特异性识别GS基因的crRNA及其应用
【专利摘要】本发明属于细胞基因工程、遗传修饰以及治疗性重组蛋白工业化生产领域，具体涉及特异性识别GS基因的crRNA及其应用，所述crRNA识别的DNA序列选自SEQ ID NO.1?SEQ ID NO.8之一所示的DNA序列。本发明设计的crRNA可以特异性的识别多种细胞的GS基因，适用性广，整个过程操作简单，高效；本发明中敲除GS基因的细胞在导入外源载体的基础上，相对于野生型宿主细胞，目的蛋白的表达量大幅提高，从而减少蛋白表达细胞株筛选所需投入的人力、物力及财力，且通过敲除GS基因可以降低工业生产的成本。以GS敲除细胞为宿主的目的基因表达细胞，其生产过程无需再添加别的化学物质，提高了生产的安全性。
【专利说明】
特异性识别GS基因的crRNA及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于细胞基因工程、遗传修饰以及治疗性重组蛋白工业化生产领域，具体 涉及特异性识别GS基因的crRNA及其应用。
【背景技术】
[0002] 哺乳动物细胞是目前生产治疗用复杂蛋白质药物的主要工具，而其中中国仓鼠卵 巢细胞(Chinese Hamster Ovary Cells,CH0)为最常用的宿主细胞，目前已经广泛应用于 工业生产。基于CH0细胞的蛋白表达系统中，二氢叶酸脱氢酶(Dihydrofolate Reductase, DHFR)及谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase，GS)为最常用的两个选择基因。其中GS系 统因为其易用性及稳定性，正逐渐成为使用最广泛的表达筛选系统。GS是L-谷氨酰胺合成 途径中的关键酶(critical enzyme)，它的缺失会导致细胞自身无法合成L-glutamine，从 而需要依赖于外界环境提供的L-glutamine才能生存。
[0003] 传统的GS系统是通过在细胞筛选的过程中添加 GS的抑制剂MSX的方式得到外源蛋 白高表达细胞株。理论上来说，只有高表达GS基因的细胞才能在高浓度的MSX存在的条件下 生存;转染含目的基因的GS表达载体之后，载体没有整合到宿主细胞基因组DNA的细胞、或 者载体整合到了基因组沉默区的细胞，都将无法在高浓度MSX存在的条件下存活。然而，实 际情况是，类似CHO-Kl、CHO-S、CHOKlSV这些包含功能正常的GS基因的细胞，在不含L-glutamin e的培养基中能够生长，某一些细胞在高浓度MSX存在的条件下依旧能够生长。得 到以上结论的依据在于，使用MSX筛选得到的克隆，有很高比例没有目的蛋白的表达。这说 明传统的含正常GS基因的CH0细胞作为重组蛋白的表达宿主这个表达系统，是一个不严谨 的系统。因此，降低宿主细胞的GS基础表达就非常重要，从而凸显出GS基因缺陷的细胞株的 重要性。
[0004] 在GS缺失的细胞中转入含GS选择基因的重组蛋白表达载体，将会大幅提高重组蛋 白的表达，降低高表达细胞株筛选所需的工作量。
[0005] GS缺失细胞的构建是近20年来CH0细胞工程改造的一个热点。一直以来，和GS相关 的技术，都因为知识产权的问题被拖累。但是，其中很多技术保护到2014已经过期。因此，很 多用于GS筛选系统的技术得以应用于商业。其中比较显著的推进因素在于基因编辑技术的 快速发展，比如zinc finger endonucleases(ZFN)，mega-nucleases，TALENs以及CRISPR。
[0006] CRISPR是基因编辑技术中功能最全面的一个技术，因为他的靶向机制是通过特异 性的RNA序列通过互补的作用结合到基因组需要进行编辑的位置。CRISPR通过使用RNA簇使 得同时进行多基因编辑成为可能。细胞中的双链断裂(double strand break,DSB)可以通 过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)的方式被修复，这种修复发生的 频率较低，并且这种修复最后会造成基因被剪切处小片段发生核酸的插入或者缺失，导致 基因发生移码从而使得目的基因失去功能。
[0007] CRISPR系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制， 可以识别并沉默入侵的病毒及外源DNA。近年来，由于基因工程技术的突飞猛进，CRISPR已 经成为科学界最炙手可热的热点之一，被广泛应用于各类体内和体外体系的遗传学改造、 转基因模式动物的构建，甚至基因治疗领域。该体系其中一个最重要的优势是Cas9蛋白可 在多个不同的crRNA的引导下同时打靶多个基因组位点。这种优势使得同时将不同基因一 起敲除成为可能，很大程度上提高了基因编辑的效率。
[0008] CN 104651399 A公开了一种利用CRISPR/Cas系统在猪胚胎细胞中实现基因敲除 的方法，包括下述步骤:构建Cas9真核表达载体;构建gRNA表达载体;将目的基因靶序列插 入gRNA表达载体中；将Cas9真核表达载体和插入了目的基因的插入gRNA表达载体用限制性 内切酶线性化，再以线性化的质粒为模板进行体外转录，体外转录分别获得hSpCas9的mRNA 和gRNA2#的crRNA，最终将hSpCas9的mRNA和gRNA2#的crRNA通过显微注射至猪IVF胚胎的胞 质中，实现敲除。这个方法有效且成本低，为其他基因的敲除奠定了基础。
[0009] CN 102177235 A公开了一种I-Crel变体，其中两个I-Crel单体之一具有至少两个 替换，其中LAGLIDADG核心结构域的两个功能性亚结构域中各有一个，所述亚结构域分别位 于I-Crel的28到40位以及44到77位，所述变体能够切割来自谷氨酰胺合成酶基因的DNA靶 序列。该专利仅仅只能针对GS基因的其中第6个外显子进行敲除，效率低，且敲除过程复杂。
【发明内容】
[0010] 针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供特异性识别GS基因的crRNA及其 应用，所述crRNA可以特异性的靶向GS基因，对细胞进行基因组编辑，该方法可针对GS基因 的多个外显子进行混合敲除，效率高，安全性能高。
[0011 ]为达此目的，本发明采用以下技术方案：
[0012]第一方面，本发明提供特异靶向GS基因的crRNA，其靶向DNA序列选自SEQ ID NO. 1-SEQ ID NO.8之一所示的DNA序列，crRNA序列为SEQ ID NO.9-SEQ ID NO. 16之一的序 列。
[0013]靶向DNA序列（5'-3'）：
[0039] 本发明中，根据多种细胞的GS基因的保守序列设计的crRNA，可适用于多种细胞的 GS基因的敲除，crRNA与Cas9表达质粒、tracrRNA-起转入宿主细胞，crRNA可以在特异性识 别其相对应的GS敲除位点，引导Cas9蛋白到指定位点进行切割，除此之外，可以通过向细胞 中同时导入一个Cas9蛋白和多个crRNA的方式轻松实现GS基因的2-7号外显子的混合敲除， 提尚效率。
[0040] 第二方面，本发明提供一种用于GS基因敲除的CRISPR编辑系统，所述表达系统包 括如第一方面所述的RNA序列和Cas9蛋白表达质粒。
[0041] 第三方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞为使用如第二方面所述的编 辑系统所得。
[0042] 优选地，所述宿主细胞利于外源目的基因的表达。
[0043] 优选地，所述目的蛋白为重组糖蛋白、重组激素、重组酶类、重组抗体或抗体片段 中的任意一种。
[0044] 优选地，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞。
[0045] 优选地，所述哺乳动物细胞为CH0、NS0或293细胞及这三种细胞的衍生
[0046] 细胞中的任意一种。
[0047]第四方面，本发明提供一种利用如第二方面所述的表达系统敲除GS基因的方法， 包括以下步骤：
[0048] (1)构建特异性靶向GS基因的crRNA;
[0049] (2)将步骤（1)的crRNA和Cas9蛋白表达质粒以及tracrRNA，混合，转入至宿主细胞 中，以生产GS基因敲除的细胞；
[0050] (3)步骤(2)中的转入宿主细胞的形式可以是多种的：优选地，所述方法为电穿孔 转染、脂质体转染、核转染中的任意一种。
[0051] 第五方面，本发明提供如第四方面所述的方法在制备敲除GS基因的细胞中的应 用。
[0052]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0053] (1)本发明设计的crRNA可以特异性的识别多种细胞的GS基因，适用性广，转染效 率高，整个过程操作简单，高效；
[0054] (2)本发明的crRNA可以通过同时导入一个Cas9蛋白表达质粒和多个crRNA的方式 实现GS基因的2-7号外显子中一个或几个的混合敲除，这无论是敲除效率还是操作简便程 度上都是其他技术无法比拟的；
[0055] (3)本发明的crRNA敲除的细胞作为宿主细胞，与传统使用非敲除细胞作为宿主的 GS表达系统相比，转入外源重组蛋白表达基因后，能够筛选得到高表达克隆的概率大幅增 高，无蛋白表达及低表达的克隆数量大幅降低；
[0056] (4)本发明的crRNA敲除的细胞作为宿主细胞，其在提高高表达克隆比例的贡献， 使得克隆筛选所需投入的劳动力、高昂的仪器费用(FACS、Clone Pix)等得到大幅降低，同 时得到可用于生产的高表达克隆的周期也大大缩短，从原先的9~12个月缩短至4~5个月；
[0057] (5)本发明中敲除GS基因的细胞在导入外源载体的基础上，可以高效表达目的蛋 白，通过单位体积表达量的提高，降低生产规模，从而达到降低工业生产成本的有益效果， 生产过程无需再添加存在致病风险的化学物质，提高了生产的安全性。
【附图说明】
[0058] 图1是中国仓鼠卵巢细胞GS基因结构图。
[0059] 图2是L-Gln对GS敲除细胞生长的影响。
[0060] 图3是野生型细胞与GS敲除细胞的生长与培养基中L-Gln的关系图。
[0061] 图4是GS敲除细胞与野生型细胞表达相同糖蛋白的酸碱分布图。
[0062]图5是在200L规模培养以GS敲除细胞为宿主的重组蛋白表达细胞的应用。
【具体实施方式】
[0063]为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实 施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
[0064] 实施例1:针对GS基因的CRISPR_Cas9表达系统的构建
[0065]中国仓鼠卵巢细胞的GS基因包含7个外显子，其中外显子2~7编码表达GS蛋白（图 1)，其对正常功能的发挥起到至关重要的作用。针对GS基因的2~7外显子分别设计了 crRNA 序列。使用这些crRNA序列和Cas9蛋白质能够使得表达出的GS蛋白失去功能。GS的exon2~7 外显子部分序列如下(外显子使用下划线"_标记）：
[0078] 针对以上外显子所设计的crRNA序列如下(表1):
[0079] 表 1
[0081 ] 实施例2:对CH0-K1细胞进行GS基因的敲除及验证
[0082] 将设计好的crRNA与Cas9蛋白表达载体对经⑶培养基驯化过的CH0-K1细胞进行转 染，共设计A~P共16种转染或转染组合。
[0083] CH0-K1细胞购自ATCC，细胞培养采用DMEM/F12基础培养基，添加5%的胎牛血清。 将扩增后的CH0-K1细胞采用CD CH0培养基进悬浮培养，添加谷氨酰胺以及HT添加剂。
[0084]细胞适应悬浮培养之后，将crRNA与Cas9蛋白表达载体转染至细胞中。转染48hr后 添加 Puromycin至细胞培养基中，培养4天后，将存活的细胞挑选出，进行亚克隆培养。亚克 隆细胞长出后，将细胞分别转移至含L-Gln以及不含L-Gln的培养基进行培养。将在不含L-Gln的培养基中无法生长，在含L-Gln的培养基中可以正常生长的克隆挑选出，进行扩增培 养。
[0085] 对A~P共16种转染或转染组合所筛选得到的GS敲除细胞进行统计，数据表明进行 3种到4种靶点共同敲除，其敲除效率最高，结果见表2。
[0086] 表 2
[0089] 将扩增培养的克隆转移至摇瓶进行培养。对在摇瓶中能够正常生长的细胞进行 Gin撤除验证，筛选出在悬浮状态下，生长好，必须依赖Gin生长的细胞(如图2-3)。通过以上 方法，共筛选得到20株GS基因缺失细胞株。
[0090] 实施例3 :GS基因缺陷细胞表达抗体实验
[0091] 对挑选出的GS K01和GS K02细胞进行抗体表达转染实验，野生型CH0-K1细胞作为 对照宿主。将KJ015通过完全相同的方法转染至GS K01、GS K02XH0-K1细胞。转染后48hr， 添加25μΜ MSX作为筛选压力。静置培养2周之后，克隆长出，对长出克隆的数量及24hr抗体 表达量最高的25个克隆进行对比，结果如表3所示。三者长出的克隆数量差异较小，表达量 GS K01和GS K02为宿主的克隆明显表达量高。
[0092] 表 3
[0095] 将表达量较优的细胞进行扩增培养，并收集表达产物，以IEC为关键质量指标分析 表达抗体的质量。结果显示GS敲除细胞产物质量与野生型细胞产物的质量能够达到相同水 平(表4)。
[0096] 表 4
[0098]实施例4:GS基因缺陷细胞表达糖蛋白实验
[0099] 对挑选出的GS K01和GS K02细胞进行糖蛋白表达转染实验，野生型CH0-K1细胞作 为对照宿主。将KJ018通过完全相同的方法转染至GS K01、GS K02、CH0-K1细胞。转染后 48hr，添加 25μΜ MSX作为筛选压力。静置培养2周之后，克隆长出，对长出克隆的数量及24hr 糖蛋白表达量进行统计，结果如表5所示。三者长出的克隆数量差异较小，表达量GS KOI和 GS K02为宿主的细胞明显表达量高。
[0100]表5
[0102] 将表达量较优的细胞进行扩增培养，并收集表达产物，以IEF为关键质量指标分析 表达糖蛋白的质量。结果显示GS敲除细胞产物质量与野生型细胞产物的质量能够达到相同 水平（图4)。
[0103] 实施例5:以GS基因缺陷细胞为宿主的抗体表达细胞的规模化培养(200L)
[0104]将筛选得到的抗体高表达细胞株GS K01A5在摇瓶中进行扩增培养，当细胞处在对 数生长期时，将细胞接种至14L生物反应器，工作体积10L。经反应器扩增的细胞，接种至 200L反应器。接种后细胞密度为0.3X10 6cells/mL左右，反应器起始工作体积为130L，设定 各项参数温度37°C、pH 6.90-7.20，D0 20%-50%，每天无菌取样，检测葡萄糖及乳酸盐含 量。培养采用的工艺为补料批培养。培养过程中需要监测的指标有:温度、PH、葡萄糖浓度、 乳酸盐浓度、摩尔渗透压浓度、表达蛋白质浓度。
[0105]细胞在反应器生长11天，抗体表达量为5.1 g/L，结束培养时，细胞状态良好，活力 为98% (图5)。以上结果表明，GS缺陷细胞能够在200L规模进行培养，并且能够维持良好的 细胞状态、蛋白的高表达以及质量。根据此结果推测，该克隆的宿主GS缺陷细胞适用于重组 蛋白工业化生产细胞的宿主细胞。
[0106]
【申请人】声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局 限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的 技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的 添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
【主权项】
1. 特异靶向GS基因的crRNA，其特征在于，所述crRNA序列为SEQ ID N0.9-SEQ ID NO. 16之一的序列，识别的DNA序列选自SEQ ID NO. I-SEQ ID NO.8之一所示的DNA序列。2. -种用于敲除GS基因的CRISPR基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括 如权利要求1所述的crRNA序列的一种或至少两种的组合、Cas9蛋白表达载体以及 tracrRNA。3. -种重组蛋白表达宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞系通过如权利要求2所述的 系统对该细胞进行基因编辑所得。4. 根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞，其GS基因功能缺失。5. 根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞，能够高效表达包含外 源目的蛋白的喊基序列； 优选地，所述目的蛋白为重组糖蛋白、重组激素、重组酶类、重组抗体或抗体片段中的 任意一种。6. 根据权利要求4或5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自哺乳动物细胞； 优选地，所述哺乳动物细胞为CH0、NS0或293细胞及这三种细胞的衍生细胞中的任意一 种。7. -种利用权利要求2所述的基因编辑系统敲除GS基因的方法，其特征在于，包括以下 步骤： (1) 构建特异性靶向GS基因的crRNA; (2) 将步骤（1)的crRNA和tracrRNA以及Cas9蛋白表达载体混合，转入宿主细胞中，以生 产GS基因功缺失的细胞； (3) 步骤(2)中的转入宿主细胞的形式可以是多种的： 优选地，所述方法为电穿孔转染、脂质体转染、核转染中的任意一种。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述混合后，crRNA和tracrRNA的 摩尔比例为1:1。9. 权利要求7或8所述的方法在制备敲除GS基因的细胞中的应用。10. 根据权利要求6所述的宿主细胞在制备重组蛋白中的应用；优选地，所述重组蛋白 为临床治疗用药物。
【文档编号】C12N15/12GK105950622SQ201610339868
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】徐云霞, 王征
【申请人】苏州康聚生物科技有限公司