专利名称：一种基于位点特异性重组的克隆方法
技术领域：
本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种基于ΦΒΤ1整合酶及其 突变识别位点的重组克隆方法。
背景技术：
借助DNA重组技术，人们可以将不同来源的基因片段随意拼接，以此获得特定的 基因产物或者改变生物个体的性状。传统重组技术的建立得益于限制性内切酶和DNA连接 酶的发现并广泛应用，迄今为止，这一经典方法仍旧在常规的分子克隆操作中普遍使用。但 是随着基因及其功能研究的进一步深入，适用于组学的高通量快速克隆的需求日益迫切。 很显然，目前繁琐的酶切连接克隆方法不仅操作繁琐，大量试剂成本也随之增加，同时合适 酶切位点的选择也成为大片段操作和大规模基因克隆无法回避的问题。为克服传统克隆方法的缺陷，基于同源重组和位点特异性重组的克隆方法也先后 被开发出来并被研究者使用。同源重组克隆的原理，是重组酶能够识别并催化同源序列间 的链交换，达到重组的目的。将这一原理应用到体外，使用纯化的重组酶，在优化的反应条 件下，实验载体与目的基因的重组。重组完成之后，不会在载体上留下任何不必要的序列， 但是一方面，同源重组有可能产生非预期的链交换，专一性有待进一步研究；另一方面，同 源重组的效率一般比较低。位点特异性重组广泛发生在噬菌体整合到宿主染色体上的过程中。噬菌体编码一 种位点特异性重组酶，能特异性的识别自身的attP位点和宿主染色体attB位点，并介导 两位点的切割和链交换，将噬菌体基因组整合进宿主染色体。对位点特异性重组酶的体外 研究发现，该类酶催化的重组反应不仅专一性高，而且快速高效。很快，研究较早且机理清 楚的λ整合系统被应用到体外的重组克隆中，率先突破了传统克隆的缺点。随着研究的深 入，发现丝氨酸酶类(Φ031 integrase，ΦBTl integrase)的重组效率远高于酪氨酸类重 组酶(λ integrase)。那么，基于丝氨酸重组酶的克隆系统可能成为一种更加高效的替代目 前已有重组克隆系统的新方法。
发明内容
本发明的目的是要克服酪氨酸重组酶的克隆系统需要多种酶共同作用，且效率相 对较低的缺点，提供一种基于位点特异性重组的克隆方法。本发明提供的基于位点特异性重组的克隆方法是一种基于丝氨酸重组酶 ΦBTlintegrase的高效克隆方法。本发明提供一对突变的整合酶识别序列，其被识别与切 割的效率同野生型相当。在此基础上构建含有野生型和突变识别位点的用于位点特异性重 组克隆的载体PDZM102，并提供目的基因克隆时引物序列的设计方法。本发明提供的克隆方法高效快速，特异性高，只需要在PCR扩增引物序列5’端加 上整合酶识别位点，即可摆脱繁琐的酶切连接实现目的基因的快速克隆。本发明提出的上述方法具体如下
1、φ BTl整合酶识别序列的突变及重组效率确定设计含有整合酶识别序列突变的引物primer 1 (SEQ No. 1)和primer 3 (SEQ No. 3)，并设计相对应的反义引物primer 2 (SEQ No. 2)和primer 4 (SEQ No. 4)。用质粒 PRT802为模板，以primer 1和primer 2PCR扩增出含有突变的attP:片段；用质粒pZL5812 为模板，以primer 3和primer 4PCR扩增出含有突变的^it tB1片段。将突变序列^ittP1与 BttB1在整合酶的作用下反应，野生型序列attP和attB反应作为对照。反应后光密度扫描 测定反应效率，结果显示突变型和野生型底物反应效率相当。将突变序列与野生型序列交 叉反应，即atth与attB反应，attP与^ittB1反应，发现交叉反应不能发生。因此突变型位 点和野生型位点可以组合应用到统一体系中，实现单因子(只需要ΦΒΤ1 integrase)介导 下到快速高效克隆。2、构建含有ΦΒΤ1整合酶识别位点(野生型和突变位点)的克隆载体PDZM102用pUC119为模板，以引物5 (SEQ No. 5)和引物6 (SEQ No. 6)扩增一端含有突变 型BttP1的IacZ α (SEQ No. 7)片段。引物两端分别设计有NheI和EcoRV的限制性内切酶 识别位点，以该两种酶酶切PCR产物制得插入片段；同时以该两种酶酶切质粒PRT802，制得 线性质粒骨架。将线性质粒骨架和IacZ α片段以Τ4连接酶连接后转化大肠杆菌，挑取阳 性转化子并提取质粒DNA，即为pDZM102 (SEQ No. 8)。并设计用于测序的通用引物ZLF(SEQ No. 9)，ZLR (SEQ No. 10)。质粒pDZM102的相应元件，包括质粒复制起始位点、抗药性基因、接合转移起始位 点、蓝白斑筛选相关基因以及位点特异性重组识别位点attP和attPp3、将目的基因定向克隆入载体pDZM102为获得较高的重组克隆阳性率，可先将pDZM102以限制性核酸内切酶HindIII或 BamHI线性化后再继续下步操作。以将氨苄青霉素抗性基因(bla)克隆到pDZM102为例用 PUC119 为模板，以引物 primer 9 (SEQ No. 11)和 primer 10 (SEQ No. 12) PCR 扩增含有 bla 基因的DNA片段(SEQ No. 13)，引物上分别设计有野生型attB和突变型^ittB1序列，因此该 PCR产物可直接与pDZM102在整合酶的作用下发生重组。将重组产物转化大肠杆菌，阳性率 不低于95%。本发明涉及质粒DNA pRT802[l]和pZL5812[2]相关信息见对应参考文献；质粒 PUC119购于宝生物工程有限公司；载体pDZM102为本专利设计中构建。
图1 重组克隆载体pDZM102的结构图。其中
图3 体外重组反应示意图。
具体实施例方式1、φ BTl整合酶识别序列的突变及重组效率确定(1)制备含有突变型位点的片段PCR扩增反应体系为(以primer 1和 primer 2 扩增 BttP1 片段，以 primer 3 和 primer 4 扩增 BttB1 片段)，10XTaq DNA Polymerase buffer 5 μ 1, IOmM each dNTP 1 μ 1, DNA If 板、弓 | 物禾口 Taq DNA Polymerase分别0. 5μ 1，以ddH20补充总体积至50 μ 1 ；PCR条件为，95 °C预变性5min， 95°C 30sec/60°C 30sec/72°C Imin 循环 30 次，72°C保温 IOmin ；PCR 产物经 0. 7% 的琼脂糖 凝胶电泳后以GeneRay公司GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收，先将切下的凝 胶块以三倍体积的Binding Solution混合，加热溶解后转移到离心柱中以3000rpm离心 30sec，以 500μ1 Wash Solution 洗涤两次，加入 50 μ 1 ddH20 洗脱收集。(2)体外重组反应加入两种底物(分别为attPjnattB^attP和attB)到小离心 管中，尽量保持两种底物的摩尔比为1 1，加入1口1 Recombination Buffer、0. 5 μ 1 Φ BTl integrase，以ddH20补充总体积至10 μ 1 ；30°C温育0. 5_2hrs，75°C高温灭活IOmin后琼脂 糖凝胶电泳分析。(3)重组效率与交叉反应的确定体外重组反应经琼脂糖凝胶电泳后进行光密度 扫描分析，三次结果证实突变型位点和野生型位点反应效率无显著差别；分别以attPi和 attB, attP和BttB1为底物进行交叉反应实验，体外重组反应体系如上述，产物经琼脂糖凝 胶电泳后进行光密度扫描分析，未见交叉反应发生。2、构建含有Φ BTl整合酶识别位点(野生型和突变位点)的克隆载体PDZM102(1)引物的设计与IacZa片段的获取先以酶切连接的方法将带有^ittP1的IacZa基因插入到载体上去，质粒pRT802本身带有attP位点，因此只需要在另外一端加上 突变序列BttP1即可。引物primer 5的5，端带有NheI识别位点，引物primer 6的5，端 带有突变序列attPi和EcoRV识别位点。PCR反应(体系如上述)之后以该两种限制性内 切酶酶切(体系适量 PCR 产物，NEB "IOXbuffer 2” 5 μ 1，IOXBSA 5 μ 1，NheI 与 EcoRV 各1 μ 1，以ddH20补充总体积至50 μ 1)，酶切后琼脂糖凝胶电泳，以GenClean琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒纯化回收(如上述)。(2)线性质粒骨架的制备以NheI和EcoRV酶切质粒pRT802 (体系入上述)获取 质粒骨架，以GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收(如上述)。(3)连接与转化将制备好的质粒骨架与含有attPi WlacZ α以Τ4连接酶连 接(体系为质粒骨架 1·5μ1，PCR 片段 7μ1，IOXligation buffer 1μ 1, T41igase 0. 5 μ 1)；连接过夜后将连接产物以CaCl2法转化DH5 α，抗性为卡那霉素，并在培养基中加 入IPTG和X_gal，37°C过夜培养。(4)质粒提取与验证挑取蓝色菌落培养，以分子克隆实验指南所述碱法提 取质粒DNA，限制性内切酶KpnI酶切(体系如上述)验证，筛选得到阳性克隆即为 PDZM102(SEQNo. 8)。3、将目的基因定向克隆入载体pDZM102(1)引物的设计与含有目的基因片段的获取重组克隆载体PDZM102已经含有 attP和EittP1序列，那么只需要在PCR扩增时于目的基因两侧加上attB和EittB1序列即可 实现重组克隆。在引物primer 9的5’端引入野生型的attB序列(SEQ No. 11，框内部分)， 引物primerlO的5’端引入野生型的attBi序列(SEQ No. 12，框内部分)。用pUC119为模 板，以该两引物PCR扩增目的DNA片段(以bla基因为例)，产物电泳后以GenClean琼脂糖 凝胶DNA回收试剂盒纯化回收(如上述)。(2)体外重组反应加入目的DNA片段和pDZM102到小离心管中(体系如上述)进 行重组反应，温育时间为0.5-2小时。为保证较高的重组效率，目的DNA片段的摩尔数为载 体摩尔数三到十倍为宜；为保证较高的阳性克隆率，可事先将PDZM102以限制性核酸内切 酶HindIII或BamHI (均为单一切点)线性化后再继续下步操作。(3)重组阳性克隆的筛选和鉴定重组产物转化DH5 α，抗性为卡那霉素，并在培 养基中加入IPTG和X-gal，37°C过夜培养。白色菌落即为阳性克隆，线性化的载体将获得极 高的阳性率，不低于95%。还可以常规方法，提取质粒酶切进一步验证阳性克隆的正确性； 也可以所设计的通用引物测序验证。参考文献1. Gregory, Μ. Α. , Till, R. and Smith, Μ. C. Μ. (2003) Integration site for Streptomycesphage Φ BTl and development of site-specific integrating vectors. J Bacteriol. ，185，5320-5323.2. Zhang, L. ， Ou, X. J. ， Zhao, G. P. and Ding, X. M. (2008)Highly efficient in vitrosite-specific recombination system based on Streptomyces phage Φ BTl integrase. J Bacteriol. ,190,6392-6397.
权利要求
一对突变的φBT1整合酶识别的重组位点序列，其特征在于为attP1和attB1位点，其序列分别为SEQ No.1和SEQ No.3所示。
2.一种基于如权利要求1所述位点进行相应底物对重组及交叉反应效率测定的方法， 其特征在于将PCR片段的体外重组和光密度扫描相结合。
3.—个重组克隆质粒，其特征在于由基于权利要求1所述的突变整合位点序列所构 建，序列如SEQ No. 8所示，记为pDZM102。
4.如权利要求3所述重组克隆质粒的相应元件，其特征在于包括质粒复制起始位点、 抗药性基因、接合转移起始位点、蓝白斑筛选相关基因以及位点特异性重组识别位点attP 禾口 BttP1。
5.如权利要求3所述重组克隆质粒的构建方法，其特征在于具体步骤如下用pUC119为模板，以引物5和引物6扩增一端含有突变型attPi的IacZ α片段；引物 两端分别设计有NheI和EcoRV的限制性内切酶识别位点，以该两种酶酶切PCR产物制得插 入片段；同时以该两种酶酶切质粒PRT802，制得线性质粒骨架；将线性质粒骨架和IacZa 片段以Τ4连接酶连接后转化大肠杆菌，挑取阳性转化子并提取质粒DNA，即为pDZM102 ；其 中引物5序列为SEQ No. 5，引物6序列为SEQ No. 6，IacZ α序列为SEQNo. 7。
6.一种将目的基因通过重组定向克隆入如权利要求3所述pDZM102的方法，其特征在 于具体步骤如下先将pDZM102以限制性核酸内切酶HindIII或BamHI线性化后再继续下步操作；将所 获得的目的基因与PDZM102在整合酶的作用下发生重组；将重组产物转化大肠杆菌，使用 蓝白筛选，阳性率不低于95%。
全文摘要
本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体为一种基于位点特异性重组的克隆方法。本发明基于丝氨酸重组酶φBT1 integrase的体外应用。本发明提供一对突变的整合酶识别序列，其被识别与切割的效率同野生型相当。在此基础上构建含有野生型和突变识别位点的用于位点特异性重组克隆的载体pDZM102，并提供目的基因克隆时引物序列的设计方法。本发明提供的克隆方法高效快速，特异性高，只需要在PCR扩增引物序列5’端加上整合酶识别位点，即可摆脱繁琐的酶切连接实现目的基因的快速克隆。
文档编号C12N15/09GK101921747SQ201010197950
公开日2010年12月22日 申请日期2010年6月10日 优先权日2010年6月10日
发明者丁晓明, 张霖, 赵国屏 申请人:复旦大学