位点特异性胰岛素缀合物的制作方法
【专利说明】位点特异性膜岛素缀合物 【技术领域】
[0001] 本发明设及非肤基聚合物连接体和免疫球蛋白恒定区通过共价键与膜岛素0链 (除其N-端外）的氨基酸残基特异性地连接的缀合物（con化gate)及其制备方法。 【【背景技术】】
[0002] 膜岛素是由人膜腺0细胞分泌的肤，作为在控制机体的血糖水平中起着非常重 要作用的物质。在机体中膜岛素分泌不正常或者所分泌的膜岛素不正常起作用的情况下， 机体中的血糖不能被控制并且增加，从而引发称为糖尿病的状况。上面所述的情况被称为2 型糖尿病，而膜腺不分泌膜岛素而使血糖增加的情况被称为1型糖尿病。用含化学物质作 为主要成分的口服降血糖剂治疗2型糖尿病，而在某些患者中，也用膜岛素进行治疗。另一 方面，1型糖尿病的治疗必然需要施用膜岛素。
[0003] 目前广泛使用的膜岛素治疗是通过在餐前和餐后注射而施用膜岛素的方法。但 是，运种膜岛素治疗需要每天3次连续施用，因而导致患者更加痛苦或不便。为了克服运一 问题已进行了许多尝试。其中之一是尝试通过增加肤药物的生物膜渗透性，将肤药物通过 经口或鼻腔吸入的方式递送到机体中。然而，与注射相比，运种方法显示出肤递送到机体中 的效率非常低。因此，在保持所需条件的肤类药物体内活性方面仍存在很多困难。
[0004]另外，已经尝试在皮下注射大量药物后延迟吸收的方法。据此，已经提出通过每 日仅施用一次来保持血药浓度的方法。一些药物已被批准作为医药产品（例如，Lan^s, Sanofi-aventis)，并且当前对患者施用。已进行研究W用脂肪酸修饰膜岛素从而使膜岛素 聚合物的结合更强并通过与存在于施用部位和血液中的白蛋白结合而延长持续时间，并且 使用运种方法生产的药物已被批准作为医药产品化evemir，NovoNordisk)。然而，运种方 法具有引起施用部位处疼痛的副作用，另外，每日注射一次的施用间隔还会引起患者的极 大不便。 W05] 同时，报道了膜岛素0链的N-端或C-端区域，即位置29处的氨基酸残 基，没有显著影响膜岛素与膜岛素受体的结合（Jens化angeandAageVolund,Adv. DrugDeliv.Rev. ,35 (2-3) :307-335 (1999)；PeterKurtzhalsetal. ,Diabet es,49化）：999-1005(2000))。
[0006] 因此，本发明人已研究开发一种用非肤基聚合物和免疫球蛋白恒定区修饰膜岛素 0链的C-端区域处的氨基酸残基的方法，并且他们发现，该方法用于制备比通过修饰膜岛 素其它位点如N-端而制备的缀合物具有更高的对膜岛素受体的结合亲和力的缀合物，从 而完成本发明。 【
【发明内容】
】
[0007]【技术问题】
[0008] 本发明的目的是提供膜岛素缀合物及其制备方法，所述膜岛素缀合物通过非肤基 聚合物将免疫球蛋白Fc区与膜岛素0链（除其N-端外）的氨基酸残基位点-选择性地 (site-selectively)连接而制备。
[0009]【技术方案】
[0010] 在实现上述目的方面中，本发明提供膜岛素缀合物，其特征在于膜岛素和免疫球 蛋白Fc区通过非肤基聚合物连接体彼此连接，所述非肤基聚合物连接体选自聚乙二醇、聚 丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙締基醇、多糖、葡聚糖、聚乙締基 乙酸、可生物降解聚合物、脂质聚合物、几下质、透明质酸及其组合，并且非肤基聚合物的一 端与膜岛素P链（除其N-端外）的氨基酸残基连接，而其另一端与免疫球蛋白Fc区连接。
[0011] 优选地，非肤基聚合物可W与膜岛素0链的位置20至29处的氨基酸残基中的任 一个连接。
[0012] 更优选地，非肤基聚合物可W与膜岛素0链的位置25至29处的氨基酸残基中的 任一个连接。
[0013] 更加优选地，非肤基聚合物可W与膜岛素0链的位置29处的赖氨酸残基连接。
[0014] 优选地，与非肤基聚合物连接的膜岛素0链的氨基酸残基可具有胺基或琉基。
[0015] 优选地，膜岛素可W是天然膜岛素或其变体、膜岛素衍生物、膜岛素激动剂、或其 片段，所述变体通过对天然膜岛素的一些氨基酸置换、添加、缺失和修饰中的任一种方法或 通过其组合而制备。
[0016] 优选地，非肤基聚合物的两端可W分别与免疫球蛋白Fc区和膜岛素0链的氨基 酸残基的侧链的胺基或琉基连接。
[0017] 优选地，氨基酸可W是天然存在的或非天然存在的氨基酸。
[0018] 优选地，免疫球蛋白Fc区可W是非糖基化的。
[0019] 优选地，免疫球蛋白Fc区由选自CHUC肥、C册和CH4结构域的一至四个结构域构 成。
[0020] 优选地，免疫球蛋白Fc区可W进一步包括较链区。
[0021]优选地，免疫球蛋白Fc区可W是源自于IgG、IgA、I曲、I姐或IgM的Fc区。
[0022] 优选地，免疫球蛋白Fc区的每个结构域可W是不同来源的结构域的杂合体，所述 不同来源源自于选自IgG、IgA、I曲、I姐和IgM的免疫球蛋白
[0023] 优选地，免疫球蛋白Fc区可W是由单链免疫球蛋白构成的二聚体或多聚体，所述 单链免疫球蛋白由相同来源的结构域构成。
[0024] 优选地，免疫球蛋白Fc区可W是IgG4Fc区。
[00巧]优选地，免疫球蛋白Fc区可W是人非糖基化IgG4Fc区。
[00%] 优选地，非肤基聚合物可W与膜岛素0链的氨基酸残基的侧链的胺基或琉基结 合，W形成肤、硫代半缩醒、亚胺或硫代二氧化咯烷基键。
[0027] 优选地，非肤基聚合物的两端均可W独立地具有反应性基团，所述反应性基团选 自醒基、丙醒基、下醒基、马来酷亚胺基和班巧酷亚胺衍生物。
[0028] 优选地，班巧酷亚胺衍生物可W是班巧酷亚胺基簇甲基、班巧酷亚胺基戊酸醋、班 巧酷亚胺基甲基下酸醋、班巧酷亚胺基甲基丙酸醋、班巧酷亚胺基下酸醋、班巧酷亚胺基丙 酸醋、N-径基班巧酷亚胺或班巧酷亚胺基碳酸醋。
[0029] 优选地，非肤基聚合物的两端可W分别具有下醒反应性基团或班巧酷亚胺基戊酸 醋反应性基团。
[0030] 在另一方面中，本发明提供具有改善的体内持续时间和稳定性的长效膜岛素制 剂，其包括膜岛素缀合物。 阳〇3U 优选地，该制剂可用于治疗糖尿病。
[0032] 在又一个方面中，本发明提供膜岛素缀合物的制备方法，其包括W下步骤：（1)将 非肤基聚合物与膜岛素P链（除其N-端外）的氨基酸残基共价连接；从（1)的反应混合物 中分离非肤基聚合物与膜岛素P链（除其N-端外）的氨基酸残基共价连接的膜岛素络合 物（complex);和（3)将免疫球蛋白Fc区与所分离的络合物的非肤基聚合物的另一端共价 连接，从而生成免疫球蛋白Fc区和膜岛素与非肤基聚合物的每一端连接的膜岛素缀合物。
[0033] 优选地，非肤基聚合物可W与膜岛素0链的氨基酸残基的侧链的胺基或琉基结 合，W形成肤、硫代半缩醒、亚胺或硫代二氧化咯烷基键。
[0034] 优选地，非肤基聚合物的两端均可W独立地具有醒衍生物、马来酷亚胺衍生物或 班巧酷亚胺衍生物作为反应性基团。
[0035] 优选地，非肤基聚合物的两端可W分别与膜岛素0链（除其N-端外）和免疫球 蛋白Fc区的氨基酸残基的胺基或琉基连接。
[0036] 优选地，非肤基聚合物的两端均可W独立地具有醒衍生物或班巧酷亚胺衍生物作 为反应性基团。
[0037] 优选地，步骤（1)可W在抑9. 0 + 2的碱性环境下进行。
[0038] 优选地，步骤（1)中的膜岛素和非肤基聚合物的摩尔比为1:1. 5至1:10。
[0039] 优选地，步骤（3)中的膜岛素络合物和免疫球蛋白Fc区的摩尔比为1:1至1:10。 W40]【有利效果】
[0041] 本发明的膜岛素缀合物显示出对膜岛素受体显著增加的结合亲和力，并因此极大 地改善了膜岛素的体内活性，从而用于开发具有高效率的长效膜岛素制剂。 【【附图说明】】
[0042] 图IA至IB显示了使用Source 15S柱纯化的单聚乙二醇化膜岛素的概况和 SDS-PACiE凝胶相片；
[0043] 图2至3显示