一种抗猪2型圆环病毒病的重组蛋白亚单位疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种抗猪2型圆环病毒病的重组亚单位疫苗，该疫苗是具有较高免疫原性的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白（flagellin）和猪2型圆环病毒Cap蛋白的融合蛋白。本发明通过将人工编码的Flagellin-ORF2、Flagellin-ΔORF2基因融合克隆进pFastBac表达载体，同ORF2、ΔORF2重组克隆（pFastBac载体）一起转染Sf9细胞，利用杆状病毒系统表达四个融合蛋白，并通过间接免疫荧光（IFA）和Western-blot进行鉴定。通过上述系统获得重组杆状病毒的周期短，且表达的flagellin+Cap融合蛋白具有较高的免疫保护力。
【专利说明】—种抗猪2型圆环病毒病的重组蛋白亚单位疫苗
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种抗猪2型圆环病毒病的亚单位疫苗。
【背景技术】
[0002]猪圆环病毒于1974年首次在猪肾细胞系PK15细胞中发现，并被认为具非致病性。1991年在加拿大猪群中发现称之为断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemic wasting syndrome,PMWS)的病,发现其主要是由一种致病性猪圆环病毒引起，被国际分类学会划分为PCV2，而非致病性的猪圆环病毒划分为PCVl。PCV2属圆环病毒科圆环病毒属，其基因组由一环状单链DNA组成，是迄今发现的最小的一种动物病毒。PCV2含有2个主要阅读框ORFl和0RF2，其中ORFl负责编码与病毒复制相关的蛋白(Rep)，而0RF2编码病毒的结构蛋白Cap蛋白。PCV2感染可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸疾病综合征(PRDC)、猪皮肤和肾病综合征(PDNS)等多种疾病(总称为猪圆环病毒病，PCVD)。研究表明，该病毒在猪的淋巴系统增殖，可引起免疫细胞凋亡，造成免疫抑制，导致机体抵抗力下降，诱发多种病毒和细菌的混合感染和继发感染，给养猪业造成巨大的经济损失，已引起世界各地广泛重视。
[0003]目前防控猪2型圆环病毒病的主要方法是接种疫苗，生产中使用的疫苗主要是PCV2全病毒灭活疫苗、PCV1-PCV2嵌合病毒灭活疫苗以及杆状病毒表达PCV2基因工程疫苗。这些疫苗对防制猪2型圆环病毒病有一定的效果，但该病仍然严重发生和流行，说明仅能产生体液免疫应答能力 的灭活疫苗和常规的基因工程亚单位疫苗不能很好地控制猪圆环病毒病。猪2型圆环病毒导致B淋巴细胞和T淋巴细胞的减少甚至缺失而引起免疫抑制，因此仅能产生体液免疫应答的灭活疫苗和亚单位疫苗不能产生理想的免疫效果，研究表明，目前使用的商品疫苗均不能刺激机体产生细胞免疫应答导致防控PCV2感染的效果不理想，因此如何开发出能同时激活体液和细胞免疫应答是PCV2疫苗研究的方向。病原感染宿主引起致病是通过病原与宿主相互作用表现出来的，TLR受体在强毒力病原致病或减毒疫苗产生免疫应答方面起重要作用。鞭毛蛋白，是一种TLR5配体，能显著增强抗原的免疫原性与保护性。研究表明，将西尼罗病毒囊膜蛋白与鞭毛蛋白融合制成疫苗免疫能产生抗病毒攻击的中和抗体与保护性抗体，而单独的亚单位抗原免疫不能产生合适的保护性抗体应答。为此，PCV2的免疫原性蛋白0RF2基因与鞭毛蛋白基因连接，并于杆状病毒中表达，开发出良好免疫效力的新型亚单位疫苗，用于猪圆环病毒病的有效防控具有重要意义。
【发明内容】
[0004]为了解决上述问题，本发明的一个目的是提供一种高免疫原性且没有安全隐患的抗猪2型圆环病毒病的亚单位疫苗，所述的高免疫原性的亚单位疫苗保护性抗原是鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白(flagellin)和猪2型圆环病毒Cap蛋白的融合蛋白。
[0005]本发明的另一个目的是提供上述鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白(flagellin)和猪2型圆环病毒Cap蛋白的融合蛋白的制备方法。[0006]为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案:
[0007]本发明首先提供了一种融合蛋白，其为猪2型圆环病毒Cap蛋白与消除毒力的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的融合蛋白。该融合蛋白的氨基酸序列见SEQ ID N0.2所示，编码上述flagellin+Cap融合蛋白的基因，其核苷酸序列见SEQ ID N0.1，该基因用FlagelIin_0RF2表不。
[0008]此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码基因具有相同功能的核苷酸序列。本发明还包括基于所述基因的正义序列或反义序列，包括含有所述核苷酸序列的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞等等。
[0009]本发明还进一步提供所述flagellin+Cap融合蛋白的制备方法,其包括以下步骤:
[0010]人工合成编码所述融合蛋白的基因，连接到pFastBac-HA质粒，得到重组载体pFastBacHA-flagellin+0RF2，转化E.coli DHlOBac感受态细胞，然后利用其含有细菌Tn7转座系统，将该基因转座至杆状病毒穿梭载体bacmid中，得到重组质粒Bacmid-f IagelIin+0RF2，将其转染昆虫Sf9细胞，获得重组杆状病毒，并以昆虫Sf9细胞为寄主细胞培养病毒，采用N1-NAT亲和层析法纯化带有His标签的目的蛋白。
[0011]本发明提供的flagellin+Cap融合蛋白中的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白(flagellin)作为TLR5的识别受体，可诱导产生天然免疫应答。鞭毛蛋白还可以通过自身激发先天性免疫系统产生应答，以启动增强特异性免疫系统对其他与鞭毛蛋白相连接的抗原产生特异性的应答，发挥较强的免疫佐剂作用，而且可以在粘膜表面诱导以Th2型免疫反应并且伴有IgA的分泌。本发明提供的融合蛋白中的Cap蛋白是0RF2阅读框编码的PCV2结构蛋白。此蛋白具有良好的免疫原性，是PCV2的保护性抗原，其诱导的中和抗体能保护宿主不受PCV2的感染。可见，本发明提供的融合蛋白，鞭毛蛋白作为佐剂增强了 Cap蛋白的免疫应答，具有更好的保护作用。另外，本发明研究意外发现，删除核定位信号的Cap蛋白(A0RF2)比原蛋白具有更强的免疫原性，然而将flagellin+Cap融合表达与将flagellin+Λ 0RF2融合表达相比，前者却表现出更佳的免疫保护力。
[0012]本发明是通过真核表达系统中Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白与猪2型圆环病毒Cap蛋白进行融合表达，表达融合蛋白的周期短，其表达产物具有与天然产物相似的理化和生物学特性，能对蛋白质进行正确的翻译后加工修饰，表达稳定，而且表达产量高，且该融合蛋白具有良好的免疫原性，对实验动物进行强毒攻击后有较好的免疫保护力。本发明的鞭毛蛋白是经过改造后的鞭毛蛋白，其中去掉了鞭毛蛋白毒力的部分，消除了鞭毛蛋白毒力的影响，因此通过本发明提供的表达系统能获得没有毒副作用的且具有免疫学活性的表达产物，对抗猪2型圆病毒新型疫苗的开发具有重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1是目的基因扩增结果，其中I~3分别是A0RF2，Flagellin-Δ 0RF2,FlagelIin-0RF2 的扩增条带；M 是 DL2000Marker。[0014]图2是目的基因扩增到DH5a鉴定结果，其中1、2是pFastBac-Λ 0RF2，3、4 是 pFastBac-Flagellin-Δ 0RF2, 5 是 pFastBac-Flagellin_0RF2 基因条带；M 是DL2000Markero
[0015]图3是阳性重组质粒转化到DHlOBac感受态细胞后，提取质粒PCR鉴定结果，其中，1 ~6 分别是 Λ 0RF2、Flagellin-Λ 0RF2、Flagellin-0RF2、pFastBac-Λ 0RF2、pFastBac-Flagellin-Δ0RF2 和 pFastBac-Flagellin_0RF2 ;M 是 DL2000Marker。
[0016]图4是重组杆状病毒转染Sf9细胞结果，其中，(I)是转染后Sf9细胞，(2)是Bacmid空载体，(3)正常Sf9细胞。
[0017]图5是转染Sf9细胞沉淀进行Western-blot结果，其中，I~3分别是Bac-flagellin-0RF2, Bac-f Iagellin- Δ 0RF2 和 Bac_A0RF2 ;M 是 7_175KDmarker。
[0018]图6是IFA检测重组质粒转染Sf9细胞结果，其中I~5分别是Bac-Λ 0RF2转染Sf9 细胞、Bac-Flagellin- Δ 0RF2 转染 Sf9 细胞、Bac-FlagelIin_0RF2 转染细胞、Bacmid 空质粒对照和正常Sf9细胞IFA检测结果。
[0019]图7是SDS鉴定蛋白纯化结果，其中，I~4分别是Bac-A0RF2、Bac_0RF2、Bac-f Iagellin- Δ 0RF2 和 Bac-f lagelIin_0RF2 组纯化条带；M 是 7-175KDmarker。
[0020]图8是Western-blot鉴定纯化蛋白结果，I~4分别是Bac-Λ 0RF2，Bac_0RF2，Bac-f Iagellin- Δ 0RF2, Bac-f lagel I in_0RF2 组纯化条带；M 是 7-175KD marker。
[0021]图9是ELISA检测免疫后小鼠血清内抗体水平图，其中(I)免疫剂量为2 μ g的小鼠血清内抗体水平，(2)免疫剂量为10 μ g的小鼠血清内抗体水平。
[0022]图10是ELISA检测攻毒后小鼠血清内抗体水平图，其中(I)免疫剂量)免疫剂量为2μ g的小鼠攻毒后血清内抗体水平，(2)免疫剂量为10 μ g的小鼠攻毒后血清内抗体水平。
[0023]图11是小鼠血清内中和抗体水平。
[0024]图12是免疫组和对照组小鼠攻毒后，肝脏与肾脏免疫组织化学观察图，其中，(A):空白对照肝组织，(B):Bac-flagellin-0RF2免疫攻击组小鼠肝组织，(C):Bac-0RF2免疫攻击组小鼠肝组织，(D):空白对照攻击组小鼠肝组织，(E):空白对照肾组织，(F):Bac-f lagel I in-0RF2免疫攻击组小鼠肾组织，(G):Bac-0RF2免疫攻击组小鼠肾组织，(H):空白对照攻击组小鼠肾组织。
【具体实施方式】
[0025]以下实施例用于对本发明的进一步说明，但不应该理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
[0026]实施例1猪2型圆环病毒Cap蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白在昆虫Sf9细胞中的融合表达
[0027]1.1构建重组载体
[0028]1.1.1 A0RF2、Flagellin-0RF2 和 Flagellin-A0RF2 基因的 PCR 扩增:
[0029]人工合成的A0RF2基因，其是删除核定位信号的编码Cap蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示；人工合成的FlagelIin-0RF2基因核酸序列见SEQ ID N0.1 ；Flagellin-Λ 0RF2基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示。[0030]A0RF2基因的上下游引物，分别是:
[0031]上游引物(Pl):CCCTCGAGGAATGGCATCTTCAACACCCG
[0032]下游引物(P2):CCCAAGCTTGGAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTAA ；
[0033]FlagelIin-0RF2 和 Flagellin-Λ 0RF2 的上下游引物分别是:
[0034]上游引物(Ρ3):CCCTCGAGGATGACGTATCCAAGGAGGCG
[0035]下游引物(Ρ4): CCTCGAGGATGGCACAAGTAATCAACAC
[0036]其中Ρ1、Ρ3、Ρ4包含XhoI酶切位点，见下划线，Ρ2包含HindIII酶切位点，见下划线，通过对PCR反应条件和试剂优化后建立20 μ I的反应体系，见表1:
[0037]表1:PCR反应具体物质的量
[0038]
【权利要求】
1.一种融合蛋白，其为猪2型圆环病毒Cap蛋白与鼠伤寒沙丨I囷鞭毛蛋白的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID N0.2所示。
3.编码权利要求1所述融合蛋白的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示。
5.—种表达载体,其含有权利要求3或4所述的基因。
6.—种细胞系,其含有权利要求5所述的表达载体。
7.一种抗猪2型圆环病毒病的重组亚单位疫苗，其特征在于，其保护性抗原是权利要求I所述的融合蛋白。
8.制备权利要求1所述融合蛋白的方法，其包括以下步骤:人工合成编码权利要求1所述蛋白的基因，连接到pFastBac-HA质粒，得到重组载体pFastBacHA-flagellin+0RF2,转化E.coli DHlOBac感受态细胞，然后利用其含有细菌Tn7转座系统，将该基因转座至杆状病毒穿梭载体bacmid中，得到重组质粒Bacmid-f lagellin+0RF2,将其转染昆虫Sf9细胞，获得重组杆状病毒，并以昆虫Sf9细胞为寄主细胞培养病毒，采用N1-NAT亲和层析法纯化带有His标签的目的蛋白。`
【文档编号】A61K39/12GK103739717SQ201410018219
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月15日 优先权日:2014年1月15日
【发明者】刘爵, 张春燕, 韦莉, 王菁, 朱珊珊, 全荣, 阎旭, 李子璇 申请人:北京市农林科学院