围。此外，本发明的与生理活性多肤连接的非肤基聚合物可 W是一种聚合物或不同类型聚合物的组合。
[0071] 本发明中使用的非肤基聚合物具有能够与免疫球蛋白Fc区和蛋白质药物结合的 反应性基团。
[0072]优选地，非肤基聚合物可W与膜岛素0链的氨基酸残基的侧链的胺基或琉基结 合，W形成肤、硫代半缩醒、亚胺或硫代二氧化咯烷基键。
[0073]在非肤基聚合物两端处的反应性基团的非限制性例子可W包括醒基，如丙醒基或 下醒基、马来酷亚胺基和班巧酷亚胺衍生物。班巧酷亚胺衍生物可W是班巧酷亚胺基簇甲 基、班巧酷亚胺基戊酸醋、班巧酷亚胺基甲基下酸醋、班巧酷亚胺基甲基丙酸醋、班巧酷亚 胺基下酸醋、班巧酷亚胺基丙酸醋、N-径基班巧酷亚胺或班巧酷亚胺基碳酸醋，但不限于 此。可W无限制地使用选择性地能够与免疫球蛋白Fc区和膜岛素0链的氨基酸残基的胺 基或琉基一起形成共价键的任何反应性基团。
[0074]在非肤基聚合物两端处的反应性基团可W彼此相同或不同。例如，非肤聚合物可W在一端具有班巧酷亚胺基团，而在另一端具有醒基，如丙醒基或下醒基。当在其两端具有 反应性径基的聚乙二醇用作非肤基聚合物时，径基可W通过已知的化学反应活化成各种反 应性基团，或可W使用具有商业上可获得的经修饰的反应性基团的聚乙二醇，从而制备本 发明的蛋白缀合物。
[0075]优选地，非肤基聚合物可W分别在两端具有下醒基和班巧酷亚胺基戊酸醋反应性 基团。
[0076] 如本文所使用的，"免疫球蛋白Fc区"指的是运样的蛋白质：其包含免疫球蛋白的 重链恒定区2 (C肥）和重链恒定区3 (C册），而不含免疫球蛋白的重链和轻链的可变区、重链 恒定区I(CHl)和轻链恒定区I(CLl)。它还可W包含重链恒定区处的较链区。此外，本发明 的免疫球蛋白Fc区可W含有包含除免疫球蛋白的重链和轻链的可变区之外的重链恒定区 1 (CHl)和/或轻链恒定区1 (CLl)的Fc区的部分或全部，只要它具有与天然形式基本相似 或比其更好的效果。此外，它可W是在C肥和/或C册的氨基酸序列的相对长的部分中具 有缺失的区域。目P，本发明的免疫球蛋白Fc区可W包含DCHl结构域、C肥结构域、C册结 构域和CH4结构域，2)CHl结构域和C肥结构域，3)CHl结构域和C册结构域，4)C肥结构域 和CH3结构域，5) -个或多个结构域和免疫球蛋白较链区（或部分较链区）的组合，W及 6)重链恒定区和轻链恒定区的每个结构域的二聚体。
[0077]免疫球蛋白Fc区用作药物载体是安全的，因为它是体内代谢的生物可降解多肤。 此外，与整个免疫球蛋白分子相比，免疫球蛋白Fc区具有相对低的分子量，因此，在缀合物 的制备、纯化和收率方面是有利的。免疫球蛋白Fc区不包含Fab片段（其由于根据抗体亚 类的不同氨基酸序列而是高度不同质的），因此，可W预期免疫球蛋白Fc区可W极大地增 加物质的同质性并且在血液中为低抗原性。
[0078]免疫球蛋白Fc区可W是源自于人或包括牛、羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠的 其它动物，并且优选人。此外，免疫球蛋白Fc区可W是源自IgG、IgA、I曲、I姐和IgM的Fc 区或通过其组合或其杂合体制成的Fc区。优选地，其源自IgG或IgM(它们是人血液中最 丰富的蛋白质之一），并且最优选源自已知提升蛋白质配体结合的半衰期的IgG。
[0079] 同时，本文所使用的"组合"意思是编码相同来源的单链免疫球蛋白Fe区的多肤 与不同来源的单链多肤连接而形成二聚体或多聚体。目P，二聚体或多聚体可W由选自W下 的两种或多种片段形成JgGFe片段、IgAFe片段、IgMFe片段、I曲Fe片段和I姐Fe片 段。
[0080] 如本文所使用的杂合体"意思是编码两种或多种不同来源的免疫球蛋白Fe区的 序列存在于单链免疫球蛋白Fe区中。在本发明中，多种类型的杂合体是可能的。目P，由选 自IgGFc、IgMFc、IgAFc、I姐Fe和I曲Fe的CHUC肥、C册和CH4中的一至四个结构域 构成的结构域杂合体是可能的，并且可W包含较链区。
[0081] 另一方面，IgG分为IgGUIgG2、IgG3和IgG4亚类，并且本发明包括其组合和杂 合体。优选的是IgG2和IgG4亚类，最优选的是IgG4的Fe区，其很少具有效应子作用，如 CDC(补体依赖性细胞毒性）。
[0082]目P，作为本发明的药物载体，最优选的免疫球蛋白Fe区是源自人IgG4的非糖基化 Fe区。人源性Fe区比非人源性Fe区更优选，非人源性Fe区可W在人体内用作抗原并且引 起不期望的免疫反应，如产生抗抗原的新抗体。
[0083] 同时，免疫球蛋白Fe区可W是具有天然糖链、与天然形式相比糖链增加或与天然 形式相比糖链减少的形式，或者可W是去糖基化形式。免疫球蛋白Fe糖链的增加、减少或 去除可W通过本领域中常用的法实现，如化学法、酶促法和利用微生物的基因工程法。此 处，从Fe区去除糖链导致与补体（Clq)的结合亲和力明显降低和抗体依赖性细胞介导的细 胞毒性或补体依赖性细胞毒性降低或丧失，从而不会诱导不必要的体内免疫反应。在运方 面，去糖基化或非糖基化形式的免疫球蛋白Fe区作为药物载体可W更适合于本发明的目 的。
[0084] 如本文所使用的，"去糖基化"意思是从Fe区酶促地去除糖部分，而"无糖基化"意 思是由原核生物（优选大肠杆菌）W非糖基化形式产生Fe区。
[0085] 此外，本发明的免疫球蛋白Fe区包括其序列衍生物（突变体）W及天然氨基酸 序列。由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守或保守置换或其组合，氨基酸序列 衍生物具有与天然氨基酸序列不同的序列。例如，在IgGFe中，在214至238、297至299、 318至322或327至331位处的已知对于结合重要的氨基酸残基可W用作修饰的适合祀点。 此外，其它多种衍生物是可能的，包括具有缺失能够形成二硫键的区域、缺失天然Fe形式 的N-端处的数个氨基酸残基或向天然Fe形式的N-端添加甲硫氨酸残基的衍生物。此外， 为了去除效应子作用，缺失可发生于补体-结合位点，如Clq-结合位点和ADCC(抗体依赖 性细胞介导的细胞毒性）位点。制备运种免疫球蛋白化区的序列衍生物的技术公开在WO 97/34631 和WO96/32478 中。
[0086] 蛋白质和肤中一般不改变分子活性的氨基酸交换是本领域已知的化化ura地，R. LHill,TheProteins,AcademicPress,化WYork,1979)。最常发生的交换是Ala/Ser、 Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/ Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly，双向皆可。
[0087] 如需要，Fe区可W通过憐酸化、硫酸化、丙締酸醋化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙 酷化、酷胺化等进行修饰。
[0088] 上述Fe衍生物是具有与本发明的免疫球蛋白Fe区相同的生物活性或对热、抑等 具有改善的结构稳定性的衍生物。此外，运些免疫球蛋白恒定区可W得自从人和包括牛、 羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠的其它动物中分离的天然形式，或者可W是得自转化的 动物细胞或微生物的重组体或其衍生物。此处，它们可W通过从人或动物有机体分离整个 免疫球蛋白并用蛋白水解酶对它们进行处理而从天然免疫球蛋白获得。木瓜蛋白酶将天然 免疫球蛋白消化成F油区和Fe区，而胃蛋白酶处理导致产生pF'C和F(油)2。运些片段可 W进行尺寸排阻色谱W分离Fe或pF'C。
[0089] 优选地，人源性免疫球蛋白Fe区可W是获得自微生物的重组免疫球蛋白恒定区。
[0090] 在本发明中，免疫球蛋白Fe区和非肤基聚合物的结合是通过非肤基聚合物的不 与膜岛素结合的其它末端反应性基团和免疫球蛋白Fe区的氨基酸残基的胺基或琉基之间 的共价键而形成，如膜岛素P链和非肤基聚合物的结合那样。因此，非肤基聚合物与免疫 球蛋白Fe区的N-端或免疫球蛋白Fe区内的赖氨酸残基的胺基或半脫氨酸残基的琉基结 合。就运一点而言，对与非肤基聚合物结合的免疫球蛋白Fe区上的氨基酸残基的位置没有 限制。
[0091] 在又一个方面中，本发明提供具有改善的体内活性的长效膜岛素