限制位点，该限制位点不改变翻译的氨基酸序列；消化质粒；将相关片段克隆到选择的表达载体中)，将编码亲本多肽(由该两个多肽的片段衍生出形成混合蛋白的两个片段)的DNA序列在表达载体中彼此靠近地克隆。在另一个实施方式中，设想将包括源自干扰素t的C-末端区域和源自另一种干扰素的区域的混合干扰素蛋白用作通过亲水聚合物修饰的蛋白。如在此一并引入作为参考的公开号为2003/0130486的美国专利申请所描述的，这种混合蛋白具有干扰素t的C-末端区域和源自非干扰素t的I型干扰素多肽(例如，IFN-(3和多种亚型的IFN-a)的N-末端部分。一个示例性的蛋白在此被定义为SEQIDNO:47。这种蛋白可以通过嵌合体核苷酸分子编码得到或通过天然化学连接(nativechemicalligation)得到，该蛋白具有包括IFN-aD的位点1-163的氨基酸的N-末端和包括IFN-t的位点163-172的氨基酸的C-末端。所述N-末端片段包括可以由嵌合体核苷酸分子的5'端片段编码的非i干扰素多肽的N-末端氨基酸序列。所述C-末端片段包括可以由嵌合体核苷酸分子的3'端片段编码的干扰素t多肽的C-末端氨基酸序列。结合功能分析如抗病毒或细胞毒性分析，可以通过常规的方法使用与干扰素t(163-172)内部的或延伸出的长链或短链区域相对应的多肽或编码该多肽的DNA序列，来鉴定其中上游序列与非t干扰素相对应并且下游序列与干扰素t相对应的最佳连接或氨基酸残基位点。含有人干扰素-aD的1-166位氨基酸和干扰素t的后10个c-末端氨基酸的混合或嵌合体干扰素具有与干扰素t相关的较低的毒性以及与干扰素(x相关的生物活性或通常归因于干扰素a的生物活性。例如，IFN-a/IFN-t混合干扰素降低了IFN-a的毒性，但并不影响甚至提高了IFN-a的抗病毒特性。优选的融合蛋白是其中N-末端片段的序列源自人干扰素-aD以及C-末端片段源自羊干扰素-t的蛋白。III.通过亲水聚合物进行修饰的方法此部分描述了通过亲水聚合物化合物来修饰上述蛋白的多种合成反应的路线。简单地说，此部分所述的术语"干扰素a类似物蛋白"或"类似物蛋白"是指上述部分II中所描述的各种干扰素(x类似物蛋白，例如，具有确定的特殊残基替换的干扰素a类似物，和具有替换其它蛋白的特定残基或与其它蛋白结合的一种蛋白的邻近片段或框的示例性融合蛋白或混合蛋白。在此描述的类似物蛋白可以通过将类似物蛋白与合成的或天然生成的聚合物、寡聚物、小分子或功能基团连接而进行修饰，从而生成非自然生成的结合物。各组分的结合可以通过如静电结合力或范德华力在内的非共价键结合，但各组分之间优选通过共价键进行结合。如本领域技术人员所公知，由于共价键的结合力，共价键结合的优点在于更容易操作以及可以在各种化学环境使用而不被分解。用一种或多种分子对蛋白进行的共价修饰通常被称为"共轭"，结合产物被称为"修饰蛋白"。对类似物蛋白的修饰可以在该类似物蛋白的一个或多个官能团上进行。多个官能团暴露在干扰素a类似物蛋白的外部，并且这些基团能够通过已知的方法容易地被功能化或转化成可以被功能化的基团。修饰的数量和性质取决于该类似物蛋白的特殊性质和结构以及共轭产物的预期作用类型。另外，如果期望得到基本同源的产物，除了选择位于共轭位点上类似物蛋白的官能团以外，修饰位点的选择也是有益的，它将在很大程度上决定所用化学反应的类型。选择性共轭的两个相对便利的位点为类似物蛋白的N-末端和C-末端。在这两个位点中，N-末端通常为更便利的选择性修饰位点，因为在反应条件容易控制的情况下，含有羧酸的氨基酸侧链具有与C-末端羧基相同的化学反应性；在N-末端氨基为活化状态的情况下，赖氨酸残基的氨基并不反应。存在的其它官能团(如半胱氨酸的巯基、或苏氨酸的羟基)还提供了用于结合反应的位点。通过蛋白氨基酸序列的信息并辅助以显示蛋白三维结构的晶体结构，能够确定蛋白表面能够用于结合的位点。关于在此描述的干扰素ct类似物蛋白，Radhakrishnan等公开了干扰素t的晶体结构并与干扰素a的结构进行了对比(J.Mol.Biol.,286:151-162(1999))。天然蛋白的晶体结构可以用于指导干扰素a类似物蛋白的位点特殊修饰。在制备修饰的干扰素a类似物蛋白的过程中，使用亲水聚合物是特别有益的。亲水聚合物能够维持共轭化合物在水性体系如血液和浆液中的水溶性，且适用于治疗应用。适合与类似物蛋白发生共轭结合的聚合物分子包括聚乙二醇(PEG)和普通的衍生物，例如，单甲氧基聚乙二醇(mPEG)、聚氧化乙烯(polyethyleneoxide，PEO)、聚乙烯醇、聚丙二醇、聚胺酸、聚乙烯吡咯垸酮、葡聚糖、多糖、纤维素以及纤维素衍生物(如羧甲基纤维素或羧乙基纤维素)、淀粉以及淀粉衍生物。优选的分子为聚乙二醇，因为它除了在分子量范围内有效以外，在化学活化的和保护的形式中也是有效的。聚乙二醇被多次用于蛋白的共轭化合物，包括干扰素蛋白。公开文献包括在此一并引入作为参考的美国专利No.5711944和美国专利No.5281698。干扰素-P共轭化合物公开于在此一并引入作为参考的美国专利No.6800735和美国专利No.6531122中。所述聚合物的分子量预期为100-500000道尔顿。所述聚合物的分子量更优选为1000-50000道尔顿。所用的分子量除了表示蛋白活性位点对共轭的聚合物的空间阻隔的敏感度以外，还可以表示每个共轭化合物的聚合物的官能数，以及共轭化合物预期的流体力学半径。多分散性也是在选择用于共轭化合物的聚合物时的一个考虑因素。较窄的多分散性表明聚合物的大小及分子量相对较为接近。使用较窄的多分散性将产生更加均一且同源的共轭产物。考虑使用直链的或支链的聚合物。支链的聚合物的优点在于使共轭化合物具有更好的空间体积以及尺寸，同时需要更少量的蛋白共轭位点。还应考虑选择性位点的共轭反应。一个示例性位点为蛋白的N-末端修饰。在此一并引入作为参考的美国专利No.5985265中提供了一种在垸基化还原条件下使用聚乙二醇的共轭反应。在该方法中，每个蛋白均偶联有一个聚合物。另外，还可以考虑使用支链的聚乙二醇化合物或其它亲水聚合物。各种共轭化学方法均可以用于将聚乙二醇或聚乙二醇类衍生物偶联至蛋白。以下方法为示例性的并且不以任何方式进行限制。也可以使用其它的方法，例如，Zalipsky,S等教导的方法(BiotechnologyandAppliedBiochemistry,15:100-114(1992))以及在美国专利No.5,985,265中公开的将聚乙二醇分子通过烷基化还原至蛋白N-末端的方法。在美国专利No.6638500中，通过使用邻位吡啶基二硫化物作为活化剂，利用硫醇选择性反应制得共轭化合物，在该共轭化合物中，聚合物连接至蛋白的半光氨酸部分。在另一个例子美国专利No.5362852中，通过将2-羟乙胺部分氧化从而产生醛基，随后，该醛基基团与肼反应生成共轭化合物，从而在蛋白中原位生成官能团。其它的制备活化的聚乙二醇和聚乙二醇类衍生物的方法以及制备具有用于与该衍生物反应的官能团的蛋白的方法为本领域技术人员所公知，并且可以用于在此描述的干扰素a类似物蛋白的修饰。这些其它方法包括在此一并引入作为参考的以下专利中所提及的方法US2005/0014240和2004/0062746，WO2004/060300和WO2004/060299，和美国专利No.6,783,965。在此，研究所指的干扰素a类似物蛋白涉及干扰素a2b类似物(SEQIDNO:48)，该类似物被支链的聚(乙烯醇)通过如实施例1C中所描述的方法进行了修饰。该聚乙二醇-干扰素a2b-N7类似物蛋白具有如实施例2-7中所描述的体外和体内特征。IV.使用方法在此描述的修饰的干扰素a蛋白类似物可以用于治疗由干扰素a或干扰素T治疗后的各种情况的应答。这包括但不限制于选自由病毒感染、以细胞增生为特征的疾病、炎症和自身免疫疾病所组成的组中的症状。在一优选实施方式中，所述修饰的干扰素a类似物蛋白被用于治疗病毒感染，例如包括甲型肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎在内的肝炎感染。在另一优选实施方式中，所述修饰的干扰素a类似物蛋白被用于进一步治疗包括人乳头瘤病毒、疱疹病毒和人免疫缺陷病毒在内的病毒感染。描述的实施例8和9研究了通过聚乙二醇修饰的干扰素a类似物蛋白，即PEG(40kDa)-IFNa2b-N7，来治疗患有病毒感染的病人。在一优选实施方式中，所述聚合物修饰的干扰素(x类似物蛋白被用于治疗人类患者的丙型肝炎病毒(HCV)感染。导致肝衰竭和肝细胞癌变危险增加的肝硬化是丙型肝炎病毒感染的重要病状。慢性丙型肝炎到肝硬化的进程中的前兆性因素包括高水平的病毒血症、男性、感染时年龄超过40岁、同时感染有HIV1和HBV、酒精摄入量高、和涉及的病毒的基因型。丙型肝炎病毒分为具有多个亚型的6个基因型中，在一实施方式中，尝试使用聚合物修饰的干扰素a类似物蛋白来治疗由于基因型2或基因型3引起的感染。因此，可以考虑使用对患有丙型肝炎的患者给药聚合物修饰的干扰素a类似物蛋白来治疗病毒感染或减少肝衰竭的进程的治疗方法。在另一实施方式中，给药聚合修饰的干扰素a类似物蛋白，从而持续地暴露于该类似物蛋白，以进行持续的病毒应答并根除丙型肝炎。如定义为在治疗的前12-24周内病毒载量至少降低2-log的早期病毒应答被鉴定为应答的良好预测因子。在给药的前12周内，通过显示出肝酶的降低或丙型肝炎病毒载量至少降低2-bg，对聚合物修饰的干扰素a类似物蛋白的治疗产生应答的丙型肝炎感染患者可以被确定为对治疗产生应答的人群。例如，在治疗起始后约2周内被证实降低量大于1.39loglO的病毒血症应答的丙型肝炎患者对治疗具有应答性。还可以考虑将聚合物修饰的干扰素a类似物蛋白用于治疗细胞增殖疾病，例如，实体瘤。在另一个实施方式中，聚合物修饰的干扰素a类似物蛋白用于治疗自身免疫症状，例如，多发性硬化症、牛皮癣、眼色素层炎和口腔干燥-风湿性关节炎综合症等。所述聚合物修饰的干扰素a类似物蛋白可以根据已知的药用组合物的制备方法进行配制。在先已描述了含有干扰素或干扰素类化合物的制剂(例如，Martin,E.W.，In:DISPENSINGOFMEDICATION:APRACTICALMANUALONTHEFORMULATIONANDDISPENSINGOFPHARMACEUTICALPRODUCTS(Hoover,J.E.,Ed.)，8thedition,MackPublishingCo.,Easton,PA.，(1976))。通常情况下，为了方便有效地给药该组合物，该组合物将被制成制剂从而使有效量的修饰的干扰素a类似物与合适的载体相结合。这些治疗中所用的组合物还可以为多种形式，但优选为适用于肠道外给药的形式，例如，可注射的或可注入的溶液。适用于肠道外给药的药用组合物包括含有合适的缓冲液并选择性地含有药学上可接受的赋形剂、载体、涨度剂(tonicityagent)、防腐剂和表面活性剂的聚合物修饰的干扰素a类似物蛋白的制剂，其中，所述缓冲液的例子包括Tris-HCl、醋酸盐或磷酸盐如磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液，所述药学上可接受的赋形剂的例子包括蔗糖，所述载体的例子包括人类重组血浆白蛋白，所述涨度剂的例子包括氯化钠，所述防腐剂的例子包括水杨乙汞(thimerosol)、甲酚或苯甲醇，所述表面活性剂的例子包括灭菌注射用水中的吐温或聚山梨酸酯(polysorabates)。所述聚合物修饰的干扰素a类似物蛋白可以在冷冻条件下以冷冻粉末的形式储存，然后再复原以供使用。选择性地，含有所述聚合物修饰的干扰素(x蛋白类似物的水溶液可以储存在预装填的、多剂量注射器中，例如，用于传输药品如胰岛素的注射器。典型的适用的注射器包括由连接至笔型注射器(如诺和诺德公司的NovoletNovoPen)的预填装管以及允许使用者自己注射的预填装的笔型注射器所组成的系统。其它注射器系统包括由含有稀释剂和位于单独间隔内的冷干的聚合物修饰的干扰素ot蛋白类似物粉末组成的笔型注射器。所述修饰的蛋白的适宜剂量可以基于已知的成熟干扰素a的治疗剂量，由熟练的药剂师来决定。由于在此描述的干扰素a类似物具有较低的细胞毒性，因此可以考虑使用比成熟干扰素a的施用剂量更高的剂量。在一实施方式中，所述聚合物修饰的干扰素a类似物蛋白的肠道外剂量比目前认可的聚乙二醇化的干扰素(如PEGIntron⑧和Pegasys⑧)的推荐人体剂量至少高2倍，优选高3倍，更优选高5倍。例如，在治疗丙型肝炎的过程中，聚乙二醇修饰的干扰素a的当前给药剂量为每周180pg，而在此描述的聚合物修饰的干扰素a类似物蛋白的给药剂量为每周360pg或540pg，优选为每周720吗或更高。在一优选实施方式中，聚合物修饰的干扰素a类似物蛋白的给药剂量为每周900|ig或每两周900|ig，以更有效地使病人产生持续的病毒应答，并且具有比当前治疗中认可的聚乙二醇修饰的干扰素a蛋白更低的毒性以及更好的耐受性。可以理解的是，较大的剂量的给药频率可以低于较小的剂量。在另一实施方式中，给药剂量至少为每周约200)Lig或450ng、或者为每两周约200吗或450|ig。在一实施方式中，以能够有效地获得稳定状态的该蛋白类似物的血浆浓度的剂量和频率，对病人给药聚合物修饰的干扰素a类似物蛋白。在这个实施方式中，该稳定状态的血浆浓度对肝细胞不具有实际上的细胞毒性效应，例如，这种情况已经被体外研究所证实，通过使用选择的浓度的聚合物修饰的干扰素Ol类似物蛋白对肝细胞进行选择的阶段的培养，通过评价肝细胞的代谢作为判断毒性的指标，相似的研究在实施例5中进行了描述。当然，应该理解的是，在此描述的组合物可以与其它疗法结合使用。例如，在治疗慢性肝炎病毒感染中，所述聚合物修饰的干扰素a类似物蛋白可以与合成的核苷利巴韦林(syntheticnucleosideRibavirin)结合给药。其它结合方式为本领域技术人员所公知。以下实施例实质上仅为说明的目的，而并不是以任何方式进行限制。实施例1干扰素a类似物和聚乙二醇化的干扰素a-N7的合成A、基于天然的人干扰素(xD的干扰素a蛋白类似物的制备在毕赤酵母(尸/c/n'"/^Mto^)中，通过用优化的密码子首先回译(backtranslate)包括位于前27个N-末端位点范围内的15个干扰素t氨基酸替换的人干扰素a的氨基酸序列，构建编码被命名为HuIFNa-NLV的人干扰素a蛋白类似物的合成基因。剪辑该核苷酸序列，使其含有得到位于构建体长度上的5个限制性酶切位点。该合成基因序列被分成4个核苷酸片段。通过寡核苷酸的顺序连接而构建得到长度约150个碱基对的各个片段。将片段按照序列顺序克隆到G2细菌载体中(OperonTechnologies,Alameda,CA)，得到编码HuIFNa-N0(见图l)的基因。然后，从细菌载体上切出该合成基因，并将该合成基因连接到用于在在毕赤酵母中表达的pPICZ-a载体(Invitrogen,SanDiegoCA)的Xhol/Notl位点上。构建的表达载体称为pNLV，如图2所示。编码如图1所示定义为HuIFNa-Nl、HuIFNa-N2、HuIFNa-N3、HuIFNa-N6和HuIFNcx-N7的类似物的合成基因可以通过顺序连接寡核苷酸而构建得到。使用XbaI和BstEII对上述构建的pNLV进行消化，将退火的寡核苷酸接头l(SEQIDNO:28)和接头2(SEQIDNO:29)连接至这些位点，得到构建的中间载体。在此步骤中，去除了与HuIFNa-NO的N-末端片段相对应的核苷酸序列。通过顺序连接寡核苷酸得到编码IFNa-Nl、IFNa-N2、、IFNa-N3、IFNa-N6禾口、IFNa-N7的N-末端序列突变的核苷酸序列。使用Xhol和EcoRI对构建的中间载体进行消化，然后将核苷酸片段连接到中间构建体的XhoI/EcoRI位点，以在pPICZ-a载体中得到类似物HuIFNa-Nl、HuIFNa-N2、HuIFNa-N3、HuIFNa-N6和HuIFNa-N7。在SEQIDNO:30-43中给出了每个片段的正义链和反义链的核苷酸序列。为了表达重组的干扰素类似物，通过载体上的Xhol和Notl限制性内切酶位点，将各基因的编码序列插入到pPICZ-a表达载体(Invitrogen，SanDiego，CA)上。pPICZ-a表达载体提供了便于重组干扰素表达和纯化的多种条件。例如，该载体包括具有甲醇调节的醇氧化酶(AOX)启动子的表达框(expressioncassette)。在甲醇生长的酵母细胞中，大约5%的polyA+RNA来自醇氧化酶l基因。另外，该载体还含有指引蛋白分泌到培养基中的源自酿酒酵母"flcc/7flramyc"cweWs/ae)a因子前序多肽的分泌信号序列。该载体还禾U用Shble基因(5^e/toa〃ote/c/2"s/n'm/wtom^ble基因)编码的Zeocin抗生素来选择重组细菌和酵母细胞。将编码HuIFNa类似物的重组质粒电穿孔至大规模培养的X-33野生型毕赤酵母中。根据Invitrogen公司提供的程序对重组酵母克隆进行生长培养和诱导。收集上清液并使用0.8/0.2mm孔径的acrodisc过滤器(GelmanSciences,AnnArbor，MI)对上清液进行过滤。浓縮所述上清液并用10mM的Tris、150mM的NaCl更换缓冲液，随后使用CentriconPlus-20(MilliporeCorporation,Bedford,MA)将上清液浓缩至终体积2ml，然后在4。C温度下装载在HiPrepSephacryl26/60S-100高分辨率尺寸排除柱上(Pharmacia,Peapack，NewJersey)。大多数的HuIFNa类似物蛋白位于部分3。B、基于HuIFNa2b的类似物的制备使用类似的方法生成用于生成基于天然的人IFNa2b蛋白、HuIFNa2b的类似物的基因和表达载体。简要地说，在毕赤酵母中，通过用优化的密码子首先回译包括位于残基位点19、20、22、24和27的预期的干扰素a氨基酸替换的人干扰素a2b的氨基酸序列，构建编码类似物rHuIFNa2b的基因，命名为NLVga2b。通过寡核苷酸的顺序连接生成长度约150个碱基对的4个核苷酸片段。将片段按照序列顺序克隆到G2细菌载体中(OperonTechnologies,Alameda，CA)，得到基因NLVga2b。利用与其它人干扰素a类似物相同的方法(实施例1A)表达并纯化该基因。IFNa2b类似物在此是指IFNa2b-N7的序列，被定义为SEQIDNO:47。C、用聚(乙烯醇)对类似物进行修饰通过类似物和mPEG2-丁醛(NektarTherapeutics,SanCarlos,CA)之间的还原性氨基化作用，将如实施例IB所描述的方法制备的被定义为IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)的类似物与40kDa的支链甲氧基聚乙二醇部分在N-末端半胱氨酸进行共轭连接。实施例2聚乙二醇化的IFNa2b-N7的体外抗病毒活性使用基于马丁达比牛肾(MadinDarbybovinekidney,MDBK)细胞株和水泡性口膜炎病毒(VSV)作为攻击病毒的分析方法，对IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)和聚乙二醇(40kDa)-IFNa2b-N7(如实施例1C描述的方法制备的聚乙二醇修饰的SEQIDNO:48)的抗病毒活性(单位/毫升)进行检测，并与0^-0121)(1他011八@)和商品名为Pegasys⑧的聚乙二醇化的IFNa2a产品的抗病毒活性进行比较。通过检测该干扰素对MDBK细胞株抗VSV病毒的保护作用来评价干扰素的抗病毒性能。将稀释的干扰素加入到铺满的MDBK单层细胞中，在96孔平板上培养，在加入攻击病毒之前温育18小时。在分析中，使用重组的人干扰素aA(BiosourceInternational,Camarillo，CA)作为标准的干扰素对照。分析稀释后的各种干扰素样品，得到50%的MDBK细胞受到保护而不被VSV病毒感染时的数值。通过下式计算保护百分率-(平均数(A45。-63Q检测孔)一平均数(八45().63()病毒对照孔))X100平均数(A45Q-63()未处理的细胞对照孔)其中，A45o.63()为450-630nm处的吸光值。一个抗病毒单位定义为50%的保护。产物效价单位表示为单位/毫克(U/mg)。结果如表l所示。IFNa2b(IntronA)和IFNa2a-N7被证明具有相似的抗病毒性能，比活性约为109U/mg。从商品名为Pegasy^的聚乙二醇化的干扰素a产品和PEG(40kDa)-IFN-a2b-N7可以看出，在干扰素分子中添加40kDa的聚乙二醇部分，导致体外抗病毒比活性降低10倍。因此，MDBK/VSV抗病毒分析证明了PEG(40kDa)-IFN-a2b-N7的抗病毒活性与聚乙二醇化的干扰素a产品Pegasys⑧相当。业已证明，聚乙二醇化的干扰素产品的体外抗病毒活性比非聚乙二醇化的干扰素的抗病毒活性低。表1在由水泡性口膜炎病毒(VSV)攻击的MadinDarby牛肾(MDBK)细胞株中，干扰素的抗病毒比活性的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>实施例3聚乙二醇化的IFNa2b-N7的体外抗增殖活性将根据实施例1C所描述的方法制备的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的体外抗增殖活性与商品名为Pegasy^的聚乙二醇化的IFNa产品的抗增殖活性进行比较。对代表主要肿瘤类型的7种人类肿瘤细胞株进行培养，并用干扰素进行处理。通过四唑盐WST-1的减少来检测细胞增殖的程度。将用干扰素处理后的WST-1的减少程度与未处理的对照细胞进行比较。结果如表2所示。PEG(40kDa)-IFNa2b-N7和Pegasys⑧在7种检测细胞株中的抗增殖活性相似。表2干扰素在人类肿瘤细胞株中的抗增殖活性的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>a对代表性肿瘤细胞株施以lpg/ml量的干扰素，得到了相对于未处理的对照细胞的细胞株增殖平均百分数。未处理对照=100%，各种条件下的n二3;误差为平均值的标准误差(SEM)。实施例4聚乙二醇化的IFNa2b-N7的体外毒性通过检测人类外周血单核细胞中的细胞调亡水平，进行IFNcx2b(Intron-A)、IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)、PEG修饰的IFNa2b-N7和商品名为Pegasy^的聚乙二醇化的IFNa干扰素产品的毒性评价。人类外周血单核细胞分离自17个志愿者供体的血沉棕黄层。IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)和Intron-A⑧的干扰素检测浓度为0.01-lng/ml，PEG(40kDa)-IFNa2b-N7和Pegasy^的干扰素检测浓度为0.025-9pg/ml。将人类外周血单核细胞在扰素的处理下以每孔1.5乂106个细胞的浓度于24孔板中进行培养。在培养的第12天，使用膜联蛋白V和碘化吡啶对细胞进行染色，然后通过流式细胞计数法进行细胞调亡分析。通过诱导人类外周血单核细胞中的细胞调亡来检测IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)、PEG(40kDa)-IFNa2b-N7、Intron-A⑧和Pegasys⑧的毒性的相对水平，并与未处理对照进行对比，表示为比细胞死亡平均百分数(meanpercentspecificcelldeath)<=在人类外周血单核细胞中，通过干扰素浓度为每毫升培养基0.01-l.Opg的IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)和lntronA⑧诱导的比细胞死亡平均百分数如图4所示。结果说明，与11^011八@不同，在浓度为等于或低于0.025pg/ml时，IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)对人类外周血单核细胞不具有明显的毒性作用；而lntronA⑧在最低检测浓度0.01jug/ml时，诱导40%的细胞调亡。浓度为0.025昭/ml的IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)处理的人类外周血单核细胞培养中，未检测到毒性；而浓度为0.025]iig/ml的IntronA⑧处理的培养中，检测到细胞死亡的平均百分率为53%(p<0.001,T-检验)。在最高检测浓度为lpg/ml时与IntronA⑧相比，IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)的毒性显著降低，比细胞死亡平均百分数为53%:71%(p=0.015，T-检验)。然而，对病人通过皮下或肌肉注射推荐剂量的IntronA后，IntronA的最大血浆浓度为约0.1-1.0ng/ml。在高于IntronA的推荐剂量500倍时，IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)的毒性仍然低于IntronA在推荐剂量时的毒性。如图4B所示，与IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)比IntronA⑧的毒性低相一致，通过诱导细胞调亡检测，证实了PEG修饰的IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)的毒性比Pegasys⑧的毒性低。浓度为lpg/ml的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7与对照相比，比细胞死亡平均百分数约为0;而浓度为lpg/ml的Pegasy^的与对照相比，比细胞死亡平均百分数为30%(p<0.001,T-检验)。在施以推荐剂量以后，Pegasys⑧的最大血浆浓度为约0.025pg/ml。当PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的血浆浓度升至高于通过施以推荐剂量(180pg/剂量)的Pegasy^而得到的血浆浓度的10倍时，仍然未显示出毒性。该研究的数据说明，通过诱导细胞调亡检测，与商购的类似干扰素如IntronA和Pegasys⑧相比，PEG(40kDa)-IFNa2b-N7介导的毒性大幅度地降低。由于Pegasys②和，PEG(40kDa)-IFNa2b-N7均具有连接在天然干扰素分子上的40kDa的PEG部分，毒性特性的差异源自PEG(40kDa)-IFNct2b-N7分子中5个氨基酸的改变。数据说明了PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的剂量比Pegasys^的推荐剂量高5倍。实施例5人类肝细胞中聚乙二醇化的IFNa2b-N7的体外毒性肝毒性是干扰素在治疗丙型肝炎和癌症治疗中副作用的另一种潜在治疗限制。病人的IFNa肝毒性与剂量水平有关，可以通过转氨酶升高来进行检测。业已进行了研究来评价肝细胞中IFNa和IFNa类似物的毒性。在基质胶96孔平板中培养原发性人类肝细胞，并用0.0001-1pg/ml的IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)或lntronA②进行处理、以及0.010-10ng/ml的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7或Pegasys⑧的肝细胞培养基进行处理。在培养的第7天，通过四唑盐WST-1的减少作为干扰素介导的肝细胞毒性的标记来检测细胞代谢的相对程度，并与未处理的对照细胞进行比较。结果如图5A-5B所示。用IFNa2b-N7处理的原发性人类肝细胞在培养基浓度低于0.01pg/ml培养的第7天，未显示出对细胞代谢的副作用。这与培养基浓度为0.01pg/ml的IntronA介导的肝细胞代谢降低相反(p=0.02，T-检验)。在干扰素浓度为0.1pg/ml和lpg/ml时，IFNa2b-N7处理的肝细胞的代谢分别降低了7.3%(+/-2.1SEM)和10.9%(+/-1.8SEM)。这与浓度为0.1吗/1111的1他011八@对肝细胞具有明显的副作用不同，IntronA使肝细胞代谢降低了18.3%(+/-2.71SEM)。在浓度为0.1pg/ml和lpg/ml时，IntronA的副作用比IFNcx2b画N7的副作用高2倍(p=0.05,T-检验)。关于图5B，在使用PEG(40kDa)-IFNa2b-N7和Pegasys处理原发性人肝细胞时，在浓度升至lpg/ml时并未显示出毒副作用。值得注意的是，浓度为0.01pg/ml和l|ig/ml的干扰素以及浓度升至10pg/ml的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7同等地介导对肝细胞的保护作用，在第7天与对照相比具有更高的代谢数值。然而，通过肝细胞代谢的降低，从2.5pg/ml(p<0.05，T-检验)和5ng/ml(p<0.002，T-检验)的40%至7.5pg/ml(p<1.3x10-5,T-检验)禾口10pg/ml(p<1x10—4,T-检验)的50%，清楚地显示出高于lpg/ml的Pegasy^具有显著的毒性。因此，研究结果清楚地显示出，在原发性人类肝细胞中，与lntmnA⑧和Pegasys⑧相比，IFNa2b-N7和PEG(40kDa)-IFNa2b-N7均具有显著降低毒性的性质。IntnmA在比IFNa2b-N7的水平低10倍时仍对肝细胞具有副作用(0.01|ig/ml:0.1pg/ml)，而任何检测浓度的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7均未显示出对肝细胞的副作用。相反，Pegasy^在浓度等于和高于2.5pg/ml时对肝细胞具有明显的毒性。实施例6聚乙二醇化的IFNa2b-N7的体内药物动力学将如实施例1C所描述的方法制备的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7以107U/Kg的单一剂量对小鼠进行皮下给药后，检测血浆内消减性质。在剂量为107U/Kg时，将PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的血浆内消减曲线与聚乙二醇化的IFNaa产品Pegasy产的血浆内消减曲线进行对比，从而检测吸收和消除的差异。另外，在每周多次或每两周多次注射后，结束PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的血浆浓度研究。使用无菌PBS将PEG(40kDa)-IFNa2b-N7和Pegasys⑧稀释至合适的浓度，并在给药的当天制得。对实验动物进行称重，并使用异氟烷进行轻微麻醉，然后对检测动物施以107U/Kg剂量的s.c。每个时间点的每个检测动物组的两个小鼠，通过预设时间的二氧化碳窒息进行安乐死处理。在上述操作后短时间内采集心内血。将血液样品以10,000的转速离心3分钟，然后收集血清。将血清样品于-8(TC下进行储存，直至进行分析。通过微软Excel的线性曲线拟合程序(MicrosoftExcel，sLinearCurvingFittingProgram)对不同时期的消除率进行评估。每个线性调整曲线(linercurvefit)的斜率用于评价消除率(ng/mL/h)。使用BenderMedsystems公司的人干扰素aELISA试剂盒(CAT弁BMS216)对血清样品进行分析。修改该方法以分析聚乙二醇化的干扰素。结果如表6所示。给药后1小时(约10.26ng/mL)就可以检测到PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的准确的血清水平(方形)。最大血清浓度(约1000.00ng/mL)出现第24小时，此后干扰素浓度逐渐降低。评价的第24-72小时期间的消除率为约13.83ng/mL/hr，第72小时的血清浓度降低至约339.38ng/mL(约为血清浓度最大值的33.84%)。在t=72-216小时期间，消除率降低至2.27ng/mL/hr，在第168小时(第7天)时，血清浓度为79.98ng/mL(约为浓度最大值的7.97%)。在第264小时(第11天，约8ng/ml)和第384小时(第14天，约lng/ml,未显示数据)仍能检测到PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的血清水平。在107U/Kg的PEG(40kDa)誦IFNa2b-N7的血清消除性质与107U/Kg的Pegasys(菱形，图5)相似时，Pegasys⑧不能维持远高于其推荐剂量所能达到的最大血清浓度的血清浓度，由于其毒性，推荐剂量比人等效剂量107U/Kg低5倍。实施例6聚乙二醇化的IFNa2b-N7的体内抗增殖活性使用用于人肾细胞癌的裸鼠异种移植模型来评价IFNa2b-N7(SEQIDNO:48)和PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的抗癌效果(抗增殖)。在相同的研究条件下，将该抗癌效果与通过磷酸盐缓冲盐水(PBS)或两种商购IFNa产品IntronA和Pegasy^处理的移植模型的抗癌效果进行比较。在雌性裸鼠的右侧腹部以5X106个细胞/200微升s.c的浓度移植肾癌细胞株(ACHN)。该肾癌细胞株(ATCCCRL-1611)分离自恶性肾腺癌。在异种移植当天开始进行处理。每周对小鼠施以PBS(10mL/kg)、PEG(40kDa)-IFNa2b-N7或Pegasys(106或l()7u/kg)—次。另外一批小鼠，每周对小鼠施以PBS(10mL/kg)、IFNa2b陽N7(SEQIDNO:48)或IntronA(106或l(^U/kg)三次。用数字测径仪检测肿瘤。每周对肿瘤进行2次检测，以确定肿瘤体积和肿瘤的椭圆面积。异种移植后28天，杀死小鼠。记录肿瘤体积和面积的正常变化以用于标准化数据以及降低极端数据偏差。用曲线下面200680030200.5说明书第35/38页积(AUC)来比较处理效果。用变量分析(ANOVA)来确定处理作用的统计学显著性(pS0.05)。变量分析后进行T-测试用两样品的假定方差不齐性(AssumingUnequalVariance)比较PBS处理的检测动物的显著性(p^O.05)。结果如表7A-7B所示。在移植后7天，所有组的平均肿瘤体积和面积分别为约200mm3和30mm2。在移植7天后，对肿瘤生长的药效变的明显。剂量为107U/kg的IFNa2b画N7(SEQIDNO:48)、PEG(40kDa)-IFNa2b-N7和Pegasys显著地抑制了肿瘤的生长。剂量为106U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7和？6§&373@显示出中等程度的抑制肿瘤生长的作用，但不具有统计显著性。在移植后11-21天期间，每周三次通过IntronA⑧处理的动物显示出一定水平的对肿瘤生长的抑制。然而，IntronA⑧处理21天的小鼠证明处理效果降低，与研究结尾阶段通过PBS处理的动物的肿瘤体积和面积没有显著的区别，如图7A所示。107U/kg的小鼠剂量转换为840pg/dose的人体等效剂量，该人体等效剂量为Pegasys的人体推荐剂量(180pg/dose)的约5倍。由于毒性，Pegasys不能够以如此高的浓度进行给药；然而，这样剂量的聚乙二醇化的IFNa2b-N7并不受到副作用的处理限制。实施例7聚乙二醇化的IFNa2b-N7的体内效力通过对用于人乳腺癌的裸鼠异种移植模型的抗肿瘤效力来检测PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的效力。在此模型中，还比较了PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的每周和每两周的给药间隔。在雌性裸鼠的右侧腹部以5X106个细胞/200微升SC的浓度，移植乳腺导管癌细胞株(HCC1954)。HCC1954细胞株(ATCCCRL-2338)分离自无淋巴结转移的初始阶段的浸润性导管癌。在异种移植后4天开始处理。对检测动物施以的PBS(10mL/kg)、107U/kg(每周或每两周)的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7，每两周108U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7。通过数字测径仪检测肿瘤。每周对肿瘤进行2次检测，以确定肿瘤体积。肿瘤体积的几何平均数用于标准化数据以及降低极端数据偏差。用微软Excel的线性回归曲线拟合程序来确定每条肿瘤生长曲线的线性生长率(斜率)。通过梯形法确定曲线下面积(AUC)，记录正常转换数据用于统计分析并比较处理效果。研究结束时(异种移植后28天)，对检测动物实施安乐死。用变量分析(ANOVA)来确定处理作用的统计学显著性(pS0.05)。变量分析后进行T-测试用两样品的假定方差不齐性(AssumingUnequalVariance)比较PBS处理的检测动物的显著性(p^O.05)结果如图8A-8B所示。在异种移植后7天的首次检测中观察肿瘤体积的药物处理效果。PBS(菱形，图8A)、每周107U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7、每两周1()7u/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7(三角形)、以及每两周108U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7(圆形)处理的首次检测的平均肿瘤体积分别为约144±15.00、122±14.00、103±7.33和110±15,41mm3。在使用PEG(40kDa)-IFNa2b-N7的所有剂量组和剂量间隔的研究中均观察到具有显著的肿瘤生长抑制作用。正如各个肿瘤生长曲线的斜率所确定的那样，在处理0-18天期间内，每周107U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7、每两周107U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7以及每两周108U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7处理的肿瘤生长率(分别为5.27、3.614和3.614毫米V天)稍微比PBS对照组(8.63毫米3/天)的缓慢。然而，在处理18-28天期间内，处理的检测动物的肿瘤生长率与PBS处理相比显著降低(每周107U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7:7.3毫米3/天；每两周107U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7:12.67毫米3/天；每两周108U/kg的PEG(40kDa)-丽a2b-N7:7.91毫米V天；和PBS:39.64毫米V天)。使用每周107U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7;每两周107U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7;以及每两周108U/kg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7处理的检测动物的AUC分析表明与PBS处理相比在肿瘤生长上具有统计学上的显著作用(分别为，38.85、47.07和61.27%的抑制率)。实施例8聚乙二醇化的IFNot2b-N7的体内病毒感染治疗叙利亚金仓鼠(Syriangoldenhamster)对脑炎心肌炎病毒(EMCV)和单纯疱疹病毒(HSV)感染非常敏感。因此，选择EMCV和HSV对仓鼠进行攻击研究，从而证明IFNas的体内抗病毒作用。叙利亚金仓鼠(雌性；鼠龄6-8周；重65-75g;CharlesRiverBreedingLaboratories)被注射有lx103PFU和3xl03PFU的EMCV(300pl)。在注射EMCV6小时之前，每个仓鼠注射如下剂量的IFNa2b-N7、PEG(40kDa)-IFNa2b-N7、rHulIFNa2b或PEG-HulIFNa2b:104U、105U、10611和10711;注射PBS作为对照。五个检测组中，每个检测组有5只仓鼠。在另一组检测动物中，叙利亚金仓鼠(雌性；重65-75g;CharlesRiverBreedingLaboratories)接受300jul的HSV-2病毒接种，该病毒接种含有104TCID5Q/ml，将导致平均存活期为5天。在感染6或10小时后，施以单次剂量为105、106和1()7单位的IFNa2b-N7、PEG(40kDa)-IFNa2b-N7、rHuIFNa2b或PEG-HuIFNa2b。注射PBS作为对照。五个检测组中，每个检测组有10只仓鼠。通过每日的记录确定感染后的仓鼠的存活时间。通过log-rankchi-square方法评价各个处理组之间存活时间差异的显著性。通过PEG(40kDa)-IFNa2b-N7处理的检测动物的存活时间比其它检测动实施例9聚乙二醇化的IFNa-N7体内治疗丙型肝炎将24名诊断为丙型肝炎的患者分为4个治疗组。使用90pg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7治疗组1中的患者；使用180pg的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7治疗组2中的患者；使用450吗的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7治疗组3中的患者；使用90吗的PEG(40kDa)-IFNa2b-N7治疗组4中的患者。患者每周接受上述剂量，共4周。在检测期间和处理后4周期间内，采集血样并检测作为治疗丙型肝炎感染的生物标记的丙氨酸转移酶。上面已经讨论了多个示例性方面和实施方式，本领域技术人员能够认同它的修改、替换、补充以及组合。应当理解为，在本发明的实质精神和范围内，所附权利要求以及后续的权利要求应理解为包括所有的修改、替换、补充以及组合。权利要求1.一种组合物，该组合物含有与至少一种亲水聚合物链共价结合的天然人干扰素α的蛋白类似物。2、根据权利要求1所述的组合物，其中，所述亲水聚合物链为聚乙二醇。3、根据权利要求1所述的组合物，其中，所述蛋白类似物为天然人干扰素-a-d的蛋白类似物。4、根据权利要求3所述的组合物，其中，所述蛋白类似物的氨基酸序列在位点19、20、22、24和27中的一个或多个位点上与天然人干扰素-a-d的氨基酸序列不同。5、根据权利要求1所述的组合物，其中，所述蛋白类似物为天然人干扰素-a-2b的蛋白类似物。6、根据权利要求5所述的组合物，其中，所述亲水聚合物链为聚乙二醇。7、根据权利要求6所述的组合物，其中，所述聚乙二醇为支链聚乙二醇。8、根据权利要求5所述的组合物，其中，所述蛋白类似物的氨基酸序列在位点19、20、22、24和27中的一个或多个位点上与天然人干扰素-a-2b的氨基酸序列不同。9、根据权利要求8所述的组合物，其中，所述蛋白类似物具有如SEQIDNO:48所示的序列。10、根据权利要求8所述的组合物，其中，所述亲水聚合物链为聚乙二醇。11、根据权利要求IO所述的组合物，其中，所述聚乙二醇为支链聚乙二醇。12、一种治疗病毒感染的方法，该方法包括以能够有效地治疗感染的给药量，对患有病毒感染的患者使用与至少一种亲水聚合物链共价结合的天然人干扰素a的蛋白类似物进行给药。13、根据权利要求12所述的方法，其中，所述病毒感染选自由肝炎病毒感染、人乳头瘤病毒感染、疱疹病毒感染和人免疫缺陷病毒感染所组成的组中。14、根据权利要求13所述的方法，其中，所述肝炎病毒感染为丙型肝炎病毒感染。15、根据权利要求13所述的方法，其中，所述肝炎病毒感染为乙型肝炎病毒感染。16、根据权利要求12所述的方法，其中，所述给药包括肠道外给药。17、根据权利要求12所述的方法，其中，所述给药包括将所述蛋白类似物至少每周给药一次。18、根据权利要求12所述的方法，其中，所述给药包括每周至少给药约200吗的所述蛋白类似物。19、根据权利要求12所述的方法，其中，所述给药包括使用天然人干扰素-ot-d的蛋白类似物进行给药。20、根据权利要求12所述的方法，其中，所述给药包括使用天然人干扰素-a-2b的蛋白类似物进行给药。21、根据权利要求20所述的方法，其中，所述给药包括使用具有如SEQIDNO:48所示序列的蛋白类似物进行给药。22、根据权利要求12所述的方法，其中，所述给药包括使用与聚乙二醇共价结合的蛋白类似物进行给药。23、根据权利要求22所述的方法，其中，所述给药包括使用与支链聚乙二醇共价结合的蛋白类似物进行给药。24、一种治疗增生性病变的方法，该方法包括以能够有效地治疗该病变的给药量，对患有增生性病变的患者使用与至少一种亲水聚合物链共价结合的天然人干扰素a的蛋白类似物进行给药。25、根据权利要求24所述的方法，其中，所述增生性病变为肿瘤或癌症。26、根据权利要求24所述的方法，其中，所述给药包括肠道外给药。27、根据权利要求24所述的方法，其中，所述给药包括使用天然人干扰素-a-2b的蛋白类似物进行给药。28、根据权利要求24所述的方法，其中，所述给药包括使用与聚乙二醇共价结合的蛋白类似物进行给药。29、根据权利要求28所述的方法，其中，所述给药包括使用与支链聚乙二醇共价结合的蛋白类似物进行给药。全文摘要公开了一种通过与至少一种亲水聚合物部分如聚乙二醇链进行化学连接而修饰的干扰素α(IFNα)类似物蛋白。在一实施方式中，干扰素α类似物蛋白具有与天然干扰素α不同的氨基酸序列，其中，不同在于包括由大约1-27个残基组成的N-末端区域的一个或多个氨基酸被选自与成熟干扰素τ(IFNτ)蛋白的氨基酸残基相对应的一个或多个氨基酸替换。还公开了通过使用聚合物修饰的IFNα类似物蛋白治疗病毒疾病或其它疾病的方法。文档编号A61P31/12GK101257925SQ200680030200公开日2008年9月3日申请日期2006年6月20日优先权日2005年6月20日发明者L·H·维拉里特,刘治平申请人:派普根公司