肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞及其抑癌用图
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因修饰淋己细胞过继免疫治疗领域。特别设及一种肿瘤结合特异性 丫 5TCR基因修饰的aPT细胞及其抑癌用途。
【背景技术】
[0002] 肿瘤的免疫治疗被人们寄予厚望，其原理是通过利用现代生物技术，人为的调节 肿瘤患者机体的免疫功能状态，调控抗肿瘤免疫的各个环节之间的平衡，从而达到控制肿 瘤或减少治疗带来的相关毒副作用的目的。在所有目前开发的免疫治疗途径中，细胞的过 继免疫治疗通过体外活化和扩增自体或异体免疫效应细胞后输注患者体内，被认为是最有 潜力的免疫治疗策略。
[0003] 在过继免疫治疗中，常用的用于过继回输的天然的细胞有肿瘤浸润淋己细胞 灯IL)、淋己因子激活的杀伤细胞（LAK细胞）、自然杀伤细胞（NK细胞）、自然杀伤T细胞 (MT细胞）、细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）、细胞毒性T淋己细胞（CTL细胞）等。 然而，肿瘤抗原特异性强、亲和力好的免疫细胞来源困难、数量较少，而且运些细胞经过体 外长时间培养扩增，其体内的持续时间、杀瘤活性未能达到临床应用的需求，在一定程度上 制约过继免疫治疗的发展。
[0004] 基因修饰的免疫细胞是利用基因重组技术，按照需求对天然存在的免疫细胞进 行改造，能很好的解决肿瘤特异性和体内持续杀瘤活性的问题。嵌合抗原受体（化imeric antigenrec巧tor,CAR)修饰的T细胞就属于一类基因修饰的T细胞，它在临床试验治疗B 淋己细胞瘤上取得突破性进展。除CAR-T细胞W外，还有一大类基因修饰的T细胞，是T细 胞受体灯CR)修饰的T细胞。应用基因工程技术使所有T淋己细胞表达特异性识别肿瘤的 TCR分子，能大大提高T细胞的抗肿瘤的能力。
[0005] 作为T细胞群体的另一类，丫 5T细胞在抗肿瘤免疫治疗中具有独特的优势： ①丫 5T细胞主要WMHC非限制性方式识别抗原，它克服了aPT细胞抗肿瘤免疫的MHC 限制性的局限；②抗原识别谱广泛，如肤类、非肤类、醇类等，并且可识别aPT细胞不能识 别的抗原，因此，在功能上可作为aPT细胞免疫监视的重要补充；③肿瘤浸润的丫 5T淋 己细胞表达Fc受体，在TCR-CD3复合体的表达或/和组装上有缺陷时，仍可传递信号，运是 aPT细胞所不具备的；④通过细胞毒作用和产生细胞因子来发挥效应功能；⑥识别一些 内源性应激抗原，快速活化，杀瘤谱广，对血液系统肿瘤和实体瘤均有杀伤作用。
[0006] 但是，由于在外周血中丫 5T细胞的比例很低，天然的丫 5T细胞制剂用于临床肿 瘤的过继治疗需要在体外进行较长时间的扩增，才能达到治疗所需的剂量。而中晚期肿瘤 患者或化疗后患者体内免疫抑制，导致丫 5T细胞数量减少和免疫活性下降；鼠源性抗体 和牛血清成分的使用会导致回输的细胞引起体内免疫反应等诸多问题，致使治疗用丫 5T 细胞的制备在方法上仍存在一些问题亟待解决。因此，利用基因工程技术，制备足够数量的 具有细胞肿瘤反应特异性的、无/低毒性的丫ST免疫效应细胞的研究势在必行。
[0007]丫5 T细胞受体（丫5 TCR)包含丫链灯CR丫）和5链灯CR 5)，其抗原识别位 点主要存在于5链可变区（V5链）的互补决定区（CDR)，其中CDRl和CDR2区是由胚系 基因V编码，而CDR3区则是通过V值）和J基因的体细胞重组形成的。W往的研究结果表 明，丫5 TCR与B细胞受体度C吩和抗体在结构上高度类似。CDR3长度分布图表明，抗体 重链（H)和TCR 5链CDR3的长度变化最大，且较轻链（L)和丫链者明显的长。运些结构 基础提示与抗体识别抗原过程中抗体重链CDR3序列起着关键识别作用一样，5链CDR3区 (CDR3 5)在丫5 T细胞识别抗原中也起着关键作用。
[000引已有研究对胃癌患者肿瘤浸润的丫5T细胞的CDR35进行序列分析，发现了一 条不同患者所共有的优势CDR3 5序列，并将其命名为GTM序列。人工合成的GTM肤能特 异性的与多种肿瘤组织、肿瘤细胞系及丫5T细胞识别的配体MICA蛋白结合；TCR丫4/ 5 I(GTM)-Fc融合蛋白也能特异性的与多种肿瘤组织、肿瘤细胞系及MICA蛋白结合；用含 GTM序列的5 1链和丫4链修饰J. RT3-T3. 5细胞，能增强其对多种肿瘤细胞的细胞毒活 性，运些结果从不同水平上证明了GTM具有肿瘤结合特异性灯an Jiang, Yang Guo, Xu巧an Xi, Lianxian Cui,and Wei He*, Flanking V and J sequences of complementary determining region 3 of T cell receptor (TCR) 5 I (CDR5 I)determining the shucture and function of TCR丫4 5 1. !"he J. Biol. Chem, 2011,286(29):25611 -25619)O
【发明内容】
[0009] 基于W上所述问题，本发明的目的在于提供一种肿瘤结合特异性丫5TCR基因修 饰的aPT细胞，为肿瘤的过继性免疫治疗提供了新的方法和策略。
[0010] 申请人前期对胃癌患者肿瘤浸润的丫5 T细胞的CDR3 5序列进行分析，发现不同 个体胃癌的丫5 TIL的优势CDR3 5序列趋于相同。其中，S例胃癌患者的丫5 TIL所共有 的优势CDR3 5序列，如前所述，本说明书中，将该优势CDR3 5序列命名为GTM序列，其氨基 酸序列如SEQ ID NO: 1所示。 阳0川 a 0 T细胞占外周血淋己细胞比例较高，容易获得，体外扩增时间短，如经CD3单 抗、PHA、CD3-CD28磁珠刺激等方式，短时间内即可获得大量a PT细胞。然而a PT细胞 的活化需要抗原提呈细胞的提呈，一对一的针对特异性抗原，有血IC限制性，并且协同刺激 信号缺乏或者抑制性的肿瘤微环境都抑制了aPT细胞的充分快速活化，成为肿瘤免疫逃 逸的途径。而丫5T细胞能通过丫5TCR识别一类在多种肿瘤表达的应激分子，快速活化， 启动对祀细胞的细胞毒活性，具有杀瘤谱广及更易于充分活化的特点，在肿瘤的过继免疫 治疗的候选细胞中具有独特的优势。
[0012] 基于此，本发明一方面提供了一种肿瘤结合特异性丫5TCR基因修饰的a PT细 胞，所述a PT细胞表达肿瘤结合特异性丫5 TCR，所述肿瘤结合特异性丫5 TCR包括丫4链和5 1链，所述5 1链CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。 阳01引在本说明书中将肿瘤结合特异性丫S TCR基因修饰的a PT细胞命名为 丫4S I(GTM)-Q PT细胞。将该a PT细胞表达的肿瘤结合特异性丫STCR命名为 丫4 5 UGTM) TCRo
[0014] 优选地，所述丫4链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，所述5 1链的氨基酸序列 如沈QIDNO:3所示。
[0015] 可选地，所述aeT细胞是通过可表达所述肿瘤结合特异性丫 5TCR的表达载体 感染或转染所得。
[0016] 优选地，所述表达载体是重组慢病毒。
[0017] 优选地，所述重组慢病毒的出发载体是pC畑-CMV-MCS-EFl-copGFP，插入该出发载 体的表达所述肿瘤结合特异性丫 5TCR的基因序列如SEQIDN0:4所示，该基因是将所述 丫 4链的基因片段、CMV启动子的基因片段、所述5 1链的基因片段，通过限制性内切酶酶切 和连接反应串联而得。
[0018] 可选地，所述肿瘤结合特异性丫 5TCR基因修饰的a0T细胞经肿瘤细胞蛋白刺 激后，IL-2和IFN-丫分泌增加。
[0019] 可选地，所述肿瘤结合特异性丫 5TCR基因修饰的a0T细胞通过穿孔素/颗粒 酶途径对肿瘤细胞起细胞毒作用。
[0020] 可选地，所述的肿瘤结合特异性丫 5TCR基因修饰的a0T细胞是无自身免疫反 应的细胞。
[0021] 本发明另一方面提供了上述肿瘤结合特异性丫 5TCR基因修饰的a0T细胞在制 备抗肿瘤细胞制剂中的用途，或者在制备含IL-2的抗肿瘤细胞制剂中的用途。
[0022] 可选地，所述的肿瘤是肝细胞癌、胃癌、髓系白血病。
[002引本发明研究发现，上述肿瘤结合特异性丫 5TCR基因修饰的aPT细胞与肿瘤细 胞共解育后，在体外其IL-2和IFN-丫的分泌大大增加，同时，对多种肿瘤细胞的细胞毒活 性也显著性增强，颗粒酶B的表达显著增加，表明上述细胞能够被肿瘤抗原活化，且具有抗 肿瘤作用。同时，上述细胞回输不会引起自身免疫反应。体内研究发现，通过荷人肝细胞癌 移植瘤裸鼠模型，肿瘤局部注射所述细胞，肿瘤的生长明显受到抑制。
[0024] 综上，所述细胞具有广泛的抗肿瘤作用，如针对肝细胞癌、胃癌、髓系白血病等。并 且，不存在外源TCR丫 5和内源TCRa0的交叉互配情况，对正常细胞没有细胞毒活性，没 有自身反应性风险，具有获得较佳的治疗效果，可W应用于制备抗肿瘤细胞制剂。为肿瘤的 过继性免疫治疗提供了新的方法和策略。
【附图说明】 阳02引 图IA-图IF: 丫 4S1 (GTM