一种荧光检测银离子含量的方法
【专利摘要】本发明一种荧光检测银离子含量的方法，公开了一种检测银离子浓度的方法。利用银离子调控可形成i-motif结构的特性以及菁染料聚集体识别i-motif结构的特性，将待测液体样品加入到能形成i-motif结构的DNA分子与菁染料混合溶液中，通过测定波长在530-700nm处荧光强度值，即可在银离子浓度标准曲线上找到其对应的银离子浓度值。该方法特异性高，选择性好，试剂成分简单，反应过程简单，可有效减少操作产生的误差，测试精确度高。该方法在普通荧光光谱仪便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，检测成本低廉，便于行业内推广应用。
【专利说明】一种荧光检测银离子含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析检测领域，尤其涉及一种荧光检测银离子含量的方法。
【背景技术】
[0002] 银作为一种天然的消毒灭菌剂，在医药领域和人们的日常生活中具有广泛的应 用。然而，现在的研究表明，银离子能够在人体的皮肤、眼睛、粘膜等处聚集，对人体健康产 生危害。它还能够与体内的巯基酶相结合，使其失去活性，同时，银还可以与胺、咪唑、羧酸 等多种生理代谢产物相互作用而导致各种疾病。近年来，随着纳米银粒子的大量应用，使银 以各种形式进入环境中，对自然界的生物环境造成了一定的破坏。因此，发展快速、高效的 银离子检测方法对人类健康、环境和医药科学都具有重要的意义。
[0003] 目前，定量检测微量银离子的方法主要有分光光度法、电化学分析法、原子吸收分 光光度法、发射光谱法等，但这些方法在实际应用中都存在一定的缺点。如目前应用最广泛 的双硫腙分光光度法，双硫腙的不稳定性会对检测结果产生一定的影响，而且还容易受各 种金属离子的干扰。电化学分析法则需要冗长、复杂的样品处理过程。原子吸收光谱法为 了提高灵敏度需要对银离子进行预富集处理，耗时长。因此，建立简便快速、灵敏、特效以及 应用广泛的银离子检测方法，已成为目前研究分析检测的重点之一。
[0004] 近几年来，荧光光谱分析法由于操作简单、灵敏度高等特点，被广泛的应用于检测 各种离子，如Zn 2+、Ca2+、Cu2+等，然而由于银离子的荧光猝灭作用，导致利用荧光探针来检测 银离子的方法比较少。目前的荧光检测方法大多都是针对特定的样品，缺乏普遍性，且灵 敏度低。因此，利用荧光检测银离子浓度的方法还需要进一步的研究。
【发明内容】
[0005] 本发明针对目前利用荧光检测银离子方法存在的不足，提供了一种利用菁染料与 i-motif结构作用体系的荧光检测银离子含量的新方法。
[0006] 本发明提供的方法是利用银离子可调控形成i-motif结构的特性以及菁染料聚 集体识别i-motif结构的特性，通过测定波长在530?700nm处突光强度值，即可对银离子 浓度进行检测，包括如下步骤：
[0007] (1)标准曲线的制备
[0008] a、用pH值为7. 0-10. 0的缓冲溶液（优选pH值为7. 4的缓冲溶液）配制一系列 含不同银离子浓度的标准溶液样本，其中，每个所述标准溶液样本中均含有相同浓度的能 够形成i-motif结构的DNA分子以及相同浓度的菁染料；
[0009] b、将所述标准溶液样本置于荧光光谱仪下，采用520nm的激发波长，检测标准溶 液样本在波长为530nm?700nm处的荧光强度值；
[0010] C、以各个所述标准溶液样本的银离子浓度作为横坐标，以测得的530nm?700nm 处的最强荧光强度值为纵坐标，绘制银离子浓度的标准曲线；
[0011] 或以各个所述标准溶液样本的银离子浓度作为纵坐标，以测得的530nm?700nm 处的最强荧光强度值为横坐标，绘制银离子浓度的标准曲线；
[0012] (2)测定待测样本中的银离子浓度
[0013] d、取适量的待测样本，并向其中加入步骤a中所述的能够形成i-motif结构的DNA 分子、所述菁染料以及pH值为7. 0-10. 0的缓冲溶液，得到测试溶液，其中，所述测试溶液中 所含的能够形成i-motif结构的DNA分子的浓度、菁染料的浓度与步骤a中所述标准溶液 样本相同；
[0014] e、将所述测试溶液置于荧光光谱仪下，采用520nm的激发波长，检测测试溶液在 波长为530nm?700nm处的荧光强度值；
[0015] f、根据步骤c所述银离子浓度的标准曲线，得到测试溶液在波长为530nm?700nm 处的最大荧光强度值对应的银离子浓度值，然后通过待测样本被稀释的倍数计算出待测样 本中银离子的浓度。
[0016] 上述方法，步骤a和d中所述pH值为7. 0-10. 0的缓冲溶液选自下述任意一种：磷 酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲溶液、磷酸钠-磷酸氢钠缓 冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、三乙醇胺缓冲溶液、咪唑-盐酸缓冲溶液、双甘氨肽缓 冲溶液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲溶液、磷酸钾-磷酸氢钾缓冲溶液、硼酸-硼砂缓冲 溶液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液、硼砂-氢氧化钠缓冲溶液和磷酸钠缓冲溶液；
[0017] 为了避免其他金属离子对银离子测定结果的干扰，所述pH值为7. 0-10. 0的缓冲 溶液中还可加入乙二胺四乙酸。
[0018] 将所述乙二胺四乙酸加入所述pH值为7.0-10.0的缓冲溶液中，使其终浓度为 1-lOmM.
[0019] 所述能够形成i-motif结构的DNA分子为分子序列中富含胞啼 啶（cytosine，C)的DNA分子，如可为购自上海生工生物技术有限公司的 CCAACCACACCAACCAAA、CCCTCCCTCGCGCCCGCCCGAAA、CCTTCCCCACCCTCCCCACCCTCCCCA、 CCACCACCACCACAACCACCACCACCAAA等DNA分子，但可形成i-motif结构的DNA序列范围不 受这些列举所限制。
[0020] 所述标准溶液样本中所述能够形成i-motif结构的DNA分子与所述菁染料的摩尔 浓度比为0. 1?1. 0。
[0021] 所述标准溶液样本中，所述能够形成i-motif结构的DNA分子的摩尔浓度为3? 30 μ mol/L，优选为3?20 μ mol/L，最优选为3?10 μ mol/L ;所述标准溶液样本中菁染料 的摩尔浓度为3?20 μ mol/L，优选为5?16 μ mol/L。
[0022] 所述标准溶液样本中的菁染料以溶液的形式加入，所述溶液的溶剂为脂肪醇，如 甲醇、乙醇等。
[0023] 所述标准溶液样本中的银离子由可溶性银盐提供，所述可溶性银盐具体可为硝酸 银、醋酸银、氟化银和高氯酸银等；所述标准溶液样本中银离子的摩尔浓度为〇?200mmol/ L，优选为0?100mmol/L，更进一步优选为0?10mmol/L，最优选为0?lmmol/L或0? 12umol/L〇
[0024] 上述方法，步骤d中所述pH值为7. 0-10. 0的缓冲溶液同步骤a。
[0025] 上述检测方法中，所述菁染料为式I所示的化合物，
[0026]
【权利要求】
1. 一种检测液体样品中银离子含量的方法，所述方法包括如下步骤： (1) 标准曲线的制备 a、 用pH值为7. 0-10. 0的缓冲溶液配制一系列含不同银离子浓度的标准溶液样本，其 中，每个所述标准溶液样本中均含有相同浓度的能够形成i-motif结构的DNA分子以及相 同浓度的菁染料； b、 将所述标准溶液样本置于荧光光谱仪下，采用520nm的激发波长，检测标准溶液样 本在波长为530nm?700nm处的荧光强度值； c、 以各个所述标准溶液样本的银离子浓度作为横坐标，以测得的530nm?700nm处的 最强荧光强度值为纵坐标，绘制银离子浓度的标准曲线； 或以各个所述标准溶液样本的银离子浓度作为纵坐标，以测得的530nm?700nm处的 最强荧光强度值为横坐标，绘制银离子浓度的标准曲线； (2) 测定待测样本中的银离子浓度 d、 取适量的待测样本，并向其中加入步骤a中所述的能够形成i-motif结构的DNA分 子、所述菁染料以及pH值为7. 0-10. 0的缓冲溶液，得到测试溶液，其中，所述测试溶液中所 含的能够形成i-motif结构的DNA分子的浓度、菁染料的浓度与步骤a中所述标准溶液样 本相同； e、 将所述测试溶液置于荧光光谱仪下，采用520nm的激发波长，检测测试溶液在波长 为530nm?700nm处的荧光强度值； f、 根据步骤c所述银离子浓度的标准曲线，得到测试溶液在波长为530nm?700nm处 的最大荧光强度值对应的银离子浓度值，然后通过待测样本被稀释的倍数计算出待测样本 中银离子的浓度。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a和步骤d中所述pH值为7. 0-10. 0 的缓冲溶液均选自下述任意一种：磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液、磷酸二氢钾-磷酸 氢二钾缓冲溶液、磷酸钠-磷酸氢钠缓冲溶液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液、三乙醇胺缓冲 溶液、咪唑-盐酸缓冲溶液、双甘氨肽缓冲溶液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲溶液、磷酸 钾-磷酸氢钾缓冲溶液、硼酸-硼砂缓冲溶液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液、硼砂-氢氧化 钠缓冲溶液和磷酸钠缓冲溶液。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述pH值为7. 0-10. 0的缓冲溶液 中还加入乙二胺四乙酸； 将所述乙二胺四乙酸加入所述pH值为7. 0-10. 0的缓冲溶液中，使其终浓度为1-10禮。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：步骤a中所述能够形成 i-motif结构的DNA分子为分子序列中富含胞嘧啶的DNA分子。
5. 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：步骤a所述标准溶液样本中， 所述能够形成i-motif结构的DNA分子与所述菁染料的摩尔比为0. 1?1. 0。
6. 根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于：步骤a所述标准溶液样本中， 所述能够形成iiotif结构的DNA分子的摩尔浓度为3?30 μ mol/L，优选为3?20 μ mol/ L，最优选为3?10 μ mol/L ; 所述标准溶液样本中的菁染料以溶液的形式加入，所述溶液的溶剂为脂肪醇； 所述标准溶液样本中菁染料的摩尔浓度为3?20 μ mol/L，优选为5?16 μ mol/L。
7. 根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：步骤a所述标准溶液样本中 的银离子由可溶性银盐提供； 所述标准溶液样本中银离子的摩尔浓度为〇?200mmol/L，优选为0?100mm〇l/L，更 进一步优选为0?10mmol/L，最优选为0?lmmol/L或0?12umol/L。
8. 根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于： 所述菁染料为式T所示的化合物：
所述式I中，&选自氢、Q?C6的烷基、苯基或Q?C6的烷基取代的苯基； R2、R3、R4和R5分别选自Η或Q?C 6的烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起 形成5元?7元的环结构，或者R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成5元?7元的环结 构；所述5元?7元环结构为含有或不含有N或S原子的饱和或不饱和环结构； R6和R7分别选自Q?C6烷基或者磺酸基取代的烷基； 所述式I中，&和X2分别选自碳、氧、硫、硒和碲中任意一种； 所述式I中，Y为反离子或不存在，根据R6和R7所带电荷的不同而不同，若Re和R7为 烷基，则Y为卤素阴离子；若R6和R7只有一个带有磺酸根，则Y不存在；若R6和R 7均带有 磺酸根，则Y为三乙胺阳离子。
9. 根据权利要求1-8中任一项所述的方法在检测液体样品中银离子浓度方面的应用。
【文档编号】G01N21/64GK104111244SQ201410354030
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2014年7月23日
【发明者】唐亚林, 史运华, 孙红霞, 杨千帆 申请人:中国科学院化学研究所