用于生成重组克隆细胞系的方法和用于该方法的新试剂的制作方法

专利名称：用于生成重组克隆细胞系的方法和用于该方法的新试剂的制作方法
用于生成重组克隆细胞系的方法和用于该方法的新试剂本发明涉及生成重组克隆细胞系的方法以及用于该方法的新试剂。背景在研究细胞表面受体的药理学和信号传导特征中的主要要求是能够利用以具体 的表达水平表达特定转染的受体的重组细胞系。这些细胞系在筛选用于新治疗剂的化合物 库方面也具有极大的价值。传统上，克隆细胞系的生成涉及繁琐的过程(a)转染；(b)表达 特定受体的细胞的抗生素抗性选择以及最后(c)表达特定水平的细胞表面受体的细胞的 稀释克隆(即，从单个细胞)。这一过程最费力和耗时的方面是稀释克隆和鉴定表达特定水 平的受体的克隆。这总是需要将所有的克隆系扩增到有足够数目的细胞用于待进行的放射 配体结合的程度。这通常需要超过一百万个细胞。在含有绿色荧光蛋白(GFP)标签的表达重组形式的受体的细胞中，通过能够利用 荧光活化细胞分选术(FACS)来鉴定表达特定水平的受体蛋白的细胞而使后一步骤变得较
各易ο然而，这一方法的缺点在于GFP标签能够改变细胞表面受体的药理学特征。因此 需要能够在扩增细胞系前鉴定表达特定水平的受体蛋白的单个细胞、而不影响细胞表面受 体的药理学特征的方法。公开内容简述按照本发明，提供了从细胞群生成以具体表达水平表达靶细胞表面受体的重组克 隆细胞系的方法，所述细胞群包含用编码所述靶受体的cDNA序列的质粒转染且表达所述 靶细胞表面受体的细胞，该方法包括(c)用受体特异性荧光配体孵育细胞群(d)通过利用流式细胞术监测荧光配体的特异性结合，从步骤(C)选择表达靶细 胞表面受体的单个细胞。适宜地，步骤(C)提供了用结合靶细胞表面受体的受体特异性荧光配体对细胞群 进行荧光标记。优选地，在步骤(d)中选择的单个细胞适于克隆入克隆细胞系。优选地，该 方法包括e)将从步骤(d)中选择的单个细胞扩增为克隆细胞系。优选地，所述方法包括通过下述生成细胞群(a)用编码靶受体的cDNA序列和抗生素选择标志物的质粒转染细胞；以及(b)对表达该特定细胞表面受体的那些细胞进行抗生素抗性选择从而生成细胞群。因此适宜地，本发明包括用于生成以具体表达水平表达靶细胞表面受体的重组克 隆细胞系的方法，该方法包括(a)用编码靶受体的cDNA序列和抗生素选择标志物的质粒转染细胞；(b)对表达该特定细胞表面受体的那些细胞进行抗生素抗性选择从而生成细胞群(c)用受体特异性荧光配体孵育细胞群(d)通过利用流式细胞术监测荧光配体的特异性结合，从步骤(C)选择表达靶细 胞表面受体的单个细胞；以及
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(e)将选择的细胞扩增为克隆细胞系。优选地，流式细胞术包括使用荧光活化细胞分选仪(FACS )或荧光活化细胞分选 技术。在另一方面，本发明提供了通过本发明的方法获得的重组克隆细胞系在筛选用于 新治疗剂的化合物库或者在研究细胞表面受体的药理学和信号传导特征中的用途。优选 地，细胞系包含痕量的荧光配体。本文提及的痕量是指在将单个细胞克隆扩增为细胞系后 仍保留的任何残余量。痕量的荧光配体可以与细胞分离或可以仍结合于细胞。在另一方面，本发明提供了与方法一起使用的试剂盒，其包含一套说明书连同用 于该方法的一种或多种荧光配体。在另一方面，本发明提供了已知和新的荧光配体在该方法中的应用。在另一方面，本发明提供了通过本发明的方法鉴定的配体用于选自GPCRs、配体门 控离子通道和酪氨酸激酶受体的药物靶标的用途。在另一方面，本发明提供了新的荧光配体。在本发明中，我们已经使用长效荧光配体，其结合到细胞表面，诸如结合到GPCRs 以提供用于(FACS )分析和分选的可逆性荧光标签，这允许表达特定水平GPCR的细胞在单 细胞水平被鉴定和分离用于在细胞培养中的进一步扩增。随着时间的过去，荧光配体会从 细胞分离。而且，当选择的细胞被扩增为细胞集落时，大部分细胞不会被标记。因此产生的 克隆细胞系是野生型受体。例如，经由适当的间隔子与荧光团BODIPY 630/650相联的配体 提供了在细胞表面受体保留足够长时间以允许FACS 分选的分子。附图简述下文通过实施例，参照附图进一步描述了本发明的实施方案，附图中在

图1中是用于本发明的方法的本发明的新荧光配体。在图2中举例说明了用于制备本发明的新荧光配体的过程。图2c是适用于合成 Dl烷基、PEG或聚酰胺连接子化合物的总体示意图，其通过取代相关氨基酸(Boc-AA-OH)来 制备。在图3中，显示了在抗生素抗性选择前和FACS 分选前，N-{4-氮杂_3，7_ 二氧 代-7-[4-(8-甲氧基-3-甲基-2，3，4，5-四氢-1H-3-苯并氮杂卓基)苯基氨]庚 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢 ~5~ (噻吩-2-基)~4~ 硼(bora) -3a, 4a- 二 氮 杂-S-引达省(indacene)-3-基)乙烯基)配体(IOnM)结合到表达人多巴胺Dl-受体的 CHO “细胞系”的共聚焦显微图像。红色图像(浅灰)显示了结合荧光Dl-受体拮抗剂的细 胞，蓝色图像(深灰)显示了细胞核的Hoechst染色。显然，只有约20%的细胞表达人多巴 胺Dl受体。在图4中，显示了用荧光N-{4_氮杂-3，7_ 二氧代-7-[4_(8-甲氧基_3_甲基_2， 3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂卓-1-基)苯基氨]庚基} -6- {2-[4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二 氢-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a，4a-二氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨 基}己酰胺(显示为浅灰的红染色)标记的表达多巴胺Dl受体的CHO细胞的共聚焦显微 图像。用H0echst33342(显示为深灰的蓝染色)染色细胞核。显示了 FACS分选后表达中 等水平Dl-受体的细胞。发明详述
本文提及的流式细胞术是单个细胞的快速连续的分析，通常使用激光和荧光标 记。这能够用于鉴定具有特定荧光强度(在特定的荧光波长)的单个细胞，然后可以将这 些细胞分选为具有特定水平荧光强度的群或分选为多孔板中的单个细胞。本文提及的荧光 活化细胞分选仪(FACS )或荧光活化细胞分选技术是指基于每个细胞的具体光散射和荧 光特征能够每次一个细胞地将生物细胞的悬浮液分选到两个或多个容器的仪器或技术。本文提及的野生型细胞系是指属于天然存在类型的细胞系以及天然存在的或从 天然存在的细胞克隆的。本文提及的细胞培养是指用于促进细胞存活、生长和繁殖的合成培养。本文提及的荧光配体是指其药理学特性已知的配体，其与荧光部分相联但仍然保 持它的药理学特性，例如，对结合到细胞表面受体的结合亲和力和功能活性。本文提及的长 效配体是指保持结合充足时间以能够进行上文定义的鉴定和分选的配体。本文提及的可逆性荧光配体是指结合到细胞表面受体一段时间并最终与其分离 的配体。合适的结合是持续足以允许通过流式细胞术进行分选的一段时间。本文提及的具体或特定水平的表达是指具体的统一水平的表达。表达水平表示为 荧光亮度或荧光强度。在流式细胞术过程中，可以应用滤波器来区分分别显示低、中或高水 平强度的细胞。因为强度的绝对值依赖于每个单独的实例，在每一实例中基于相对尺度来 评估，因此不能获得强度的绝度值。因此，优选地，本发明的方法是鉴定表达受体蛋白的单 个细胞，所述受体蛋白的表达水平对应于低、中等或高荧光强度，即在最低20-40%内、更优 选地最低33%的强度，中等20-40%、更优选地33%的强度或者最高20_40%、更优选地最 高33%的强度。优选地，结合样品中所有单个细胞来确定强度。本发明能够利用不使细胞表面受体减活化的(可逆结合的)荧光配体，生成以具 体水平表达靶细胞表面受体的重组克隆细胞系。GFP标记是当受体表达时受体的永久性部 分。本发明的优势在于能够利用荧光配体表达和监测天然的或野生型的未修饰的受体。在 本发明的情形下，不管配体是否可逆性结合，即不管它是否从受体分离，扩增的细胞系与天 然的或野生型受体是相同的。在GFP标记的情形下，终产物是包含带GFP标签的受体的细 胞系。优选地，细胞表面受体选自G蛋白偶联受体(GPCRs)、配体门控离子通道和酪氨酸 激酶受体。G蛋白偶联受体是跨细胞膜7次的单链蛋白。N-末端在细胞外，且C末端位于受 体蛋白的胞质侧。这些受体主要通过与异三聚体的G蛋白的相互作用来介导它们的效应。优选地，GPCR选自腺苷受体、肾上腺素受体、毒蕈碱受体、组胺受体、阿片受 体、大麻类受体、趋化因子受体、α -肾上腺素受体、GABA受体、前列腺素类受体、5-ΗΤ(血清 素)受体、兴奋性氨基酸受体(例如，谷氨酸)、多巴胺受体、蛋白酶激活受体、神经激肽受 体、血管紧张素受体、催产素受体、白三烯受体、核苷受体(嘌呤和嘧啶)、钙敏感受体、促甲 状腺激素受体、神经降压素受体、加压素受体、嗅觉受体、核碱基受体(例如，腺苷)、溶血磷 脂酸受体、鞘脂受体、酪胺受体(痕量胺)、游离脂肪酸受体以及环腺苷受体等。最优选地， GPCR选自大麻类、代谢型谷氨酸、多巴胺和毒蕈碱型乙酰胆碱受体，最优选为CBnmGli^Dl 禾口 M30离子通道可以通过门控，即开放和关闭通道的门控来分类。电压门控离子通道的激活/失活依赖于跨质膜的电压梯度，而配体门控离子通道的激活/失活取决于配体与通 道的结合。配体门控离子通道由在质膜组织的7个亚单位组成以形成转运阳离子或阴离子 能够移动通过的孔。配体结合位点通常位于亚单位之间的界面。并非所有的离子通道都是受体。因此，显然本发明适用于那些是受体，即识别激素 的离子通道。优选地，配体门控离子通道选自cys-环受体GABAa，GABAc，氨基乙酸(GIyR)， 血清素(5-HT)，烟碱乙酰胆碱(nAChR)受体，离子型谷氨酸门控受体GIuR，ΚΑ, NRl, NR2和 NR3，以及ATP-门控的Ρ2Χ受体等。酪氨酸激酶受体(例如那些与多种生长因子和胰岛素有关的受体)通常作为二聚 体发挥作用，并具有朝向细胞外的配体结合位点以及细胞内酪氨酸激酶酶活性。信号传导 的介导是酪氨酸残基磷酸化以及蛋白磷酸化事件级联反应诱导的结果。酪氨酸激酶还可以分为受体(RTK)和非受体型。优选地，酪氨酸激酶受体选自EGF 受体、胰岛素受体、PDGF受体、NGF受体、FGF受体、VEGF受体、HGF受体、Trk受体和TIE受 体。优选地，荧光配体包含与上述受体的任一种特异性的配体偶联的任何荧光团。更 优选地，荧光配体选自W02004088312和W02006032926 (其内容通过引用的方式并入本文) 中公开的那些和选自结合合适的荧光团的如下文所定义的新配体连接子，更优选地结合下 文所示的 BODIPY 630-650。在W02004088312中，我们公开了多种G蛋白偶联受体的荧光配体(激动剂和拮抗 剂)。利用共聚焦显微镜，我们已经能够显示，这些选择性地与单个活细胞中的膜受体结合。 此外，使用荧光相关光谱法(FCS)，我们已经能够定量评价这种在单个活细胞膜的小微结构 域中结合的特征。更优选地，通过如在W02006032926中综述的用于确定荧光配体的功能应答或药 理学特性的W02004088312的方法学来鉴定用于本发明的方法的荧光配体，所述方法学包 括 a)利用用于生物应答的传感器弓I发细胞或细胞材料b)随后与荧光配体接触其中荧光配体的结合以及其相关的生物应答在同一细胞中检测或监测，并明显不 同从而允许分别读数，以及其中如果结合的话，因此检测到是荧光配体的荧光；如果维持来 自细胞或细胞材料的相关的可测量的生物应答，这提示荧光配体是潜在的激动剂，或者如 果来自细胞或细胞材料的相关的可测量的生物应答减弱或消失，这提示荧光配体是潜在的 中性拮抗剂或反向激动剂。优选地，荧光配体包含一个或多个配体部分，其通过维持配体活性的连接位点的 连接子与一个或多个荧光部分连接。优选地，本发明的或用于本发明的荧光配体中，GPCR的配体部分选自作为以下受 体的配体有效的任何化合物腺苷受体、肾上腺素受体、毒蕈碱受体、组胺受体、阿片受 体、大麻类受体、趋化因子受体、α -肾上腺素受体、GABA受体、前列腺素类受体、5-ΗΤ (血清 素)受体、兴奋性氨基酸受体(例如，谷氨酸)、多巴胺受体、蛋白酶激活受体、神经激肽受 体、血管紧张素受体、催产素受体、白三烯受体、核苷受体(嘌呤和嘧啶)、钙敏感受体、促甲 状腺激素受体、神经降压素受体、加压素受体、嗅觉受体、核碱基受体(例如，腺苷)、溶血磷脂酸受体、鞘脂受体、酪胺受体(痕量胺)、游离脂肪酸受体以及环腺苷受体等，优选地作为 用于GPCR受体的配体，例如a)腺苷受体拮抗剂b)腺苷受体激动剂c) β _肾上腺素受体激 动剂以及d) β -肾上腺素受体拮抗剂。优选地，配体是非肽配体。荧光部分可以是WO 2004088312所述的任何部分。优选地，荧光部分是任一红、 绿、近红外、蓝等染料或其他类型的染料。适宜地，荧光配体选自特别包括如下在内的染料 荧光素，包括FITC的荧光素衍生物，以及荧光素样分子诸如俄勒P^iTM(0regon Green ) 和其衍生物、德克萨斯红TM(TeXaS redTM)、7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑(NBD)和其衍 生物、香豆素和其衍生物、萘包括丹磺酰氯衍生物或其类似物或衍生物、Cascade Blue , EvoBlue和其荧光衍生物、芘和吡啶噁唑衍生物、花青染料、dyomics(DY染料和ATTO染 料)和其荧光衍生物、Alexafluor染料和衍生物、BDI染料包括可商购的Bodipy 染料、 赤藓红、曙红、FITC、芘、蒽、吖啶、荧光藻胆蛋白和它们的结合物与荧光素化微珠、若丹明 和其荧光衍生物包括Rhodamine Green 包括四甲基若丹明、X-若丹明和德克萨斯红衍生 物以及Rhodol Green ,与氨基偶联，利用异氰酸酯、琥珀酰亚胺脂或双氯三嗪基_反应基 团以及其他红、蓝或绿色荧光染料特别是红色染料，如在Buschmarm V等，Bioconjugate Chemistry (2002)，ASAP论文中所评论的。优选的BODIPY (4,4- 二氟~4~硼-3a,4a- 二氮杂—s—引达省)荧光团包括跨 越可见光谱的那些并包括在 U. S. Pat. No. 4，774，339 ；U. S. Pat. No. 5，187，288 ；U. S. Pat. No. 5，248，782 ；U. S. Pat. No. 5，274，113 ；U. S. Pat. No. 5，433，896 ；U. S. Pat. No. 5，451，663 中列出的那些。该组中优选的成员选自如在上述专利中描述的任何杂芳基取代的B0DIPY 染料，这些专利的内容通过引用的方式并入本文。更优选地，荧光配体包含荧光素、德克萨斯红 、Cy5.5或Cy5或其类似物、B0DIPY 630/650 和其类似物、DY-630，DY-640、DY-650 或 DY-655 或其类似物、ATTO 655 或 ATTO 680 或其类似物、EvoBlue 30或其类似物、Alexa 647或其类似物。适宜地，荧光部分衍生自任一以上可商购的荧光团，包括或经修饰包括促进与配 体连接的反应基团。优选地，本发明的荧光配体通过如下设计荧光和配体部分的连接位点、连接方 法，即连接子的性质和长度以及其化学计量即1 1，2 1,1 2等，从而配体的结合和功 能保留在荧光配体内，且药理特性是已知的，从而结合和功能的调节是已知的。优选地，荧光配体具有下式LigJL L Jfi FI包括其盐，其可以作为外消旋物存在或作为它的旋光异构体之一存在，其中Lig包含配体部分，FI包含荧光部分且L包含如上文定义的以及如 W02004088312和WO 2006032926中定义的连接子，并且其中Jfi和Jl包含如W02004088312 和TO2006032926 (其中Jt是Jfi)中定义的连接位点或连接官能度(functionality), W02004088312和W02006032926的内容通过引用的方式并入本文。用于本发明的荧光配体可以是具有下式的新荧光配体LigJL L Jfi FI其中1，L，Jfi和FI如上文所定义的，以及Lig3 是-X (Z) Ar1 (Y-Ar2) a
其中X选自C，CH或NZ选自H，= 0，CV6烷(氧)基或连接X和Ar2的单键Y选自诸如-OCH2-的C^6烷氧基、单键、Cp6烷基、CV6胺基、Cp6羰基、-NHC( = 0)-、 含有1，2或3个N原子的5-7元含N饱和杂环a是整数1或2々!·1是5或6元的(杂)芳香族，其中杂原子是^▲! 1任选地被(1_8烃基、商、0!1等 取代，更优选地选自以下结构其中η选自0和1;且Ar2是6元芳香族，任选地被烃基、卤、OH等取代，更优选地选自以下结构其中m选自0、1和2，且R是C1^烃基、卤、OH等。优选地，L是L3,并且选自Ch2烷基，((V6烷氧基)^CH2烷基，酰胺和聚酰胺部 分包括(C^12 烷基 NHCOCV12 烷基)^、(C^12 烷基 CONHCV12 烷基)^、(COC1^12 烷基 NH) ^50, (NHCV12烷基CO) ^50, 5-7环化杂环CV12烷(氧)基，C1^12烷(氧)基-5-7环化杂环和C1^2 烷(氧)基5-7环化杂环Ch2烷基，其中1-3个杂原子、优选1或2个杂原子选自N，0和 S。更优选地，L3选自上述，其中烷(氧)基是甲(氧)基、乙(氧)基、丙(氧)基、丁(氧)基、戊(氧)基、己 (氧)基、庚(氧)基、辛(氧)基、任(氧)基、癸(氧)基、十一烷(氧)基、十二(氧) 基；杂环环包含6个环原子，更优选地选自哌嗪基、哌啶基、1，4 二氧杂环己烷、1，4- 二 噻烷、吗啉和硫代吗啉；((V6烷氧基hi是(乙氧基)、(乙氧基乙氧基)、(甲氧基)、(甲氧基甲氧基)
13或其组合；酰胺和聚酰胺部分是(CO乙烯基NH) C2_4烷基NHCO C2_4烷基，C2_4烷基⑶NH C2_4 烷基，最优选地选自CO乙烯基NH，C2烷基NHCO C2烷基，C2烷基NHCO C4烷基，C4烷基NHCO C2烷基，C2烷基CONH C2烷基，C2烷基CONH C4烷基和C4烷基CONH C2烷基。优选地，Jl和Jfi选自NH，CO, 5-7环化杂环，其中2_3个杂原子，优选2个杂原子选 自N和0。优选地，5-7环化杂环选自哌嗪和1，4 二氧杂环己烷。优选地，Jl和Jfi都是NH， 一个是NH且另一个为⑶，或者一个为NH且另一个为5-7环化杂环。更优选地，用于本发明的新荧光配体选自部分在本文附图1中示出的以下化合 物M,型配体N-{2-[4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6-二氢-IlH-吡啶并[2，3_b][l，4]苯并二氮 杂卓-11-基)乙基)-哌嗪-1-基]乙基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4a-二氢-5-(噻 吩-2-基)-4_硼_3a，4a_ 二氮杂引达省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{4-[4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6-二氢-IlH-吡啶并[2，3_b][l，4]苯并二氮 杂卓-11-基)乙基)-哌嗪-1-基]丁基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4a-二氢-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a_ 二氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{8-[4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6-二氢-IlH-吡啶并[2，3_b][l，4]苯并二氮 杂卓-11-基)乙基)-哌嗪-1-基]辛基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a_ 二氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{2-[2-(2-(4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6-二氢-IlH-吡啶并[2，3_b][l，4]苯 并二氮杂卓-11-基)乙基)-哌嗪-1-基)乙氧基)乙氧基]乙基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二 氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)-4_硼-3a，4a- 二氮杂_s_引达省_3_基)乙烯基)苯 氧基]乙酰氨基}己酰胺Dl-型配体N- {3-氧代-3-[4- (8-甲氧基_3_甲基2，3，4，5_四氢-1H-3-苯并氮杂卓基) 苯基氨]丙基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a, 4a- 二 氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N- {5-氧代-5-[4- (8_甲氧基_3_甲基_2，3，4，5_四氢-1H-3-苯并氮杂卓基) 苯基氨]戊基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a, 4a- 二 氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N- {6-氧代-6-[4- (8_甲氧基_3_甲基_2，3，4，5_四氢-1H-3-苯并氮杂卓基) 苯基氨]己基} -6- {2-[4- (2- (4) 4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a, 4a- 二 氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N- {8-氧代-8-[4- (8_甲氧基_3_甲基_2，3，4，5_四氢-1H-3-苯并氮杂卓基) 苯基氨]辛基} -6- {2-[4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a, 4a- 二 氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰胺
N-{4-氮杂-3，7-二氧代-7-[4-(8-甲氧基 _3_ 甲基 _2，3，4，5_ 四氢-1H-3-苯 并氮杂卓-1-基)苯基氨]庚基}-6-{2-[4-(2-(4，4- 二氟-4，4a- 二氢_5_(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a- 二氮杂弓丨达省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{4-氮杂-3，7-二氧代-7-[4-(7-溴代-8-甲氧基 _3_ 甲基 _2，3，4，5_ 四 氢-1H-3-苯并氮杂卓-1-基)苯基氨]庚基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻 吩-2-基)-4_硼_3a，4a_ 二氮杂引达省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺mGluR5~ 型配体N-{3-氮杂-4-氧代4-[2_氯_6-(3_氯苄氧基)吡啶_4_基]丁 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮杂-s_ 弓 | 达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}-己酰胺N-{5-氮杂-6-氧代-6-[2-氯_6-(3_氯苄氧基)吡啶_4_基]己 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮杂-s_ 弓 | 达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}-己酰胺N-{9-氮杂-10-氧代-10-[2-氯_6-(3_氯苄氧基)卩比啶-4-基]癸 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮杂-s_ 弓 | 达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}-己酰胺N-{9-氮杂-3，6-二氧杂-10-氧代-10-[2-氯-6-(3-氯苄氧基)吡啶_4_基]癸 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮杂-s_ 弓 | 达省-3-基)乙烯基)苯氧基]-乙酰氨基}己酰胺N-{4，7_ 二氮杂-3，8-二氧代-8-[2_氯-6-(3_氯苄氧基)吡啶_4_基]辛 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮杂-s_ 弓 | 达省-3-基)乙烯基)苯氧基]-乙酰氨基}己酰胺N-{4，9_ 二氮杂-3，10-二氧代-10-[2-氯-6-(3_氯苄氧基)吡啶_4_基]癸 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮杂-s_ 弓 | 达省-3-基)乙烯基)苯氧基]-乙酰氨基}己酰胺N-{6，9_ 二氮杂-5，10-二氧代-10-[2-氯-6-(3_氯苄氧基)吡啶_4_基]癸 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮杂-s_ 弓 | 达省-3-基)乙烯基)苯氧基]-乙酰氨基}己酰胺CBl-型配体N- {3-氮杂-4-氧代-4- [5- (4-氯苯基)-1- (2，4- 二 氯苯基)-4-甲基-IH-吡 唑-3-基]丁基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢 ~5~ (噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二 氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N- {5-氮杂-6-氧代-6- [5- (4-氯苯基)-1- (2，4- 二 氯苯基)-4-甲基-IH-吡 唑-3-基]己基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢 ~5~ (噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二 氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N- {9-氮杂-10-氧代-10- [5- (4-氯苯基)-1- (2,4- 二氯苯基)_4_ 甲基-IH-吡 唑-3-基]-癸基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a,4a_ 二氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N- {2- [4- (1-氧代-1- (5- (4-氯苯基)(2，4- 二 氯苯基)_4_ 甲基-IH-吡 唑-3-基)甲基)_ 哌嗪-1-基]乙基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4￡1-二氢-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a- 二氮杂弓丨达省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N- {4- [4- (1-氧代-1-(5- (4_ 氯苯基)(2，4- 二 氯苯基)_4_ 甲基-IH-吡 唑-3-基)甲基)-哌嗪-1-基]丁基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a- 二氮杂弓丨达省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N- {8- [4- (1-氧代-1-(5- (4_ 氯苯基)(2，4- 二 氯苯基)_4_ 甲基-IH-吡 唑-3-基)甲基)_ 哌嗪-1-基]辛基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢 _5_ (噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a- 二氮杂弓丨达省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{9-氮杂-3，6_ 二氧杂-10-氧代-10-[5-(4_ 氯苯基)-1-(2，4_ 二氯苯 基)-4-甲基-IH-吡唑-3-基]癸基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a_ 二氢-5-(噻 吩-2-基)-4-硼-3ai4a- 二氮杂-S-弓丨达省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{3，6-二氧杂-8-[4-(l-氧代-1-(5_(4_ 氯苯基)(2，4_ 二氯苯基)_4_ 甲 基-IH-吡唑-3-基)甲基)哌嗪-1-基]辛基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4a-二 氢-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a，4a-二氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨 基}己酰胺N-{4,9- 二氮杂-3，10- 二氧代-10_[5-(4-氯苯基)-1-(2，4_ 二氯苯 基)-4-甲基-IH-吡唑-3-基]癸基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a_ 二氢-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a_ 二氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺。荧光配体可以具有亲和力以使它能够永久地、半永久地或暂时地结合，并可以在 细胞系扩增前或扩增中保持结合或分离。在本发明特别的优势中，荧光配体半永久地或暂 时地结合充足的时间段以允许通过如上文所述的流式细胞术进行结合和分选。适宜地，这 一时间段可以是秒级的，更优选是分钟级的，最长达1小时。适宜地，结合30分钟到1小时 的时间段。如上文所述的，流式细胞术通常利用激光和荧光标记对单个细胞进行快速连 续分析，并鉴定具有特定荧光强度(在特定荧光波长下)的单个细胞，然后能够将这些 细胞分选为具有特定水平的荧光强度的群体或分选为在多孔板中的单个细胞。例如， Beckman-Coulter Epics Altra是装配有3种激光的细胞计数分选仪，允许用紫外或紫、蓝 和红光激发。激光束能够被对齐以同时冲击细胞，或者它们能够被偏移以使来自每一激光 的荧光能够在时间上分离。有8个检测器，允许分析6种颜色和散射参数。如果需要的话， 利用静电偏转机制，利用这一强大的分析能力能够分选鉴定的细胞。每秒钟5000个以上细 胞的分析/分选率是可能的，并且然后可以将分选的细胞置于微板的孔中。该仪器装有自 动臂从而允许规定数目的特定细胞类型的程控沉积，例如沉积到96孔板的每孔中。分选纯度应该为99%。在本发明的特别优势中，荧光配体能够用于既监测表达特定细胞表面受体(参见 下文的实施例1)的细胞群的同质性，还能提供用于基于细胞计数的细胞分选的荧光信号。优选地，本发明的方法包括鉴定适合用于选自GPCRs、配体门控离子通道和酪氨酸 激酶受体的药物靶标的配体。该方法还包括随后在鉴定的配体存在和不存在的情况下，筛 选针对本发明的细胞系的化合物或化合物库。细胞或细胞材料可以包含一种或多种细胞、细胞提取物、细胞勻浆液、纯化的或再 生的蛋白、重组蛋白或合成的蛋白等，并包括靶受体。包含细胞材料的样品可以衍生自植 物、动物、真菌、原生生物、细菌、古生菌(archae)或衍生自所述生物体的细胞系。用于制备 样品的动物或植物细胞可以是健康的或机能不良的，并任选地用于诊断诸如白血病或癌症 的疾病。在本发明的优选实施方案中，样本包括哺乳动物细胞、其提取物和勻浆液。优选地，样本包括活细胞材料，更优选地包括个别细胞或亚细胞区室，最优选地包 括活细胞中的GPCR、配体门控离子通道和酪氨酸激酶受体，包括这些蛋白的膜，可溶性受体 或者通道或者GPCR阵列。可以通过培养细胞或通过在细胞中表达蛋白以已知方式获得细 胞材料。在优选的实施方案中，细胞材料是表达如上文定义的GPCR、配体门控离子通道或 酪氨酸激酶受体的细胞，更优选地是表达相同这些的CHO细胞。细胞材料可以在与荧光配体接触前加上标签，例如通过带上GFP标签，例如带GFP 标签的GPCR、带GFP标签的(配体门控)离子通道和带GFP标签的酪氨酸激酶受体或荧光 抗体靶向的天然受体或配体门控离子通道，从而使细胞受体或离子通道显现，并覆盖有荧 光配体。可以在膜样本中或在被剧烈分散的细胞样本(中提供受体，例如诸如被剧烈分散 的细胞中的A1-AR的内源性受体。腺苷受体结合位点位于受体口袋内的深处，从而带有连 接子的荧光配体是优选的荧光拮抗剂或激动剂。尽管在修饰配体和保持拮抗剂结合活性方 面有相当大的自由度，但保持激动剂活化活性，即活化受体结合功能方面是较困难的。在本发明特别的优势中，荧光配体适合与FCS联用以能够在单分子水平研究配 体-受体结合。因为被监测的事件的性质，FCS用于研究溶液中分子相互作用的热力学和 动力学特征是理想的。本发明的另一特别的优势在于FCS方法能够适用于利用光子计数荧 光强度测量法来监测单分子水平的配体-受体结合。这排除了分子在共聚焦体积内移动的 任何要求。利用显示低背景荧光的配体，不需要在进行共聚焦显微镜检查或FCS前通过洗涤 去除未结合的配体。因此以时间和浓度依赖方式随时间测量荧光是可能的。共聚焦显微镜法(CSLM)允许通过细胞的截面的可视化，所述细胞在细胞边缘显 示了表明膜受体结合的荧光团的浓度。如本领域已知的，可视化属于特别的平面聚焦，以使 可以观察到通过单个细胞的“薄片(slice)”。可以选择不同颜色的通道以使不同荧光团类 型可视化。FCS是无创技术，其通过在统计学上分析荧光种类的光子发射模式经由非常小的 激发体积(< IO15I)分析荧光种类的扩散特征。因此，能够将快速扩散的游离配体与缓慢 扩散的受体结合的配体区分开，并同时当体积局限于细胞膜时进行定量。优选地，结合FCS的方法包括在< 10_151的共聚焦体积中测量荧光强度的波动。这些波动的统计分析给出了 关于扩散速度(即，质量)和存在的荧光分子的浓度的信息。因此，能够在单个细胞上同时 定量游离配体(快速扩散)和结合的配体(缓慢扩散)。FCS(荧光相关光谱)使粒子荧光发射波动与诸如粒子质量和浓度相关联以用于 溶液中分子相互作用的研究。FCS经由通过紧聚焦激光束的分析实质上监测微观检测体积 (10_151)的带荧光标签分子的自发荧光强度波动。在本发明的另外方面，提供了上文定义的新荧光配体。优选地，新荧光配体具有如 上文定义的下式Lig3JJJTFI。更优选地，新荧光配体选自本文所附图1中列出的化合物并如上文所述。本发明 的另外方面如上文所定义。在本发明的方法或者如上文所定义的用于该方法的试剂盒中，荧光配体优选与它 的受体结合方面的信息有关，以便选择用于克隆细胞系的合适荧光配体，建立所述克隆细 胞系是期望的。在由本发明的方法获得的重组细胞系的优选应用中，通过细胞系中的细胞的统一 表达水平，可以筛选化合物库并直接比较结果，或者可以研究受体结合并直接比较药理学 和信号传导特征。在本发明的另一方面，提供了已知或新荧光配体在本发明的方法中的用途，如上 文所定义的或如在W02004088312或W02006032926或其他出版物中所定义的，其内容通过 引用的方式并入本文。在本发明的另一方面，提供了通过本发明的方法鉴定的配体用于选自GPCR、配体 门控离子通道和酪氨酸激酶受体的药物靶标。在本说明书的描述和权利要求书中，词语“包含”和“含有”以及这些词语的变型， 例如“包含(comprising)”和“包含(comprises) ”意味着“包括但不局限于”，并不意在(以 及没有)排除其他部分、添加物、组分、整数或步骤。在本说明书的描述和权利要求书中，单数包括复数，除非上下文另有要求。特别 是，如果使用了不定冠词，应理解为本说明书包括复数以及单数，除非上下文另有要求。结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特性、化合物、化学 部分或基团应理解为适用于本文描述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与之相互 矛盾。读者的关注涉及与本申请有关的在本说明书之前或与之同时提交的所有文章和 文献，这些与本说明是都是公众能够检索到的，所有这些文章和文献的内容都通过引用的 方式并入本文。本说明书公开的所有特征(包括任一所附的权利要求、摘要和附图)，和/或本文 公开的任一方法或过程的步骤都可以以任一组合方式组合，除了这些特征和/或步骤中的 至少一些是相互排斥的组合。除非另外特别地指明，本说明书公开的每一特征(包括任一所附的权利要求、摘 要和附图)可以通过用作相同、等同或相似的目的可选的特征取代。因此，除非另外特别地 指明，公开的每一特征仅是一类系列的等同或相似特征的一个实例。本发明并不限于任一前述实施方案的细节。本发明延至任一新的本发明公开的特
18征或本发明公开的特征的任一新组合(包括任一随附的权利要求、摘要和附图)，或者延至 任一新的本文公开的方法或过程的步骤或这些步骤的任一新组合。现在参照附图和实施例以非限定方式示例本发明。实施例1-新荧光配体的合成使用所附的示意图(图2a_d)显示的方法合成前文所述的化合物并对其进行分析 (下文给出的数据)实施例la_M3荧光配体的制备-参见示意图2a11_(氯代乙酰基)-5，ll-二氢-6H-吡啶并[2，3_b][l，4]苯并二氮杂卓_6_酮 (1)合成(3)的总体过程将无水乙腈中的胺连接子⑵(1. 3当量)和N，N 二异丙基乙胺(3当量)溶液加 到11-(氯代乙酰基)-5，11_ 二氢-6H-吡啶并[2，3-b][l，4]苯并二氮杂卓-6-酮⑴(1 当量)中，将反应物在氮气下于85°C加热16-18小时。过滤反应混合物，将滤液减压脱水， 并通过快速柱色谱或硅胶制备薄层色谱法、利用溶于二氯甲烷中的5-15%甲醇作为洗脱剂 来纯化粗化合物以得到受保护的胺。11-{[4-(2-苄氧基羰基氨乙基)哌嗪-1-基]乙酰基}-5，11_ 二氢-6H-吡啶并 [2，3-b]-[l，4]苯并二氮杂卓-6-酮(3a)11-{[4-(4-苄氧基羰基氨丁基)哌嗪-1-基]乙酰基}-5，11_ 二氢-6H-吡啶并 [2，3-b]-[l，4]苯并二氮杂卓-6-酮(3b)m/z (TOF ES+)测得值为 543 (MH+，100% ) 11-{[4-(8_叠氮基辛基)哌嗪-1-基]乙酰基}-5，11_ 二氢-6H-吡啶并[2， 3-b]-[l，4]苯并二氮杂卓-6-酮(3c)11-[(4-{2-[2(2_叠氮基乙氧基)乙氧基]乙基}哌嗪-1-基)乙酰基]_5，11-二 氢-611-吡啶并-[2，3-13]-[1，4]苯并二氮杂卓-6-酮(3d)合成⑷的总体过程向溶于甲醇的氨基甲酸苄酯或叠氮化物(3) (1当量)溶液中加入甲酸铵(5当 量)，随后加入10%钯碳(100w/w%，与氨基甲酸苄酯或叠氮化物)。在室温下搅拌反应混 合物3小时，通过硅藻土过滤并将滤液用二氯甲烷洗涤(x3)。将滤液减压脱水，并在得到的 残渣中加入饱和的碳酸氢钠水溶液，然后将其用二氯甲烷提取(x4)。将合并的有机提取物 通过无水硫酸镁干燥并减压脱水以得到不需进一步纯化即可使用的胺类(4)。11-{[4-(2_氨基乙基)哌嗪-1-基]乙酰基}-5，11_ 二氢-6H-吡啶并[2， 3-b]-[l，4]苯并二氮杂卓-6-酮(4a)ll-{[4_(4-氨基丁基)哌嗪-1-基]乙酰基}-5，11_ 二氢-6H-吡啶并[2， 3-b]-[l，4]苯并二氮杂卓-6-酮(4b)ll-{[4_(8-氨基辛基)哌嗪-1-基]乙酰基}-5，11_ 二氢-6H-吡啶并[2， 3-b]-[l，4]苯并二氮杂卓-6-酮(4c)11-[(4-{2-[2(2_氨基乙氧基)乙氧基]乙基}哌嗪-1-基)乙酰基]_5，11-二 氢-6H-吡啶并_[2，3-b]-[l，4]苯并二氮杂卓-6-酮(4d)合成(5)的总体过程
将BODIPY 630/650-X，SE(l当量)和胺(4) (3_4当量)溶解在二氯甲烷中并避光 搅拌2-5h。将溶剂减压蒸发并通过硅胶制备薄层色谱法、利用15 85甲醇/ 二氯甲烷作 为洗脱剂来纯化粗混合物以得到蓝色固体样的化合物(5)。^{2-[4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6_二氢-1111-吡啶并[2，3_b][l，4]苯并二氮 杂卓-11-基)乙基)-哌嗪-1-基]乙基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4a-二氢-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a_ 二氮杂-s-引达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺(5a)m/z (TOF ES+)测得值为 926(MH+,90% )，129(100)。^{4-[4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6_二氢-1111-吡啶并[2，3_b][l，4]苯并二氮 杂卓-11-基)乙基)-哌嗪-1-基]丁基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4a-二氢-5-(噻 吩-2-基)_4_硼_3a，4a_ 二氮杂引达省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺(5b)m/z (TOF ES+)测得值为 954 (MH+，100% ) N-{8-[4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6-二氢-11H-吡啶并[2，3_b][l，4]苯并二氮 杂卓-11-基)乙基)-哌嗪-1-基]辛基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a_ 二氮杂-s-引达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺(5c)m/z (TOF ES+)测得值为 1010 (MH+，100% ) N-{2-[2-(2-(4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6-二氢-11H-吡啶并[2，3_b][l，4]苯 并二氮杂卓-11-基)乙基)_哌嗪-1-基)乙氧基)乙氧基]乙基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二 氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)-4_硼-3a，4a- 二氮杂-S-引达省_3_基)乙烯基)苯 氧基]乙酰氨基}己酰胺(5d)m/z (TOF ES+)测得值为1014 (MH+，100% )。实施例lb-Dl荧光配体的制备_参见示意图2b 8-甲氧基-7-溴-3-甲基-l-(4'-硝基苯基)-2，3，4，5_四氢-1H-3-苯并氮 杂卓。向溶于CHCl3(2mL)和THF(2mL)的8-甲氧基-3-甲基-1-(4'-硝基苯基)-2， 3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂卓(Neumeyer, J. L ；Baindur, N. ；Yuan, J. ；Booth, G.； Seeman, P. ；Nizniki, H. B. J. Med. Chem. 1990，33，521) (109mg, 349 u mol)溶液中加入溴 (54ia，1.05mmOl)。将反应物在室温搅拌2小时，然后通过加入10%焦亚硫酸钠的水溶 液(10ml)终止反应。并将该水溶液用CH2Cl2(3x20mL)提取。将合并的有机提取物通过无 水MgS04干燥并减压脱水。通过自动硅胶柱色谱、利用梯度Me0H/CH2Cl2(0 100 MeOH/ 012(12至5 95 Me0H/CH2Cl2)作为洗脱剂对该粗混合物进行部分纯化，随后通过硅胶PTLC、利用3 97Me0H/CH2ClJt为洗脱剂进行第二次纯化以得到作为本白色固体的标题 化合物(61mg，45%)。NMR(400MHz, CDC13)2. 34 (3H, s, NCH3)，2. 43-2. 52 (1H，m, CHH)，
2.60-2. 73 (2H, m, CH2)，2. 80-2. 96 (2H, m, CH2)，3. 03-3. 13 (1H, m, CHH)，3. 62 (3H, s, 0CH3)，
3.33 (1H, br d, J = 6. 5，CHCH2)，6. 21 (1H, s, CH)，7. 29 (1H, s, CH)，7. 30 (2H, d，J = 9. 1， CH)，8. 16 (2H, d, J = 9. 1，CH)。 8-甲氧基-7-溴-3-甲基-1-(4‘-氨基苯基)_2，3，4，5-四氢-1H-3-苯并氮杂 卓。向溶于Et0H(2mL)和浓缩的氨水(2mL)的8-甲氧基-7-溴-3-甲基_1_(4'-硝基 苯基)-2，3，4，5_ 四氢-1H-3-苯并氮杂卓(37mg,94. 6umol)溶液中加入 Na2S204(165mg， 946 u mol)，并将该混合物在室温搅拌3小时。将反应物减压浓缩并将CH2C12 (5mL)加入到用 浓缩的HCL将pH调到8的水溶液中。分层，并用CH2C12(3x 5mL)提取水溶液，将合并的有机 提取物用无水MgS04干燥并减压脱水以得到作为本白色固体的标题化合物(15mg，44% )。 MS (TOF ES+)363(MH+, 100% ) ,361(93)。 8-甲氧基-3-甲基-1_(4'-氨基苯基)-2，3，4，5-四氢-1H-3-苯并氮杂卓。向 溶于Me0H(10. 8mL)的8-甲氧基-3-甲基-1-(4‘-硝基苯基)-2，3，4，5-四氢-1H-3-苯 并氮杂卓(501mg,968umol)溶液中加入H20 (1. 2mL)，随后加入10% Pd/C(250mg) 0将反应 瓶暂时抽为真空，然后通过气球加入氢气；然后在室温下搅拌该混合物17小时。将该反应 混合物通过硅藻土(celtie)过滤，并将滤液用CH2C12(2x 15mL)洗涤。将溶剂减压蒸发以 得到作为深橙色固体的标题化合物(395mg,87% ) NMR(400MHZl CDC13) 2. 34-2. 48 (1H， m, CHH)，2. 43 (3HlS, NCH3)，2. 76-2. 90 (2H, m, CH2)，2. 91-3. 05 (1H, m, CHH)，3. 09-3. 27 (2H, m, CH2)，3. 65(3H，s，0CH3)，4. 30(lH,br d, J = 8. 4，CHCH2)，6. 29(lH，d，J = 2. 5，CH)，6. 63 (1H, dd，J = 8. 2，2. 6，CH)，6. 66-6. 73 (2H, m)，6. 94-6. 99 (2H, m)，7. 04 (1H, d，J = 8. 2，CH); MS (TOF ES+) 283 (MH+，100% ) 8-甲氧基-3-甲基-1_{[(4'-氨基苯基)-3_氧代丙基氨基]-3-氧代丙 基-氨基甲酸叔丁酯}_2，3，4，5_四氢-1H-3-苯并氮杂卓。向溶于CH2Cl2(3mL)的 Boc-0-Ala-0-Ala-0H(454mg，1. 75mmol)溶液中相继加入 DCC (360mg，1. 75mmol)、 DMAP(213mg, 1. 75mmol)和EtsN(243 u L，1. 75mmol)。将该混合物搅拌15分钟，然后加入溶 于CH2Cl2(3mL)的8-甲氧基-3-甲基-1-(4‘-氨基苯基)-2，3，4，5-四氢-1H-3-苯并氮 杂卓(248mg，880 u mol)溶液，将这一混合物在室温下搅拌14小时。将混合物通过硅藻土过 滤，用CH2C12(2x 10mL)洗涤并将过滤液减压脱水。通过自动硅胶柱色谱法、利用梯度MeOH/ CH2C12 (5 95Me0H/CH2Cl2至25 75Me0H/CH2Cl2)作为洗脱剂来部分纯化粗混合物，然后 将得到的红色油状物通过利用(15 85Me0H/CH2Cl2)作为洗脱剂的硅胶柱色谱来纯化以得 到作为红色固体的标题化合物(209mg,45% )。iHNMRQOOMHz，CDC13) 1. 43 (9H，s，C (CH3) 3) 2. 33-2. 43(3H，m)，2. 39 (3HlS, NCH3), 2. 60(2H，t，J = 5. 7，CH2)，2. 79(lH，dd，J = 14. 4,7. 7 CHH)，2. 87 (2H, brt, J = 8. 7, CH2)，3. 06 (2H, br d, J = 12. 7，CH2)，3. 40 (2H, dd, J = 12. 1 6. 0，CH2NH)，3. 62(2H，dd，J = 12. 1,6. 0，CH2NH)，3. 66 (3H，s，0CH3)，4. 30(lH,br d，J = 8. 0 CHCH2)，5. 15 (1H, br s，NH)，6. 25 (1H, d, J = 2. 4，CH)，6. 42-6. 52 (1H, br m, NH)，6. 64 (1H dd，J = 8. 4，2. 4，CH)，7. 05 (1H, d, J = 8. 4，CH)，7. 14 (2H, d，J = 8. 0，2x CH)，7. 53 (2H, d J = 8. 0，2xCH)，8. 06(lH,br s，NH) ；HRMS (T0F ES+) C29H4IN405 的计算值525. 3077。测得值 525. 3030 (MH+)。
8-羟基-3-甲基-1_{[(4'-氨基苯基)-3_氧代丙基氨基]-3-氧代丙基氨 基}-2，3，4，5_四氢-1H-3-苯并氮杂卓二氢溴酸盐。向溶于CH2Cl2(1.2mL)的8-甲氧 基-3-甲基-1- {[ (4 ‘-氨基苯基)-3-氧代丙基氨基]-3-氧代丙基-氨基甲酸叔丁酯} -2， 3,4,5-四氢-1H-3-苯并氮杂卓(32mg，61. liimol)的冰冷(_78°C )溶液中加入三溴化硼(611 u 1,611 u mol ；1M，溶于CH2C12)，使反应混合物回到室温并在N2下搅拌3小时。然后 将混合物冷却到_78°C，用MeOH(lmL)终止反应，并将溶剂减压蒸发以得到作为浅褐色固 体的标题化合物(29mg，定量的)。MS (TOF ES+) 411 (MH+, 20% ), 340 ([MH-^ Ala]+, 50% ), 269([MH-2 3 Ala].，100% )
MAB-3-氧代氨基丙基-3-氧代氨基丙基-X-BY630。向 B0DIPY630/650-X， SE(0. 95mg,1.44umol)和8-羟基-3-甲基-1-{[ (4 ‘-氨基苯基)_3_氧代丙基氨 基]-3-氧代丙基氨基} -2，3，4，5-四氢-1H-3-苯并氮杂卓二氢溴酸盐(5. 3mg, 9. 27 u mol) 中加入溶于无水DMF(lmL)的DIPEA(3. 5iU，20. 2iimol)溶液，并将该溶液避光搅拌2小 时。将溶剂减压蒸发，通过硅胶PTLC、利用(15 85 MeOH/CH2CI2)作为洗脱剂来纯化该粗 混合物以得到作为蓝色固体的标题化合物(0. 33mg 21% )0 MS (T0FES+) 956 (MH+, 100% )。
Br-MAB-3-氧代氨基丙基 _3_ 氧代氨基丙基-X-BY630。HRMS(T0F ES+) C52H56BBrF2N706S 的计算值1034. 3257。测得值1034. 3292 (MH+)。
MAB-3-氧代氨基丙基-X-BY630。MS (TOF ES+) 885 (MH+，100% ) MAB-5-氧代氨基戊基-X-BY630。MS (TOF ES+)913(MH+, 100% ) MAB-6-氧代氨基己基-X-BY630。MS (TOF ES+) 927 (MH+，100% )
MAB-8-氧代氨基辛基-X-BY630。MS (TOF ES+) 955 (MH+，100% ) 实施例lc-mGluR5荧光配体的制备-参见示意图2c _5] 实施例ld-CBl荧光配体的制各-参见示意图2d实施例2用如在实施例1中制备的新的荧光多巴胺D1受体拮抗剂N-{4-氮杂-3，7-二氧 代-7-[4-(8-甲氧基-3-甲基_2，3，4，5_四氢-1H_3-苯并氮杂卓-1-基)苯基氨]庚 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮杂-s_ 弓 | 达省-3-基)乙烯基)筛选表达人多巴胺D1受体的混合群细胞系。从图3可以清楚看 到，只有约20%的细胞标记有荧光D1受体拮抗剂，这表明仅20%的细胞在它们的细胞表 面表达D1受体。利用FACS细胞分选，将这些细胞分选和分离为表达低、中等、高水平多巴 胺D1受体的细胞群。图4显示了分选后获得的中等表达水平的细胞群。然后能够用诸如 Beckman-Coulter Altra的细胞分选仪将个别细胞置于96孔板的单个孔中。
权利要求
从细胞群生成以给定表达水平表达靶细胞表面受体的重组克隆细胞系的方法，所述细胞群包括用编码靶受体的cDNA序列的质粒转染并表达所述靶细胞表面受体的细胞，所述方法包括(c)用受体特异性荧光配体孵育所述细胞群(d)通过利用流式细胞术监测所述荧光配体的特异性结合，从步骤(c)选择表达所述靶细胞表面受体的单个细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)提供了用结合所述靶细胞表面受体的受体 特异性荧光配体对所述细胞群进行的荧光标记。
3.如权利要求1和2中任一项所述的方法，其中在步骤(d)选择的单个细胞适合用于 克隆入克隆细胞系。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其另外包括e)将从步骤(d)中选择的单个 细胞扩增为克隆细胞系。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其包括通过下述生成所述细胞群(a)用编码所述靶受体的cDNA序列和抗生素选择标志物的质粒转染细胞；以及(b)对表达特定细胞表面受体的那些细胞进行抗生素抗性选择从而生成细胞群。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中流式细胞术包括使用荧光活化细胞分选 仪(FACS )或荧光活化细胞分选技术。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中细胞表面受体选自G蛋白偶联受体 (GPCRs)、配体门控离子通道和酪氨酸激酶受体。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中荧光配体包含与对任一上述定义的受体 特异的配体偶联的任何荧光团。
9.如权利要求8所述的方法，其中荧光配体具有下式 Lig Jl L Jf1 Fl包括其盐，其可以作为外消旋物存在或作为它的旋光异构体之一存在， 其中Lig包含配体部分，Fl包含荧光部分且L包含连接子，并且其中Jf1和1包含连接 位点或连接官能度，或者荧光配体具有下式 Lig3 Jl L3 Jf1 Fl其中叉、L、Jf1和Fl如以上所定义的，并且 Lig3 是-X (Z) Ar1 (Y-Ar2)a 其中X选自C，CH或NZ选自H，= 0，Cp6烷(氧)基或连接X和Ar2的单键Y选自诸如-OCH2-的CV6烷氧基、单键、CV6烷基、CV6胺、CV6羰基、-NHC ( = 0)-和含 有1，2或3个N原子的5-7元含N饱和杂环 a是整数1或2八巧是5或6元的(杂)芳香族的，其中杂原子是^▲! 1任选地被(1_8烃基、卤、0!1等取 代，并更优选地选自以下结构 (CI)n其中η选自0和1 ；且Ar2是6元芳香族的，其任选地被C"烃基、卤、OH等取代，并更优选地选自以下结构 其中m选自0、1和2，且R是Ci_8烃基、卤、OH等；以及L是L3,并且选自CV12烷基，(Cp6烷氧基)^Ch2烷基，酰胺和聚酰胺部分包括 ((V12 烷基 NHCOCm 烷基)^、(C1^2 烷基 CONHCV12 烷基)H。、(COCV12 烷基 NH) ^、(NHC1^12 烷基CO) ^50, 5-7环化杂环CV12烷(氧)基，C1^12烷(氧)基-5-7环化杂环和C^12烷(氧) 基5-7环化杂环Cp12烷基，其中1-3个杂原子，优选1或2个杂原子选自N、O和S。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其包括鉴定适合用于选自GPCR、配体门控离 子通道和酪氨酸激酶受体的药物靶标的配体，以及任选附加地，随后在所鉴定的配体的存 在和不存在下筛选针对本发明的细胞系的化合物或化合物库。
11.具有式Lig3Jl L3Jf1 Fl的新荧光配体，其中JL, L，Jf1和Fl如以上所定义的，且Lig3 是-X (Z) Ar1 (Y-Ar2)a其中X选自C，CH或NZ选自H，= 0，Cp6烷(氧)基或连接X和Ar2的单键Y选自诸如-OCH2-的CV6烷氧基、单键、CV6烷基、CV6胺、CV6羰基、-NHC ( = 0)-和含 有1，2或3个N原子的5-7元含N饱和杂环a是整数1或2八巧是5或6元的(杂)芳香族的，其中杂原子是^▲! 1任选地被(1_8烃基、卤、0!1等取 代，且更优选地选自以下结构 其中η选自0和1 ；且Ar2是6元芳香族的，其任选地被C"烃基、卤、OH等取代，且更优选地选自以下结构 其中m选自0、1和2，且R是C^8烃基、卤、OH等。
12.如权利要求11所述的配体，其中L3选自CV12烷基，(Cp6烷氧基^jCH2烷基，酰 胺和聚酰胺部分包括(Ch2烷基NHCOCV12烷基)U、(Ch2烷基CONHCH2烷基)^、(COC1^12 烷基NH) ^、(NHCh2烷基CO) ^50, 5-7环化杂环C^12烷(氧)基，C1^12烷(氧)基_5_7环 化杂环和CV12烷(氧)基5-7环化杂环Ch2烷基，其中1-3个杂原子，优选1或2个杂原 子选自N、0和S。
13.如权利要求11或12所述的配体，其中L3如权利要求12中所定义的，其中烷(氧)基是甲(氧)基、乙(氧)基、丙(氧)基、丁(氧)基、戊(氧)基、己(氧) 基、庚(氧)基、辛(氧)基、任(氧)基、癸(氧)基、十一烷(氧)基或十二烷(氧)基；杂环环包含6个环原子，更优选地选自哌嗪基、哌啶基、1，4 二氧杂环己烷、1，4- 二噻 烷、吗啉和硫代吗啉；(C1^6烷氧基)⑶是(乙氧基)、(乙氧基乙氧基)、(甲氧基)、(甲氧基甲氧基)或其 组合；酰胺和聚酰胺部分是(CO乙烯基NH) i_2、C2_4烷基NHCO C2_4烷基、C2_4烷基CONH C2_4烷 基，所述部分最优选地选自CO乙烯基NH、C2烷基NHCO C2烷基、C2烷基NHCO C4烷基、C4烷 基NHCO C2烷基、C2烷基CONH C2烷基、C2烷基CONH C4烷基和C4烷基CONH C2烷基。
14.如权利要求11-13中任一项所述的荧光配体，其中叉和Jfi选自NH，CO,5-7环化杂 环，其中2-3个杂原子，优选2个杂原子选自N和0。
15.荧光配体，其选自以下配体M,型配体N-{2-[4-(2-氧代 2-(6-氧代-5，6-二氢-IlH-吡啶并[2，3_b][l，4]苯并二氮杂卓-11-基)乙基)_ 哌嗪-I-基]乙基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4￡1-二氢-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a- 二氮杂弓丨达省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{4-[4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6-二氢-IlH-吡啶并[2，3_b][l，4]苯并二氮杂 卓-11-基)乙基)_ 哌嗪-I-基]丁基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4￡1-二氢-5-(噻 吩-2-基)-4_硼_3a，4a_ 二氮杂引达省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N- {8- [4- (2-氧代-2- (6-氧代-5，6- 二氢-1IH-吡啶并[2，3-b] [ 1，4]苯并 二氮杂 卓-11-基)乙基)-哌嗪-1-基]辛基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4￡1-二氢-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a- 二氮杂_s_弓丨达省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{2-[2-(2-(4-(2-氧代-2-(6-氧代-5，6-二氢-IlH-吡啶并[2，3_b] [1,4]苯并二氮 杂卓-11-基)乙基)-哌嗪-1-基)乙氧基)乙氧基]乙基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4， 4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)-4-硼_3a，4a- 二氮杂_s_弓|达省_3_基)乙烯基)苯氧基] 乙酰氨基}己酰胺Dl-型配体N-{3-氧代-3-[4-(8-甲氧基-3-甲基2，3，4，5-四氢-1H-3-苯并氮杂卓-1-基)苯 基氨]丙基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a, 4a- 二氮 杂-S-引达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N-{5-氧代-5-[4-(8-甲氧基-3-甲基-2，3，4，5-四氢-1!1-3-苯并氮杂卓-1-基)苯 基氨]戊基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a, 4a- 二氮 杂-S-引达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N-{6-氧代-6-[4-(8-甲氧基-3-甲基-2，3，4，5-四氢-1!1-3-苯并氮杂卓-1-基)苯 基氨]己基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮 杂-S-引达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N-{8-氧代-8-[4-(8-甲氧基-3-甲基-2，3，4，5-四氢-1!1-3-苯并氮杂卓-1-基)苯 基氨]辛基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a, 4a- 二氮 杂-S-引达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N-{4-氮杂-3，7-二氧代-7-[4-(8-甲氧基-3-甲基-2，3，4，5-四氢-1H-3-苯 并氮杂卓-1-基)苯基氨]庚基}-6-{2-[4-(2-(4，4- 二氟-4，4a- 二氢_5_(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a_ 二氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{4-氮杂-3，7- 二氧代-7-[4-(7-溴代-8-甲氧基-3-甲基_2，3，4，5_四 氢-1H-3-苯并氮杂卓-1-基)苯基氨]庚基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a- 二氮杂_s_弓丨达省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺mGluR5~型配体N- {3-氮杂-4-氧代-4- [2-氯-6- (3-氯苄氧基)吡啶 _4_ 基]丁基} _6_ {2- [4- (2- (4， 4-氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)_4_硼-3a，4a- 二氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}_己酰胺N- {5-氮杂-6-氧代-6- [2-氯-6- (3-氯苄氧基)吡啶_4_基]己基} _6_ {2- [4- (2- (4， 4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)-4-硼_3a，4a- 二氮杂-s_弓丨达省-3-基)乙烯基) 苯氧基]乙酰氨基}_己酰胺N-{9-氮杂-10-氧代-10-[2-氯-6-(3-氯苄氧基)吡啶_4_基]癸 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮杂-s_ 弓 | 达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}-己酰胺N-{9-氮杂-3，6- 二氧杂-10-氧代-10-[2-氯_6_(3_氯苄氧基)吡啶_4_基]癸 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮杂-s_ 弓 | 达省-3-基)乙烯基)苯氧基]-乙酰氨基}己酰胺N-{4, 7- 二氮杂-3，8- 二氧代-8-[2-氯_6-(3_氯苄氧基)吡啶_4_基]辛 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮杂-s_ 弓 | 达省-3-基)乙烯基)苯氧基]-乙酰氨基}己酰胺N-{4,9- 二氮杂-3，10- 二氧代-10-[2-氯_6-(3_氯苄氧基)吡啶_4_基]癸 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮杂-s_ 弓 | 达省-3-基)乙烯基)苯氧基]-乙酰氨基}己酰胺N-{6,9- 二氮杂-5，10- 二氧代-10-[2-氯_6-(3_氯苄氧基)吡啶_4_基]癸 基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二氮杂-s_ 弓 | 达省-3-基)乙烯基)苯氧基]-乙酰氨基}己酰胺 CBl-型配体N-{3-氮杂-4-氧代-4-[5-(4-氯苯基)-1-(2，4- 二氯苯基)-4_甲基-IH-吡 唑-3-基]丁基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼 _3a，4a- 二 氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N-{5-氮杂-6-氧代-6-[5-(4-氯苯基)-1-(2，4- 二氯苯基)-4_甲基-IH-吡 唑-3-基]己基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢 ~5~ (噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a- 二 氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰胺N- {9-氮杂-10-氧代-10- [5- (4-氯苯基)-1- (2，4- 二氯苯基)-4-甲基-IH-吡 唑-3-基]-癸基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻吩-2-基)~4~ 硼-3a, 4a_ 二氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰胺Ν-{2-[4-(1-氧代-l-(5-(4-氯苯基)-l-(2，4- 二 氯苯基)-4_ 甲基-IH-吡 唑-3-基)甲基)_ 哌嗪-1-基]乙基}-6-{2-[4-(2-(4，4-二氟-4，4￡1-二氢-5-(噻 吩-2-基)-4_硼_3a，4a_ 二氮杂引达省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺Ν-{4-[4-(1-氧代-l-(5-(4-氯苯基)-l-(2，4- 二 氯苯基)-4_ 甲基-IH-吡 唑-3-基)甲基)-哌嗪-1-基]丁基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢-5-(噻 吩-2-基)-4_硼_3a，4a_ 二氮杂引达省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺Ν-{8-[4-(1-氧代-l-(5-(4-氯苯基)-l-(2，4- 二 氯苯基)-4_ 甲基-IH-吡 唑-3-基)甲基)_ 哌嗪-1-基]辛基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a- 二氢 _5_ (噻吩-2-基)-4_硼_3a，4a_ 二氮杂引达省_3_基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N-{9-氮杂-3，6- 二氧杂-10-氧代-10-[5-(4-氯苯基)-1-(2，4_ 二氯苯 基)-4-甲基-IH-吡唑-3-基]癸基} -6- {2- [4- (2- (4，4- 二氟-4，4a_ 二氢-5-(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a_ 二氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺N- {3，6- 二氧杂-8- [4- (1-氧代-1- (5- (4-氯苯基)-1- (2，4- 二 氯苯基)-4-甲 基-IH-吡唑-3-基)甲基)哌嗪-1-基]辛基}-6-{2-[4-(2-(4，4- 二 氟-4,4a- 二 氢-5-(噻吩-2-基)-4-硼-3a，4a-二氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)苯氧基]乙酰氨 基}己酰胺N-{4，9- 二氮杂-3，10- 二氧代-10-[5-(4-氯苯基)-1-(2，4- 二 氯苯基)-4_ 甲 基-IH-吡唑-3-基]癸基}-6-{2-[4-(2-(4，4- 二 氟-4，4a- 二 氢 _5_(噻 吩-2-基)-4-硼_3a，4a_ 二氮杂-S-引达省-3-基)乙烯基)-苯氧基]乙酰氨基}己酰 胺。
16.通过权利要求1-10中任一项所述的方法获得的重组细胞系在筛选用于新治疗剂 的化合物库中或在研究细胞表面受体的药理学和信号传导特征中的用途。
17.利用通过权利要求1-10中任一项所述的方法获得的重组细胞系的治疗方法。
18.与权利要求1-10中任一项所述的方法一起使用的试剂盒，其包含一套说明书以及 用于所述方法的一种或多种荧光配体。
19.如以上定义的已知和新的荧光配体在权利要求1-10中任一项所述的方法中的用途。
20.通过权利要求1-10中任一项所述的方法鉴定的配体用于选自GPCR、配体门控离子 通道和酪氨酸激酶受体的药物靶标的用途。
全文摘要
从细胞群生成以给定表达水平表达靶细胞表面受体的重组克隆细胞系的方法，所述细胞群包括用编码靶受体的cDNA序列的质粒转染且表达所述靶细胞表面受体的细胞，所述方法包括(c)用受体特异性荧光配体孵育所述细胞群，(d)通过利用流式细胞术监测所述荧光配体的特异性结合，从步骤(c)选择表达所述靶细胞表面受体的单个细胞；以及新的荧光配体。
文档编号C12N15/10GK101896604SQ200880118065
公开日2010年11月24日 申请日期2008年9月29日 优先权日2007年9月28日
发明者史蒂芬·约翰·希尔, 巴瑞·克拉姆, 理查德·约翰·米戴尔登 申请人:圣瑞细胞荧光技术有限公司