重组方法及其所用试剂的制作方法

专利名称：重组方法及其所用试剂的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及重组至少两个核酸序列的方法及其所用试剂。更具体地，本发明涉及在表达recBCD核酶或其功能衍生物的宿主细胞中重组环形核酸序列和线形核酸序列的方法。本发明的方法可特别地用于通过与线形DNA序列同源重组来修饰细菌人工染色体。
有必要更进一步地了解高等真核生物基因组的结构和组成。基因组序列经常比编码序列长很多。尽管仍不知道大多数非-编码序列的功能，但它们显然在调节基因表达，稳定性和进化方面起着重要作用。与非相关的或病毒启动子所驱动的cDNA构建体形成对照的是，大基因组片段的基因转移显示出正确的时间-和组织-特异性基因表达1-7。
酵母人工染色体(YAC)已提供了很多疾病基因的基因组克隆8-10。具有多种人基因座YAC的转基因模型已阐明这种大的基因组片断可用于产生多种疾病的准确模型11-14。酵母中高效率的同源重组对于基因操作YAC以进行功能分析3，8，15，将YAC环化成PAC或BAC16，17和由较小的重叠YAC产生较大的YAC具有重要的意义。
然而，YAC系统存在几个严重妨碍其应用的局限性。YAC具有高水平的克隆不稳定性和嵌合状态19，20。另外，尽管已研究出多种方法用于产生YAC转基因学，但仍难以纯化转基因所用的完整的YAC DNA21。用于在YAC中导入修饰或者用于进行TAR克隆的酵母同源重组系统的重要缺点22是难以调节同源重组的程度，并且需要筛选大量“重组”克隆以鉴定正确的产物。
大-插入物BAC/PAC克隆系统23，24已克服了YAC系统的很多难题。BAC/PAC已越来越多地用于长-范围的物理图谱绘制25，26，疾病基因的定位克隆27，整个基因组测序计划28-30和功能研究31，32。由于细菌中的克隆效率更高，因此相对于YAC文库而言，高质量BAC/PAC基因组文库的构建更加容易。在已被详尽-定义的重组-缺损的大肠杆菌菌株DH10B中，每个细胞内可维持1-2拷贝的BAC/PAC，在该菌株多代的繁殖过程中，BAC/PAC表现出较高的克隆稳定性。尽管BAC/PAC携有大小约为300kb的插入物，但仍可以通过常规的细菌质粒分离方法大量纯化BAC/PAC以进行功能研究。这些克隆中的基因组插入物大得足以能维持大多数人基因座的完整性，因此对于功能研究来说较为理想。
尽管存在这些优点，而且BAC/PAC作为在很多系统中进行基因组研究所需的重要工具越来越受欢迎，但仍没有简单易行的技术能对这些克隆进行基因操作。这些克隆中基因组插入物较大，这一点阻碍了在常规的基础上发现合适的限制性位点。
1989年，人们首次使用大肠杆菌基于F-质粒的载体中的同源重组来连接重叠的果蝇粘粒片断以形成125kb片断35。在rec+菌株中，具有温度敏感型复制起点的穿梭质粒之间共-整合，而分辨共-整合需要rec-宿主中的第二个位点-特异性重组事件。Sternberg34描述了将真核生物的选择标记转座插入大的P1克隆的方法，尽管难以精确控制转座位点，但该方法应该也适用于PAC和BAC。已成功使用借助于RecA的限制性内切核酸酶(RARE)裂解法在大量P1和BAC克隆中导入修饰35，但此方法在技术上很受限制。由于PAC和BAC克隆系统在每个载体的骨架上都包括loxP位点，很多研究人员用cre重组酶将真核选择标记和报道基因靶向插入此位点36，37。
Yang等38报道了使用具有温度敏感型复制起点的穿梭质粒中的野生型recA基因靶向修饰131kb BAC，从而赋予DH10B细胞瞬时的精通重组的能力。然而，有证据表明使用此方法显著重排克隆必需通过Southern印迹鉴定重组克隆以鉴定出正确的产物。另一种使用大肠杆菌CBTS菌株的方法也被用于在含有完整的小鼠CMV基因组的230kbBAC中导入修饰39，其中所述菌株的recA基因中携有温度-敏感型琥珀突变。然而，难以将BAC由DH10B直接转移至条件recA菌株。最近，有人使用含有适当定向的chi位点的靶向构建体，将绿色荧光蛋白基因靶向至含有GATA-2基因座的斑马鱼BAC40。然而，这必需将BAC转移至精通重组的菌株，这可能会导致具有重复序列的克隆的不稳定性。
还有人描述了用噬菌体λ的Red-Gam系统替代大肠杆菌的RecBCD功能的方法41。这种替代使得宿主染色体和短的线性DNA片断之间同源重组的发生率比recBCsbsBC或recD菌株所表现出的高至少70倍。然而，仍未阐明该系统修饰BAC/PAC的用途。
上述方法无一最适于对PAC和BAC进行基因操作。它们不能在表达RecBCD的宿主细胞(如DH10B)中直接使用，或者还需要构建复杂的穿梭载体。在大多数这些方法中，不能较好地控制同源重组的程度，因此会出现不必要的重排风险。所以，需要开发出以可控制的方式直接在宿主细胞中使两个核酸序列，如BAC/PAC与线性DNA序列重组的方法。
在导致本发明的工作中，发明人探求开发一种在体内使两个核酸序列(如环形DNA序列)与线性DNA序列可控同源重组的方法。特别是，发明人通过在宿主细胞中表达可调制的recE/recT重组系统以及可调制水平的recBCD核酶抑制剂，使得DNA序列与BAC发生同源重组而对BAC进行修饰。表达recBCD核酶抑制剂是为了抑制内源性产生的recBCD核酶的功能活性。另外，调制和协同表达recE/recT同源重组系统和recBCD核酶抑制剂的能力便于控制同源重组事件，并使随机的和不必要的重组事件最小化。调制和协同表达同源重组系统和recBCD核酶抑制剂的能力便于在以下两种情况下在体内诱导同源重组事件，所述情况是身为重组主体的至少一个核酸序列位于F-质粒(如BAC)，或者宿主细胞对过量表达重组系统分子或recBCD抑制剂(如gam)敏感。
发明简述在整个说明书和其后的权利要求书中，除非上下文需要，否则的话，术语“含有”应被理解成包括所提及的一个整数或步骤或一组整数或步骤，但不排除任何其它整数或步骤或其它组整数或步骤。
说明书中所指的核苷酸和氨基酸序列的序列鉴定号(SEQ ID No.)将在文献目录之后定义。
因此，本发明提供了便于在至少两个核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组至少两个核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述至少两个核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD和编码外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂的表达是可调制的。
另一方面，本发明提供了便于在至少两个核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组至少两个核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述至少两个核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD，recE，recT和编码recBCD抑制剂或其功能衍生物的核苷酸序列，recE，recT和编码recBCD抑制剂的核苷酸序列的表达是可调制的。
另一方面，本发明提供了便于在至少两个核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组至少两个核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述至少两个核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD，recE，recT和gam或其功能衍生物，recE，recT和gam的表达是可调制的。
另一方面，本发明提供了便于在至少两个核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组至少两个核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述至少两个核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD，recE，recT和gam或其功能衍生物，recE，recT和gam的表达是可调制的。
另一方面，本发明提供了便于在至少两个核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组至少两个核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述至少两个核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD和编码外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂的表达是可调制的。
另一方面，本发明提供了便于在环形核苷酸序列和线性核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组环形核苷酸序列和线性核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述环形核苷酸序列和所述线性核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD和编码外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂的表达是可调制的。
另一方面，本发明提供了便于在环形核苷酸序列和线性核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组环形核苷酸序列和线性核苷酸序列的条件下培养DH10B细胞或其同系物或其突变体，以在DH10B细胞或其同系物或其突变体中诱导所述环形核苷酸序列和所述线性核苷酸序列之间的重组，其中所述DH10B细胞或其同系物或其突变体能表达recBCD，recE，recT和gam或其功能衍生物，recE，reeT和gam的表达是可调制的。
另一方面，本发明提供了便于在至少两个核苷酸序列之间进行同源重组的方法，其中至少一个所述核苷酸序列含有F-质粒部分，所述方法包括通过在足够有利于同源重组至少两个核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述至少两个核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD和编码外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂的表达是可调制的。
另一方面，本发明提供了便于在BAC和线性核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组BAC和线性核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述BAC和所述线性核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD和编码外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂的表达是可调制的。
另一方面，本发明提供了便于在宿主细胞中同源重组至少两个核苷酸序列的方法，所述方法包括步骤(i)转化宿主细胞，其中被转化的宿主细胞含有第一个核苷酸序列和所述至少两个核苷酸序列，其中第一个核苷酸序列编码外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂或其功能衍生物，而外切核酸酶，重组蛋白质和编码recBCD抑制剂之基因的表达是可调制的；和(ii)在足以表达所述第一个核苷酸序列的条件下将所述经转化的宿主细胞培养一段时间，其中所述第一个核苷酸序列的表达产物便于同源重组所述第二个核苷酸序列与所述第三个核苷酸序列。
另一方面，本发明提供了产生微生物的方法，所述微生物便于同源重组至少两个核苷酸序列，所述方法包括对宿主细胞进行基因操作，使其能表达recBCD，可调制水平的外切核酸酶，重组蛋白质和编码recBCD抑制剂的基因和所述至少两个其它的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供了便于同源重组至少两个核苷酸序列的细胞，所述细胞含有编码外切核酸酶，重组蛋白质的核苷酸序列和编码recBCD抑制剂的基因，外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂的表达是可调制的，还含有编码recBCD的核苷酸序列和所述至少两个核苷酸序列。
另一方面，本发明提供了通过本发明方法同源重组的核酸分子。
另一方面，本发明提供了药物组合物，其含有通过本发明方法产生的经修饰的核酸分子，以及一种或多种药物可接受载体和/或稀释剂。
另一方面，本发明涉及便于在宿主细胞中同源重组至少两个核苷酸序列的试剂盒，所述试剂盒含有多个区室，其中适合包含任何一种或多种编码外切核酸酶，重组蛋白质，recBCD抑制剂或其功能衍生物的核苷酸序列，和便于同源重组所用的试剂。还可包括其它区室，例如用于接受生物样品，如任何一种或多种待重组的核苷酸序列，或已被一种或多种待重组的核苷酸序列稳定转化的宿主细胞。
另一方面，本发明涉及便于在宿主细胞中同源重组至少两个核苷酸序列的试剂盒，所述试剂盒含有多个区室，其中适合包含任何一种或多种外切核酸酶，重组蛋白质，recBCD抑制剂或其功能衍生物，和便于同源重组所用的试剂。还可包括其它区室，例如用于接受生物样品，如任何一种或多种待重组的核苷酸序列，或已被一种或多种待重组的核苷酸序列稳定转化的宿主细胞。
图2图示了pEBAC/148，该载体是通过将PAC克隆的185kb基因组片断插入pEBAC140载体的NotI位点而产生的，其中所述克隆携有完整的β-珠蛋白基因组区域。图中示出了通过同源重组将卡那霉素抗性基因靶向整合至此克隆的位置和靶向整合至原始pEBAC140载体的位置。
图3图示了显示出pGETrec质粒主要特征的图谱。将含有噬菌体λ的gam基因的PCR产物插入pBAD24-recET质粒45，产生pGETrec。因此，gam基因与recE和recT基因一起处于阿拉伯糖启动子的控制之下。
图4图示了所用的寡核苷酸引物。通过用引物kan50F和kan50R扩增pCYPAC2中的卡那霉素基因而产生PCRkan50(1262bp)。引物kan50F和kan50R还携有50-聚体靶向区域，该区域与载体靶向序列上唯一的Bst1107I位点的侧翼序列同源。将PCRkan50同源重组至pEBAC140载体之后，用引物KF和KR产生PCRkan140。在缺乏和存在卡那霉素基因时，用引物KF/KR得到的PCR产物的预期大小分别为288bp和1450bp。用引物KA/KB得到的相应PCR产物的预期大小分别为393bp和1555bp。
图5图示了“GET重组”法，该方法可用于通过同源重组将PCR片断整合至DH10B细胞内的BAC/PAC中。PCR引物各被设计成携有50-聚体区域，该区域与PAC或BAC中的靶向位点同源，所述引物的3’末端还含有特异性序列以扩增具有选择标记的DNA片断。也可包括其它序列或标记。将通过这些引物产生的PCR片断电穿孔至电感受态的DH10B细胞，所述细胞携有所需的BAC或PAC克隆和pGETrec质粒，在制备过程中用0.2％L-阿拉伯糖瞬时诱导所述细胞。PCR片断的同源区域和BAC或PAC克隆之间的重组可以整合PCR片断。通过分离微量DNA并电穿孔至DH10B细胞，或者通过在含抗生素的培养基上划线，从pGETrec中纯化经修饰的BAC或PAC克隆。
图6用照片显示了对20个携有pEBAC/148∷kan140的独立CmrKmr菌落所作的PCR分析。将1微升各个CmrKmr菌落的过夜培养物加至用PCR引物KF和KR进行的PCR反应中。使用1.5％(w/v)琼脂糖凝胶分辨PCR产物。泳道1和24，1-kb DNA梯标准；泳道2-21，20个独立的CmrKmr菌落；泳道22，亲代pEBAC/148克隆；泳道23，阴性对照(无细胞)。
图7用照片显示了在通过同源重组将PCRkan140整合至pEBAC/148之后，对4个随机挑选的CmrKmr菌落(A-D)所作的PFGE分析。将各个克隆的DNA重新电穿孔至DH10B细胞。使用双份次生菌落微量提取DNA，用NotI或XhoI进行限制性酶消化。
(a)NotI-消化M，低范围PFG标记；泳道1-8，双份pEBAC/148∷kan140克隆；P，亲代pEBAC/148克隆。PFGE条件6V/cm，转换时间为0.1-25.0秒，14℃，17小时。
(b)XhoI-消化M1，低范围PFG标记；泳道1-8，双份pEBAC/148∷kan140克隆；P，亲代pEBAC/148克隆；M2，中等范围IPEG标记。PFGE条件6V/cm，转换时间为0.1-8.0秒，14℃，18小时。
因此，本发明提供了便于在至少两个核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组至少两个核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述至少两个核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD和编码外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂的表达是可调制的。
术语“外切核酸酶”应被理解为指的是通过暴露双链核酸序列上的单链区域而便于同源重组的分子，所述区域是实现此区域和另一个核酸序列的互补区域之间的重组所必需的。外切核酸酶适于与选定的重组蛋白质一起使用。
适用于本发明的外切核酸酶的例子包括但不限于被称为exo的Redλ重组系统外切核酸酶，和被称为recE的recE/recT重组系统分子外切核酸酶，或其功能衍生物。优选所述外切核酸酶是recE或其功能衍生物。术语“重组蛋白质”应被理解为指的是通过介导一个核酸序列的单链区域(如通过外切核酸酶产生的单链区域)和另一个核酸序列的互补区域之间的重组而便于同源重组的肽，多肽或蛋白质。重组蛋白质的例子包括但不限于Redλ重组蛋白质bct和recE/recT重组蛋白质recT或其功能衍生物。本文将编码recE和recT的核苷酸序列分别称为recE和recT。
因此，本发明更特别地提供了便于在至少两个核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组至少两个核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述至少两个核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD，recE，recT和编码recBCD抑制剂或其功能衍生物的核苷酸序列，recE，recT和编码recBCD抑制剂的核苷酸序列的表达是可调制的。
术语“表达”指的是转录和翻译核苷酸序列，导致肽，多肽或蛋白质的合成。
术语“编码recBCD抑制剂的基因”应被理解为指的是一种核苷酸序列，其编码的表达产物能抑制或充分下调recBCD核酶的活性，从而使线性DNA序列不会被此核酶降解，其同源重组得以发生。适用于本发明的recBCD抑制剂的例子包括但不限于gam，P22Aba蛋白质或SSB蛋白质或其功能衍生物。优选所述recBCD抑制剂是gam。本文将编码gam的核苷酸序列称为gam。
根据此优选实施方案，本发明提供了便于在至少两个核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组至少两个核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述至少两个核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD，recE，recT和gam或其功能衍生物，recE，recT和gam的表达是可调制的。
术语“宿主细胞”应被理解为指的是可被核苷酸序列转化或转染的任何原核或真核细胞。例如，本文希望的是适用于克隆和/或表达核苷酸序列的宿主细胞，例如可用于产生gDNA或cDNA文库的宿主细胞，或者可用于克隆含有所需DNA序列插入物的载体的宿主细胞。根据本发明，宿主细胞优选为表达recBCD核酶(也称之为“外切核酸酶V”)的细胞，所述核酶可特别地降解线性双链DNA。宿主细胞可以因表达天然recBCD基因，或因用编码recBCD的核酸分子转化或转染宿主细胞而表达recBCD。
无需将本发明限制于任何一种理论或作用模式，本发明人已测定某些宿主细胞菌株对过量产生(如组成型产生)recBCD抑制剂和/或一种或多种同源重组系统分子敏感。“敏感”指的是宿主细胞以某种方式受损，例如降低其存活力或不合乎需要地调制其一个或多个功能活性。例如，已发现在DH10B宿主细胞中组成型产生recBCD抑制剂gam会产生毒性，即DH10B细胞的存活力降低。能调制和协同其中的重组系统分子和recBCD抑制剂表达的体内重组系统的开发克服了此毒性问题。因此，在优选实施方案中，宿主细胞是对组成型产生一种或多种recBCD抑制剂，外切核酸酶或重组蛋白质敏感的宿主细胞。更优选所述宿主细胞是DH10B或其突变体或其同系物。
本发明延及使用宿主细胞突变体和同系物。
根据此最优选的实施方案，本发明提供了便于在至少两个核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组至少两个核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述至少两个核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD和编码外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂的表达是可调制的。
更优选所述外切核酸酶是recE，所述重组蛋白质是recT，所述recBCD抑制剂是gam。
术语“至少两个核苷酸序列”应被理解为指的是欲通过本发明的方法进行同源重组的任何两个或多个核苷酸序列。所述核苷酸序列可以是独立的核酸分子，如两个环形载体(如两个质粒)，质粒和线性DNA序列或染色体和线性DNA序列。或者，核苷酸序列可以是单个核酸分子的两个部分，例如在滚环复制过程中产生的单个核苷酸分子的线性和环形核苷酸序列部分。优选核苷酸序列是环形核苷酸序列和线性核苷酸序列。在此上下文中，“环形”核苷酸序列应被理解为指的是任何核苷酸分子的环形核苷酸序列部分。例如，环形核苷酸序列可以是完全环形，例如质粒，或者也可以是部分环形，例如在滚环复制过程中产生的核苷酸分子的环形部分。在此上下文中，“环形”核苷酸序列相当于该分子的环形部分。优选环形核酸序列是BAC或PAC型人工染色体。“线性”核苷酸序列应被理解为指的是基本上为线形的任何核苷酸序列。线性序列可以是线性核苷酸分子，或者是也含有非-线性部分(如环形部分)的核苷酸分子的线性部分。线性核苷酸序列的例子包括但不限于PCR产物，切割产物，合成的DNA或在滚环复制过程中产生的核苷酸分子的线性部分。线性核苷酸序列和环形核苷酸序列的重组可以在环形核苷酸序列中导入例如选择标记或特定的突变。应理解本发明的同源重组可以在被导入细胞中的核苷酸序列之间发生，也可以在天然存在于细胞中的核苷酸序列与一个或多个导入的核苷酸序列之间发生。
因此，本发明提供了便于在环形核苷酸序列和线性核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组环形核苷酸序列和线性核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述环形核苷酸序列和所述线性核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD和编码外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂的表达是可调制的。
优选所述宿主细胞是DH10B细胞。更优选所述外切核酸酶是recE，所述重组蛋白质是recT，所述recBCD抑制剂是gam或其功能衍生物。
根据此优选实施方案，本发明提供了便于在环形核苷酸序列和线性核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组环形核苷酸序列和线性核苷酸序列的条件下培养DH10B细胞或其同系物或其突变体，以在DH10B细胞或其同系物或其突变体中诱导所述环形核苷酸序列和所述线性核苷酸序列之间的重组，其中所述DH10B细胞或其同系物或其突变体能表达recBCD，recE，recT和gam或其功能衍生物，recE，recT和gam的表达是可调制的。
本发明的核酸序列优选得自人类基因组，但本发明中也包括非人动物和植物的基因组和核苷酸序列。本发明中包括的非人动物包括灵长类动物，家畜(如绵羊，奶牛，猪，山羊，马，驴)，实验室试验动物(如小鼠，大鼠，豚鼠，仓鼠，兔)，宠物(如狗，猫)，鸟类(如鸡，鹅，鸭和其它家禽，可捕猎的鸟，鸸鹋，鸵鸟)和看养的野生或驯化动物(如狐狸，大袋鼠，澳州野狗)。
本发明人已测定本发明的同源重组系统适于重组至少两个核苷酸序列，其中至少一个所述核苷酸序列含有F-质粒部分。“含有”F-质粒部分的核苷酸序列应被理解为指的是与全部或部分F-质粒融合，结合或要不然相连接的核苷酸序列。例如，所需核苷酸序列可位于载体内，所述载体的骨架含有对应于全部或部分F-质粒的序列。例如，基于F-质粒的BAC含有所需基因组序列，该序列位于表达野生型F-质粒复制起点和编码parA，parB和parC的核苷酸序列的载体中。
因此，在另一个优选实施方案中，本发明提供了便于在至少两个核苷酸序列之间进行同源重组的方法，其中至少一个所述核苷酸序列含有F-质粒部分，所述方法包括通过在足够有利于同源重组至少两个核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述至少两个核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD和编码外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂的表达是可调制的。
优选含有F-质粒部分的所述核苷酸序列是BAC。
更优选所述宿主细胞是DH10B或其突变体或其同系物。
BAC/PAC克隆系统便于经由大基因组片断的基因转移来研究哺乳动物基因组，所述片断显示出正确的时间和组织-特异性基因表达。因此，大-插入物BAC/PAC克隆系统已被广泛用于长-范围的物理图谱绘制，疾病基因的定位克隆，整个基因组测序计划和功能研究。因此，已产生了人基因组DNA以及其它动物和植物(包括狒狒，犬，牛，绵羊，山羊和水稻)基因组DNA的BAC/PAC大肠杆菌文库。在已被详尽-定义的重组-缺损的大肠杆菌菌株DH10B中，每个细胞内一般可维持1-2拷贝的BAC/PAC。由于人们对通过导入线性DNA区段来修饰BAC和PAC很感兴趣，因此，本发明特别优选的实施方案涉及经由将线性DNA区段同源重组至BAC或PAC来修饰BAC或PAC。
根据此最优选的实施方案，本发明提供了便于在BAC和线性核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组BAC和线性核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述BAC和所述线性核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD和编码外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂的表达是可调制的。
优选所述宿主细胞是DH10B细胞或其突变体或其同系物。更优选所述外切核酸酶是recE，所述重组蛋白质是recT，所述recBCD抑制剂是gam。
在另一个最优选的实施方案中，本发明提供了便于在PAC和线性核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组PAC和线性核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述PAC和所述线性核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD和编码外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂的表达是可调制的。
优选所述宿主细胞是DH10B细胞或其突变体或其同系物。更优选所述外切核酸酶是recE，所述重组蛋白质是recT，所述recBCD抑制剂是gam。
本发明的方法包括用任何一种或多种recBCD，编码外切核酸酶和重组蛋白质的核苷酸序列，编码recBCD抑制剂的核苷酸序列和至少两个核苷酸序列转化本发明的宿主细胞。至于需要将多少上述分子导入宿主细胞以便于操作本发明的方法，这取决于所涉及的特定用途。例如，关于例举的recE/recT重组系统，需要使用得自商购BAC或PACDH10B文库的宿主细胞群体。通过将BAC或PAC分子与线性核苷酸序列重组，可以修饰BAC或PAC分子，所述核苷酸序列是用编码recE，recT和gam的核酸分子转化之后而导入商购DH10B文库克隆的。DH10B细胞内源性表达recBCD。或者，当使用已经表达recBCD，recE，recT和编码recBCD抑制剂的核苷酸序列的宿主细胞时，仅需要用待同源重组的核苷酸序列和宿主细胞中不存在的核苷酸序列转化宿主细胞。这些宿主细胞可表达recBCD，recE，recT和编码recBCD抑制剂的核苷酸序列，其原因是细胞经改造后能表达任何一种或多种这些分子，或者细胞能内源性表达这些分子。
根据本发明的方法，外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂的表达是可调制的。这样就可以瞬时和协同表达这些蛋白质。“可调制的”指的是编码这些蛋白质的基因的表达可以在转录或翻译水平上被上调或下调。通过多种技术中的任何一种可以实现调制，所述技术包括但不限于调节启动子表达或调节甲基化。例如，如本文所例举，用可诱导的表达质粒pGETrec转染被BAC核酸分子转化的DH10B细胞，pGETrec含有处于可诱导的L-阿拉伯糖启动子控制之下的，编码recE，recT和gam的核酸分子。通过在L-阿拉伯糖的存在下培养这些细胞，可以诱导pGETrec质粒的表达。随后，将双链线性DNA(如PCRkan140)电穿孔至这些细胞，导致PCRkan140和pEBAC140的同源重组，之所以能发生同源重组是因为运行了recE/recT同源重组系统，同时还通过gam表达产物抑制了recBCD核酶活性。一旦完成了同源重组，可从富含L-阿拉伯糖的培养基中提取受试的DH10B细胞，籍此下调pGETrec质粒的表达。这样就可以关闭recE/recT同源重组途径的活性。
尽管本发明所举的例子是将单个质粒导入宿主细胞，所述质粒含有处于可诱导的启动子控制之下的核酸序列recE，recT和gam(即编码recE，recT和gam的核酸分子与共有的启动子可操作相连)，但应理解本发明的方法可以延伸为使用两个或多个独立含有recE，recT和gam的载体。然而，为了协同地同时表达recE，recT和gam，需要通过例如，利用对recE，recT和gam中的每一个而言都相同的诱导型启动子，来确保同时诱导recE，recT和gam的表达。因此，recE/recT同源重组系统具有功能活性，同时recBCD核酶活性受到gam的抑制。
术语“便于”同源重组应被理解为指的是诱导，增强或要不然作用于同源重组系统的功能操作。例如，recE和recT表达产物诱导基于recE/recT的重组，而gam表达产物抑制recBCD核酶活性，所述核酶能降解线性DNA，从而防止其重组。
无需将本发明限制于任何一种理论或作用模式，pGETrec可以在大肠杆菌DH10B细胞中与BAC/PAC稳定共存。利用pGETrec，可以在线性核酸片段和靶环形核酸分子之间进行高效同源重组。当同源长度由50bp增长为140bp时，同源重组的效力得以改善。另外，据认为通过使用靶同源区域中的非-邻接序列可以使与BAC/PAC同源重组的效力显著增加。
本发明应被理解为可以延伸至通过将便于同源重组的蛋白质或其功能衍生物导入宿主细胞，而不是将诱导表达这些蛋白质的核酸分子导入宿主细胞，而在体内诱导同源重组。例如，设想将recE，recT和gam蛋白或其功能衍生物与身为重组主体的核苷酸序列一起协同导入宿主细胞。还设想了实施本发明的方法，其中在宿主细胞中表达一些同源重组系统蛋白质，而将其余的以蛋白质的形式导入细胞。例如，设想在宿主细胞内表达recE和recT或其功能衍生物，并且同时协同导入gam蛋白。本发明的此方面应被理解为延伸至传递任何一种或多种外切核酸酶，重组蛋白质或recBCD抑制剂或其功能衍生物。
“衍生物”包括天然，合成或重组来源的片段，部分，化学等同物，突变体，同系物，类似物，模拟物，包括融合蛋白。可以由氨基酸插入，缺失或取代得到衍生物。氨基酸插入衍生物包括氨基和/或羧基末端融合物，以及序列内插入单个或多个氨基酸。插入氨基酸序列变体是在蛋白质的预定位点导入一个或多个氨基酸残基而获得的，但随机插入一个或多个氨基酸残基，并且适当筛选所得产物也是可以的。缺失变体的特征在于从序列中除去了一个或多个氨基酸。取代氨基酸变体是除去序列中的至少一个残基，并在该位置插入不同残基而获得的。氨基酸序列的添加包括与其它肽，多肽或蛋白质融合。
所述核苷酸序列和表达产物(被称为“组分”)的衍生物包括具有特定表位的片段，或与肽，多肽或其它蛋白质或非-蛋白质分子融合的完整组分的部分。例如，所述组分或其衍生物可以与便于其进入细胞的分子融合。本文期望所述组分的类似物包括但不限于对侧链的修饰，在合成肽，多肽或蛋白质的过程中掺入非天然氨基酸和/或其衍生物，使用交联剂和其它对蛋白质分子或其类似物施加构象限制的方法。类似地，核酸序列的衍生物可得自单个或多个核苷酸取代，缺失和/或添加，包括与其它核酸分子融合。本发明的核酸分子的衍生物包括寡核苷酸，PCR引物，反义分子，适用于共抑制和融合核酸分子的分子。
本发明所期望的侧链修饰的例子包括通过例如与醛反应，接着用NaBH4还原以进行还原烷基化来修饰氨基；用甲基乙酰亚胺(methylacetimidate)脒化；用乙酸酐酰化；用氰酸盐甲氨酰化氨基；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)使氨基三硝基苯化；用琥珀酸酐和四氢化邻苯二甲酸酐使氨基酰化；和用吡哆醛-5-磷酸吡哆醛化赖氨酸，接着用NaBH4还原。
可通过与诸如2，3-丁二酮，苯基乙二醛和乙二醛的试剂形成杂环缩合物来修饰精氨酸残基的胍基。
经过形成O-酰基异脲激活碳二亚胺，接着衍生化为例如相应的酰胺即可修饰羧基。
通过下列方法可修饰sulphydryl基团，所述方法如用碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化；将过甲酸氧化为磺基丙氨酸；与其它硫醇类化合物形成混合disulphide；与马来酰亚胺，马来酐或其它取代的马来酰亚胺反应；使用4-氯汞苯甲酸，4-氯汞苯磺酸，苯基氯化汞，2-氯汞-4-硝基苯酚和其它汞化合物形成汞化合物的衍生物；在碱性pH下用用氰酸盐甲氨酰化。
通过例如用N-溴琥珀酰亚胺氧化或用2-羟基-5-硝基苄基溴或sulphenyl卤化物烷基化吲哚环即可修饰色氨酸残基。另一方面，可通过用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物来改变酪氨酸残基。
通过用碘乙酸衍生物烷基化或用二乙基焦碳酸N-碳乙氧化即可修饰组氨酸残基的咪唑环。
在合成蛋白质的过程中掺入的非天然氨基酸和衍生物的例子包括但不限于使用正亮氨酸，4-氨基丁酸，4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸，6-氨基己酸，t-丁基甘氨酸，正缬氨酸，苯基甘氨酸，鸟氨酸，肌氨酸，4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸，2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。表1示出了本文所希望的非天然氨基酸。表1非常规氨基酸 代码 非常规氨基酸 代码α-氨基丁酸Abu L-N-甲基丙氨酸Nmalaα-氨基-α-甲基Mgabu L-N-甲基精氨酸Nmarg丁酸氨基环丙烷甲 Cpro L-N-甲基精氨酸Nmasn酸L-N-甲基天冬氨酸 Nmasp氨基异丁酸 Aib L-N-甲基半胱氨酸 Nmcys氨基正冰片基 Norb L-N-甲基谷氨酰胺 Nmgln羧酸L-N-甲基谷氨酸Nmglu环己基丙氨酸 Chexa L-N-甲基组氨酸Nmhis环戊基丙氨酸 Cpen L-N-甲基异亮氨酸 NmileD-丙氨酸 Dal L-N-甲基亮氨酸NmleuD-精氨酸 Darg L-N-甲基赖氨酸NmlysD-天冬氨酸 Dasp L-N-甲基甲硫氨酸 NmmetD-半胱氨酸 Dcys L-N-甲基正亮氨酸 NmnleD-谷氨酰胺 Dgln L-N-甲基正缬氨酸 NmnvaD-谷氨酸 Dglu L-N-甲基鸟氨酸NmornD-组氨酸 Dhis L-N-甲基苯丙氨酸 NmpheD-异亮氨酸 Dile L-N-甲基脯氨酸NmproD-亮氨酸 Dleu L-N-甲基丝氨酸NmserD-赖氨酸 Dlys L-N-甲基苏氨酸NmthrD-甲硫氨酸 Dmet L-N-甲基色氨酸NmtrpD-鸟氨酸 Dorn L-N-甲基酪氨酸NmtyrD-苯丙氨酸 Dphe L-N-甲基缬氨酸NmvalD-脯氨酸 Dpro L-N-甲基乙基甘氨 Nmetg
酸D-丝氨酸 Dser L-N-甲基-t-丁基 Nmtbug甘氨酸D-苏氨酸 Dthr L-正亮氨酸NleD-色氨酸 Dtrp L-正缬氨酸NvaD-酪氨酸 Dtyr α-甲基-氨基异丁 Maib酸D-缬氨酸 Dval α-甲基-γ-氨基丁 Mgabu酸D-α-甲基丙氨 Dmalaα-甲基环己基丙氨 Mchexa酸 酸D-α-甲基精氨 Dmargα-甲基环戊基丙氨 Mcpen酸 酸D-α-甲基天冬 Dmasnα-甲基-α-萘基丙 Manap酰胺 氨酸D-α-甲基天冬 Dmaspα-甲基青霉胺 Mpen氨酸D-α-甲基半胱 DmcysN-(4-氨基丁基)甘Nglu氨酸 氨酸D-α-甲基谷氨 DmglnN-(2-氨基乙基)甘Naeg酰胺 氨酸D-α-甲基组氨 DmhisN-(3-氨基丙基)甘 Norn酸 氨酸D-α-甲基异亮 DmileN-氨基-α-甲基丁 Nmaabu氨酸酸D-α-甲基亮氨 Dmleuα-萘基丙氨酸 Anap酸D-α-甲基赖氨Dmlys N-苄基甘氨酸 Nphe酸D-α-甲基甲硫DmmetN-(2-氨甲酰基乙 Ngln氨酸 基)甘氨酸D-α-甲基鸟氨DmornN-(氨甲酰基甲基) Nasn酸甘氨酸D-α-甲基苯丙DmpheN-(2-羧乙基)甘氨 Nglu氨酸 酸D-α-甲基脯氨DmproN-(羧甲基)甘氨酸 Nasp酸D-α-甲基丝氨DmserN-环丁基甘氨酸 Ncbut酸D-α-甲基苏氨DmthrN-环庚基甘氨酸 Nchep酸D-α-甲基色氨DmtrpN-环己基甘氨酸 Nchex酸D-α-甲基酪氨Dmty N-环癸基甘氨酸 Ncdec酸D-α-甲基缬氨DmvalN-环十二烷基甘氨 Ncdod酸酸D-N-甲基丙氨 DnmalaN-环辛基甘氨酸 Ncoct酸D-N-甲基精氨 DnmargN-环丙基甘氨酸 Ncpro酸D-N-甲基天冬 DnmasnN-环十一烷基甘氨Ncund酰胺 酸D-N-甲基天冬 DnmaspN-(2，2-二苯基乙Nbhm氨酸 基)甘氨酸D-N-甲基半胱 DnmcysN-(3，3-二苯基丙Nbhe氨酸 基)甘氨酸D-N-甲基谷氨 DnmglnN-(3-胍基丙基)甘Narg酰胺 氨酸D-N-甲基谷氨DnmgluN-(1-羟基乙基)甘 Nthr酸氨酸D-N-甲基组氨DnmhisN-(羟基乙基)甘氨 Nser酸酸D-N-甲基异亮DnmileN-(咪唑基乙基)甘 Nhis氨酸 氨酸D-N-甲基亮氨DnmleuN-(3-吲哚基乙基) Nhtrp酸甘氨酸D-N-甲基赖氨DnmlysN-甲基-γ-氨基丁 Nmgabu酸酸N-甲基环己基Nmchexa D-N-甲基甲硫氨酸 Dnmmet丙氨酸D-N-甲基鸟氨DnmornN-甲基环戊基甘氨 Nmcpen酸酸N-甲基甘氨酸Nala D-N-甲基苯丙氨酸 DnmpheN-甲基氨基异Nmaib D-N-甲基脯氨酸Dnmpro丁酸N-(1-甲基丙 Nile D-N-甲基丝氨酸 Dnmser基)甘氨酸N-(2-甲基丙 Nleu D-N-甲基苏氨酸 Dnmthr基)甘氨酸D-N-甲基色氨DnmtrpN-(1-甲基乙基)甘 Nval酸氨酸D-N-甲基酪氨DnmtyrN-甲基-萘基甘氨 Nmanap酸酸D-N-甲基缬氨DnmvalN-甲基青霉胺 Nmpen酸γ-氨基丁酸 GabuN-(p-羟基苯基)甘Nhtyr氨酸L-t-丁基甘氨 Tbug N-(硫代甲基)甘氨 Ncys酸 酸L-乙基甘氨酸 Etg青霉胺PenL-同苯丙氨酸 Hphe L-α-甲基丙氨酸 MalaL-α-甲基精氨Marg L-α-甲基天冬酰胺 Masn酸L-α-甲基天冬Masp L-α-甲基-t-丁基 Mtbug氨酸甘氨酸L-α-甲基半胱Mcys L-甲基乙基甘氨酸 Metg氨酸L-α-甲基谷氨Mgln L-α-甲基谷氨酸 Mglu酰胺L-α-甲基组氨Mhis L-α-甲基同苯丙氨 Mhphe酸 酸L-α-甲基异亮Mile N-(2-甲基硫代 Nmet氨酸基)甘氨酸L-α-甲基亮氨Mleu L-α-甲基赖氨酸 Mlys酸L-α-甲基甲硫Mmet L-α-甲基正亮氨酸 Mnle氨酸L-α-甲基正缬Mnva L-α-甲基鸟氨酸 Morn氨酸L-α-甲基苯丙Mphe L-α-甲基脯氨酸 Mpro氨酸L-α-甲基丝氨Mser L-α-甲基苏氨酸 Mthr酸L-α-甲基色氨Mtrp L-α-甲基酪氨酸 Mtyr酸L-α-甲基缬氨Mval L-N-甲基同苯丙氨 Nmhphe酸酸N-(N-(2，2-二NnbhmN-(N-(3，3-二苯基Nnbhe苯基乙基)氨甲 丙基)氨甲酰基甲酰基甲基)甘氨 基)甘氨酸酸1-羧基-1-Nmbc(2，2-二苯基乙基氨基)环丙烷可以使用交联剂来稳定化3D构象，例如可使用同-双功能交联剂，如具有(CH2)n(n＝1至n＝6)间隔基的双功能亚氨酸酯，戊二醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯和异-双功能试剂，所述试剂通常含有氨基-反应性组成成分，如N-羟基琥珀酰亚胺和另一个基团特异性-反应性组成成分，如马来酰亚胺或二硫代组成成分(SH)或碳二亚胺(COOH)。另外，可以通过以下方法限制肽的构象，例如掺入Cα和Nα-甲基氨基酸，在氨基酸的Cα和Cβ原子之间导入双键，通过导入共价键，例如在N和C末端之间，两个侧链之间或侧链和N或C末端之间形成酰胺键，而形成环形肽或类似物。
本发明的方法可用作简单而有效的技术，在诸如BAC或PAC的环形DNA克隆的任何位置处导入任何所需的修饰，而不会引起不必要的重排。例如，可使用该方法进行修饰，如导入选择标记或能导致人病理学的特定突变。本发明的方法使得将克隆的环形DNA分子(如BAC/PAC)转移至其它大肠杆菌菌株以进行同源重组的需要减少。同时也减少了产生特定穿梭载体的需要。该方法足够简单，使得可以对任何单个克隆重复使用该方法以形成复杂的变化。可以对该方法进行修饰以将报道基因或任何其它所需序列包括在环形核酸分子中。
产生特异性突变的准确细胞和动物模型必需最小程度地干扰正常的基因结构。可以使用本发明的重组方法，以两-步法导入对基因结构进行改变的特异性突变。首先，在靶位点导入携有四环素的PCR产物，或导入含有与第二个反-选择标记(如ccdB，sacB)相连接的抗生素选择标记的盒，随后，在第二步中，用仅携有所需修饰的基因组片断精确敲除第一步的导入物。通过反选择已失去四环素基因或第二个选择标记的克隆，可以容易地获得正确的产物33，39，43。根据环形DNA分子中整合的靶位点，这些方法可以使很敏感的检测系统能监测多种序列元件和突变对基因转录，剪接和由完整功能性基因座表达的组织和发育特异性的影响。这些技术便于开发目的在于以增加的组织和基因座特异性改变基因表达的药学方法，以及将人类人工染色体开发成为缓解或治愈多种人类遗传疾病的工具。产生具有正常和突变功能性基因座的精确动物模型也有利于基因治疗方法，所述基因治疗方法包括基因补加或校正突变基因座。
本发明的另一方面提供了便于在宿主细胞中同源重组至少两个核苷酸序列的方法，所述方法包括步骤(i)转化宿主细胞，其中被转化的宿主细胞含有第一个核苷酸序列和所述至少两个核苷酸序列，其中第一个核苷酸序列编码外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂或其功能衍生物，而外切核酸酶，重组蛋白质和编码recBCD抑制剂之基因的表达是可调制的；和(ii)在足以表达所述第一个核苷酸序列的条件下将所述经转化的宿主细胞培养一段时间，其中所述第一个核苷酸序列的表达产物便于同源重组所述第二个核苷酸序列与所述第三个核苷酸序列。
优选所述外切核酸酶是recE，所述重组蛋白质是recT，所述编码recBCD抑制剂的基因是gam。
更优选所述至少两个核苷酸序列是含有F-质粒部分的核苷酸序列和线性核苷酸序列。更优选所述含有F-质粒部分的核苷酸序列是BAC。
最优选所述宿主细胞是DH10B或其突变体或其同系物。
另一方面，本发明提供了产生微生物的方法，所述微生物便于同源重组至少两个核苷酸序列，所述方法包括对宿主细胞进行基因操作，使其能表达recBCD，可调制水平的外切核酸酶，重组蛋白质和编码recBCD抑制剂的基因和所述至少两个其它的核苷酸序列。
优选所述外切核酸酶是recE，所述重组蛋白质是recT，所述编码recBCD抑制剂的基因是gam。
更优选所述至少两个核苷酸序列是含有F-质粒部分的核苷酸序列和线性核苷酸序列。更优选所述含有F-质粒部分的环形核苷酸序列是BAC。
更优选所述宿主细胞是DH10B或其突变体或其同系物。
另一方面，本发明提供了便于同源重组至少两个核苷酸序列的细胞，所述细胞含有编码外切核酸酶，重组蛋白质的核苷酸序列和编码recBCD抑制剂的基因，其中外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂的表达是可调制的，所述细胞还含有编码recBCD的核苷酸序列和所述至少两个核苷酸序列。
优选所述外切核酸酶是recE，所述重组蛋白质是recT，所述编码recBCD抑制剂的基因是gam。
更优选所述至少两个核苷酸序列是含有F-质粒部分的核苷酸序列和线性核苷酸序列。更优选所述含有F-质粒部分的核苷酸序列是BAC。
更优选所述宿主细胞是DH10B或其突变体或其同系物。
另一方面，本发明提供了通过本发明方法同源重组的核酸分子。
优选所述经修饰的核酸分子是经修饰的BAC或经修饰的PAC。
本发明还延伸至所述经修饰的核酸分子用于治疗和/或诊断患者的用途。治疗方法包括基因治疗方案。本发明还延伸至必需所述经修饰的核酸分子的筛选方法。
因此，另一方面，本发明提供了药物组合物，其含有通过本发明方法产生的经修饰的核酸分子，以及一种或多种药物可接受载体和/或稀释剂。
在最优选的实施方案中，提供了表达载体，其含有基本上如图3所示的基因构建体或其功能衍生物。
另一方面，本发明涉及便于在宿主细胞中同源重组至少两个核苷酸序列的试剂盒，所述试剂盒含有多个区室，其中适合包含任何一种或多种编码外切核酸酶，重组蛋白质，recBCD抑制剂或其功能衍生物的核苷酸序列，和便于同源重组所用的试剂。还可包括其它区室，例如用于接受生物样品，如任何一种或多种待重组的核苷酸序列，或已被一种或多种待重组的核苷酸序列稳定转化的宿主细胞。
另一方面，本发明涉及便于在宿主细胞中同源重组至少两个核苷酸序列的试剂盒，所述试剂盒含有多个区室，其中适合包含任何一种或多种外切核酸酶，重组蛋白质，recBCD抑制剂或其功能衍生物，和便于同源重组所用的试剂。还可包括其它区室，例如用于接受生物样品，如任何一种或多种待重组的核苷酸序列，或已被一种或多种待重组的核苷酸序列稳定转化的宿主细胞。
根据本发明此方面的试剂盒应被理解为延伸至含有编码一种或多种重组系统蛋白质的核苷酸序列组合或重组系统蛋白质自身组合的试剂盒。
在下列非-限制性的图和/或实施例中更完整地描述了本发明的其它特征。然而，应理解包括这种详细的描述仅是为了举例说明本发明。
将pBAD24-recET质粒电穿孔至DH10B(pEBAC140)细胞，所述质粒携有处于诱导型阿拉伯糖启动子控制之下的recE和recT基因，在氨苄青霉素和氯霉素培养基上选择携有两种质粒的克隆。使用携有两种质粒的单个菌落DH10B(pBAD24-recET，pEBAC140)在培养细胞的过程中用L-阿拉伯糖诱导来制备电感受态细胞。将PCRkan50电穿孔至这些细胞之后仍未得到CmrKmr重组克隆。
将携有gam基因的PCR片段插入pBAD24-recET质粒，产生质粒pGETrec(图3)。将gam基因置于与recE和recT基因相同的L-阿拉伯糖-诱导型启动子的控制之下，以协同诱导recE途径和抑制正在产生的线性dsDNA上的recBCD核酶活性。将可诱导的表达质粒pGETrec导入已携有pEBAC140的电感受态DH10B细胞。除了在开始接种细胞时在生长培养基中加入L-阿拉伯糖以外，用标准方法制备携有两种质粒的电感受态细胞DH10B(pGETrec，pEBAC140)。将PCRkan140电穿孔至这些细胞，从两次独立的电穿孔中，各得到将近300个重组子(表1，实验1，2)。用XhoI或HindIII进行限制性酶消化，对12个随机挑选的重组子进行PCR分析，结果表明每一个CmrKmr重组子都已将PCRkan140同源重组至pEBAC140上的正确靶位点，而没有任何不必要重排的迹象。对侧翼于卡那霉素基因的同源区域进行的DNA测序证实了这一点。尽管在氯霉素/卡那霉素培养基上培养这些重组子的过程中，没有对pGETrec质粒进行选择，但在不同的克隆中，可变量的此多拷贝质粒与单个拷贝的pEBAC140∷kan140质粒共存。
通过对过夜培养基直接进行PCR来分析20个独立的CmrKmr菌落。设计引物140KA和140KB以由pEBAC/148∷kan140产生1555bp产物。所分析的所有20个CmrKmr菌落都产生了预期的PCR产物(图6)。将亲代pEBAC/148克隆用作对照。对照PCR由pEBAC/148产生预期的393bp片段。重组克隆无一产生此片段，如果PCRkan140的整合发生在细菌染色体的任何其它位置，应该也能检测到此片段。因此，PCR分析表明重组事件精确发生在20个独立克隆的每一个中。
从6个这些CmrKmr菌落中分离DNA。同时回收大的和可变量的多拷贝pGETrec质粒以及单拷贝的pEBAC/148∷kan140 BAC，BAC的限制性消化妨碍了该过程。将得自4个克隆的1微升DNA重新-电穿孔至DH10B细胞，导致每个克隆产生很多独立的次生CmrKmr菌落。从每个原始克隆的2个独立次生克隆中分离DNA，用NotI或XhoI消化之后通过脉冲场凝胶电泳进行分析(图7)。所有8个次生克隆仅含有大BAC，这表明在这些克隆中，卡那霉素抗性标记已是pEBAC/148的整合部分。NotI消化(图7a)显示出所有8个次生克隆释放出预期的185kb β-珠蛋白插入物，不会产生任何显著的重排。相对于亲代克隆pEBAC/148经NotI-消化的载体带而言，所有8个克隆经NotI-消化的载体带的大小也有微弱但明显的增加，相当于PCRkan140整合至其靶位点之后，载体带大小的预期改变。用XhoI限制性消化之后，进一步分析这8个克隆(图7b)。除了仅在亲代pEBAC/148克隆中观察到的约70kb片段外，所有克隆都显示出与对照亲代pEBAC/148克隆相同的限制性片段。在8个次生克隆中，70kb的片段似乎被切割成分别为30和40kb的两个片段。40kb的片段与另一个存在于亲代pEBAC/148克隆中的，长度约为40kb的片段共-迁移，因此，相对于亲代pEBAC/148克隆所产生的40kb带来说，CmrKmr克隆在此位置产生了显著更强的带。由于亲代载体的骨架上不含XhoI位点，70kb片段必须得自载体骨架并与珠蛋白序列相比邻。通过同源重组将PCRkan140整合至载体骨架之后，在卡那霉素基因中存在的单个XhoI位点处将70kb片段切割成两个较小的片段。
这些结果证实在所有4个原始CmrKmr克隆中，通过同源重组整合PCRkan140已正确发生在载体骨架上的靶位点。另外，显然，在此方法的过程中，无一克隆显示出任何不稳定性，这表明在DH10B细胞中，用pGETrec质粒瞬时诱导同源重组使得大小至少约为200kb的BAC克隆中的不必要重排的风险最小化。对通过同源重组整合所用的同源区域进行更详细的分析。在pEBAC/148∷kan140克隆和pEBAC140∷kan50克隆中，跨越侧翼于卡那霉素基因的同源区域进行测序，结果未揭示出任何不同于预期序列之处。
已证实掺入短至50bp的同源区域的PCR产物以良好的效率重组至JC8679或JC9604大肠杆菌菌株42，43。这使得可以通过合成70-80-聚体扩增任何所需片段，并通过电穿孔将所述片段直接导入靶位点，其中所述70-80-聚体携有50bp与靶位点(位于引物5’末端)同源的区域。通过将PCRkan50电穿孔至DH10B(pGETrec，pEBAC/148)细胞，在现行的系统中试验此方法，在制备过程中仅用L-阿拉伯糖诱导细胞40分钟。从每次电穿孔中得到超过100个CmrKmr菌落(表1，实验5，6)。使用引物140KF和140KR，直接通过PCR筛选20个独立的CmrKmr菌落的过夜培养物，产生正确的1450bp产物。
尽管相对于140-聚体靶位点而言，使用50-聚体靶位点的重组频率降低了约10倍，但通过同源重组整合的准确性没有改变。
尽管缺乏L-阿拉伯糖诱导时，在DH10B细胞中用pGETrec质粒未得到重组子，但延长L-阿拉伯糖诱导时间显然对细胞有毒。在制备电感受态细胞的过程中，和在电穿孔之后回收的过程中诱导4小时以上似乎大大降低了细胞的存活力，并且不会产生任何重组子。另一方面，将PCRkan50电穿孔至仅用L-阿拉伯糖诱导了10分钟的DH10B(pGETrec，pEBAC/148)细胞所产生的CmrKmr菌落比诱导40分钟的细胞少10倍。尽管诱导40分钟高效产生了重组克隆，但可将参数的调制用作调制重组效力的工具。
本领域技术人员应理解本文所述的发明并不仅是具体描述的那样，可以对其进行改动和修饰。应理解本发明包括所有这种改动和修饰。本发明还包括本说明书中单独或集中所指或所述的所有步骤，特征，组合物和化合物，以及任何两个或多个所述步骤或特征的任何和所有组合。
文献目录1.Jaenisch R.转基因动物.科学1988；2401468-1474.2.Brinster RL等，内含子增加转基因小鼠的转录效力，Proc NatlAcad Sci USA 1988；85836-840.3.Lamb BT等，在转基因小鼠中导入并表达400kb的淀粉样前体蛋白基因[校正稿][公开的勘误出现在Nat Genet 1993 Nov；5(3)312].Nat Genet，1993；522-30.4.Porcu S等，在转基因小鼠中通过YAC转移导入的人β-珠蛋白基因座表现出特异性的和可再现的发育调节模式，血液，1997；904602-4609.5.Peterson KR等，在β-珠蛋白基因座酵母人工染色体转基因小鼠中缺失人β-珠蛋白基因座5’HS3或5’HS2控制区域对珠蛋白基因表达的发育调节的影响，Proc Natl Acad Sci USA 1996；936605-6609.6.Raguz S等，与人结蛋白基因相关的肌-特异性基因座控制区域的活性，发育生物学，1998；2012642.7.Choi T，Huang M，Gorman C和Jaenjsch R.一般的内含子增加转基因小鼠中的基因表达，分子细胞生物学，1991；113070-3074.8.Vassaux G，Manson AL和Huxley C.人上皮细胞系中YAC-克隆的人CFTR基因依赖于拷贝数的表达，基因治疗，1997；4618-623.9.Gaensler KM，Kitamura M和Kan YW，转基因小鼠中含有人β-珠蛋白基因座的150-kb酵母人工染色体的种系传递和发育调节，ProcNatl Acad Sci USA 1993；9011381-11385.10.Maas A等，通过由酵母人工染色体转基因表达人Bruton’s酪氨酸激酶来校正小鼠中的X-连锁免疫缺损缺陷，欧洲免疫学杂志，1997；272180-2187.11.Peterson KR等，含有248-kb人β基因座酵母人工染色体的转基因小鼠显示出对人珠蛋白基因的适当发育控制，Trans Assoc AmPhysicians 1993；106101-109.12.Peterson KR等，使用酵母人工染色体(YACs)研究哺乳动物的发育产生携有人珠蛋白发育突变体的β-珠蛋白基因座YAC小鼠，Proc Natl Acad Sci USA 1995；925655-5659.13.Mccormick SP等，在酵母人工染色体中诱变人载脂蛋白B基因揭示出载脂蛋白的结合位点，Proc Natl Acad Sci USA 1995；9210147-10151.14.Smith DJ和Rubin EM.功能筛选和复杂性状影响小鼠学习的人21q22.2序列，人类分子遗传学，1997；61729-1733.15.Pavan WJ，Hieter P和Reeves RH.修饰360-kb得自人的酵母人工染色体并将其转移至胚胎癌性细胞系，分子细胞生物学，1990；104163-4169.16.Frengen E，Wu C和de Jong PJ.将小YAC作为大的环形质粒转移至大肠杆菌，Genet Anal 1997；1455-59.17.Bradshaw MS，Bollekens JA和Ruddle FH.基于重组来克隆酵母人工染色体中大的DNA片断的新载体，核酸研究，1995；234850-4856.18.Green ED和0lson MV.囊性纤维化基因在酵母人工染色体中的染色体区域人基因组作图模型，科学，1990；25094-98.19.Green ED，Riethman HC，DutchikJE和Olson MV.检测和鉴定嵌合的酵母人工染色体克隆，基因组学，1991；11658-669.20.Larionov V，Kouprina N，Nikolaishyjlj N和Resnick MA.转化过程中的重组作为嵌合哺乳动物酵母人工染色体(YAC)的来源，核酸研究，1994；224154-4162.21.Peterson KR，Clegg CH，Li Q和Stamatoyannopoulos G.产生具有酵母人工染色体的转基因小鼠，Trends Genet 1997；1361-66.22.Larionov V等，通过转化-相关的重组特异性克隆人DNA作为酵母人工染色体，Proc Natl Acad Sci USA 1996；93491-496.23.Shizuya H等，在大肠杆菌中使用基于F-因子的载体克隆和稳定维持300千碱基对的人DNA片断，Proc Natl Acad Sci USA 1992；898794-8797.24.Ioannou PA等，新的用于增殖大的人DNA片断的噬菌体P1-衍生载体，Nat Genet 1994；684-89.25.Hubert RS等，覆盖位于染色体21的D21S55和MX1之间的3.5Mb Down综合征先天性心脏病区域的BAC和PAC重叠群，基因组学，1997；41；218-226.26.Ncchiporuk T等，SCA2区域高-分辨率的PAC和BAC图谱，基因组学，1997；44321-329.27.Wooster R等，鉴定乳腺癌易感基因BRCA2[见评论部分][公开的勘误出现于自然1996 Feb 22；379(6567)749]，自然，1995；373789-792.28.Marshall E和Pennisi E.自大和人基因组，科学，1998；280994-995.29.Venter JC等，人基因组的鸟枪测序，科学，1998；2301540-1542.30.Venter JC，Smith HO和Hood L.基因组测序的新策略，自然，1996；381364-366.31.Antoch MP等，通过转基因BAC获救对小鼠昼夜时钟基因进行功能鉴定，细胞，1997；89655-667.32.Hejna JA等，通过将人BAC电穿孔至哺乳动物成纤维细胞而进行功能补偿，核酸研究，1998；261124-1125.33.O’Connor M，Peifer M和Bender W.在大肠杆菌中构建大的DNA区段，科学，1989；2441307-1312.34.Stembetg N，P1克隆系统过去和将来，哺乳动物基因组，1994；5397-404.35.Boren J等，定点突变，缺失和融合大DNA，如P1和BAC克隆的简单而有效的方法，基因组研究，1996；61123-1130.36.Kim SY等，使用Cre重组酶修饰细菌人工染色体导入在真核细胞中表达所用的选择标记，基因组研究，1998；8404-412.37.Chatterjce PK和Coren JS.通过在体内P1包装由Cre-催化的内源性和转座的loxP位点之间的重组产物来分离细菌和P1人工染色体中的大的嵌套缺失，核酸研究，1997；252205-2212.38.Yang XW，Model P和Heintz N.大肠杆菌中基于同源重组的修饰和转基因小鼠中细菌人工染色体的种系传递，Nat Biotechnol1997；15859-865.39.Messerle M等，克隆和诱变作为感染性细菌人工染色体的疱疹病毒基因组，Proc Natl Acad Sci USA 1997；9414759-14763.40.1essen JR等，通过chi-刺激的同源重组修饰细菌人工染色体并将其用于对斑马鱼进行转基因，Proc Natl Acad Sci USA 1998；955121-5126.41.Murphy KC.在大肠杆菌中使用噬菌体λ重组功能以促进基因取代，细菌学杂志，1998；1802063-2071.42.Oliner JD，Kinzier KW和Vogeistein B.在大肠杆菌中体内克隆PCR产物，核酸研究，1993；215192-5197.43.Zhang Y，BuChholz F和Stewazt A.在大肠杆菌中使用重组简化DNA工程(1998).(已提交).44.Kawaguchi S和Kuramitsu S.同源连接新的克隆方法，Trends Genet 1994；10420.45.Kolodner R，Hall SD和Luisi-DeLuca C.由大肠杆菌recE和recT基因编码的同源配对蛋白质，分子微生物学，1994；1123-30.46.Kowalczykowski SC等，大肠杆菌中同源重组的生物化学，微生物评论，199458401-465.47.Noirot P和Kolodner RD.由大肠杆菌RecT蛋白促进的DNA链侵入，生物化学杂志，1998；27312274-12280.48.Sun TQ，Fernstermacher DA和Vos JM.用于克隆人细胞中的大DNA片断的人人工游离型染色体(公开的勘误出现在Nat Genet1994 Dec；8(4)410).Nat Genet 1994；833-41.49.Ioaanou P和Delong P基于经修饰的P1(PAC)系统构建细菌人工染色体文库，Dracopoli NC，Korf BR，Moir DT，Motton CC，Seidman CE，Seidman JG，Smith DR(编).最新人类遗传学方法，John Wiley and SonsNew York，1996，pp 5.15.11-15.15.24.50.Westphal EM等，将200-kb BAC/PAC克隆穿梭至人细胞的系统稳定的染色体外维持和长期异位激活，人类基因治疗，1998；91863-1873。序列表<110>THE MURDOCHINSTITUTE<120>重组方法及其所用试剂<130>2219883/TDO<140><141><150>PP6849/98<151>1998-10-30<160>8<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探针/引物<400>1aggtaggatc caccatggat attaatactg aaac 34<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探针/引物<400>2actgaggatc ctcgttttat acctctgaat caatat 36<210>3<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探针/引物<400>3accacatacg ttccgccatt cctatgcgat gcacatgctg tatgccggta caagaaatca 60cagccgaagc70<210>4<211>71<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探针/引物<400>4tgaactgatg gacttatgtc ccatcaggct ttgcagaact ttcagcggta gcgtgatctg 60atccttcaact 71<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探针/引物<400>5atctgggaag tgacggacag 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探针/引物<400>6cagcatcgca accgcatcag 20<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探针/引物<400>7ataagctcat ggagcggcgt aac 23<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述探针/引物<400>8gttccacatt tccatataaa ggcca2权利要求
1.便于在至少两个核苷酸序列之间进行同源重组的方法，所述方法包括通过在足够有利于同源重组至少两个核苷酸序列的条件下培养宿主细胞，以在宿主细胞中诱导所述至少两个核苷酸序列之间的重组，其中所述宿主细胞能表达recBCD和编码外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂或其衍生物的核苷酸序列，外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂的表达是可调制的。
2.根据权利要求1的方法，其中所述两个核苷酸序列是环形核苷酸序列和线性核苷酸序列。
3.根据权利要求2的方法，其中所述环形核苷酸序列含有F-质粒部分。
4.根据权利要求3的方法，其中所述F-质粒部分是BAC。
5.根据权利要求3的方法，其中所述F-质粒部分是PAC。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法，所述外切核酸酶是recE或其功能衍生物，所述重组蛋白质是recT或其功能衍生物。
7.根据权利要求6的方法，其中所述recBCD抑制剂是gam，P22Aba或SSB或其功能衍生物。
8.根据权利要求7的方法，其中所述recBCD抑制剂是gam或其功能衍生物。
9.根据权利要求8的方法，其中编码所述recE，recT和gam的核酸分子与可诱导的启动子可操作相连。
10.根据权利要求9的方法，其中编码所述recE，recT和gam的核酸分子与共有的启动子可操作相连。
11.根据权利要求9或10的方法，其中所述启动子是L-阿拉伯糖启动子。
12.根据权利要求11的方法，其中所述与共有L-阿拉伯糖启动子可操作相连的核酸分子相当于表达质粒pGETrec。
13.根据权利要求1至12中任一项的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
14.根据权利要求13的方法，其中所述大肠杆菌表达recBCD。
15.根据权利要求14的方法，其中所述大肠杆菌是菌株RR1，DM1或DH10B。
16.根据权利要求15的方法，其中所述菌株是DH10B。
17.便于在宿主细胞中同源重组至少两个核苷酸序列的方法，所述方法包括步骤(i)转化宿主细胞，其中被转化的宿主细胞含有第一个核苷酸序列和所述至少两个核苷酸序列，其中第一个核苷酸序列编码外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂或其功能衍生物，而外切核酸酶，重组蛋白质和编码recBCD抑制剂之基因的表达是可调制的；和(ii)在足以表达所述第一个核苷酸序列的条件下将所述经转化的宿主细胞培养一段时间，其中所述第一个核苷酸序列的表达产物便于同源重组所述第二个核苷酸序列与所述第三个核苷酸序列。
18.根据权利要求17的方法，其中所述两个核苷酸序列是环形核苷酸序列和线性核苷酸序列。
19.根据权利要求18的方法，其中所述环形核苷酸序列含有F-质粒部分。
20.根据权利要求19的方法，其中所述F-质粒部分是BAC。
21.根据权利要求19的方法，其中所述F-质粒部分是PAC。
22.根据权利要求17至21中任一项的方法，所述外切核酸酶是recE或其功能衍生物，所述重组蛋白质是recT或其功能衍生物。
23.根据权利要求22的方法，其中所述recBCD抑制剂是gam，P22Aba或SSB或其功能衍生物。
24.根据权利要求23的方法，其中所述recBCD抑制剂是gam或其功能衍生物。
25.根据权利要求24的方法，其中编码所述recE，recT和gam的核酸分子与可诱导的启动子可操作相连。
26.根据权利要求25的方法，其中编码所述recE，recT和gam的核酸分子与共有的启动子可操作相连。
27.根据权利要求25或26的方法，其中所述启动子是L-阿拉伯糖启动子。
28.根据权利要求27的方法，其中所述与共有L-阿拉伯糖启动子可操作相连的核酸分子相当于表达质粒pGETrec。
29.根据权利要求17至28中任一项的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
30.根据权利要求29的方法，其中所述大肠杆菌表达recBCD。
31.根据权利要求30的方法，其中所述大肠杆菌是菌株RR1，DM1或DH10B。
32.根据权利要求31的方法，其中所述菌株是DH10B。
33.产生微生物的方法，所述微生物便于同源重组至少两个核苷酸序列，所述方法包括对宿主细胞进行基因操作，使其能表达recBCD，可调制水平的外切核酸酶，重组蛋白质和编码recBCD抑制剂的基因和所述至少两个其它的核苷酸序列。
34.根据权利要求33的方法，其中所述两个核苷酸序列是环形核苷酸序列和线性核苷酸序列。
35.根据权利要求34的方法，其中所述环形核苷酸序列含有F-质粒部分。
36.根据权利要求35的方法，其中所述F-质粒部分是BAC。
37.根据权利要求35的方法，其中所述F-质粒部分是PAC。
38.根据权利要求33至37中任一项的方法，所述外切核酸酶是recE或其功能衍生物，所述重组蛋白质是recT或其功能衍生物。
39.根据权利要求38的方法，其中所述recBCD抑制剂是gam，P22Aba或SSB或其功能衍生物。
40.根据权利要求39的方法，其中所述recBCD抑制剂是gam或其功能衍生物。
41.根据权利要求40的方法，其中编码所述recE，recT和gam的核酸分子与可诱导的启动子可操作相连。
42.根据权利要求41的方法，其中编码所述recE，recT和gam的核酸分子与共有的启动子可操作相连。
43.根据权利要求41或42的方法，其中所述启动子是L-阿拉伯糖启动子。
44.根据权利要求43的方法，其中所述与共有L-阿拉伯糖启动子可操作相连的核酸分子相当于表达质粒pGETrec。
45.根据权利要求33至44中任一项的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
46.根据权利要求45的方法，其中所述大肠杆菌表达recBCD。
47.根据权利要求45的方法，其中所述大肠杆菌是菌株RR1，DM1或DH10B。
48.根据权利要求47的方法，其中所述菌株是DH10B。
49.便于同源重组至少两个核苷酸序列的细胞，所述细胞含有编码外切核酸酶，重组蛋白质的核苷酸序列和编码recBCD抑制剂的基因，其中外切核酸酶，重组蛋白质和recBCD抑制剂的表达是可调制的，还含有所述至少两个核苷酸序列。
50.根据权利要求49的细胞，其中根据权利要求1至32中任一项所定义的方法进行所述同源重组。
51.通过权利要求1至32中任一项所述的方法同源重组的核酸分子。
52.权利要求51的核酸分子在制备治疗哺乳动物疾病之药物中的用途。
53.权利要求51的核酸分子在诊断哺乳动物疾病中的用途。
54.药物组合物，其含有权利要求51的核酸分子以及一种或多种药物可接受载体和/或稀释剂。
55.便于在宿主细胞中同源重组至少两个核苷酸序列的试剂盒，所述试剂盒含有多个区室，其中适合包含任何一种或多种编码外切核酸酶，重组蛋白质，recBCD抑制剂或其功能衍生物的核苷酸序列，和便于同源重组所用的试剂。
全文摘要
本发明一般涉及重组至少两个核酸序列的方法及其所用试剂。更具体地,本发明涉及在表达recBCD核酶或其功能衍生物的宿主细胞中重组环形核酸序列和线形核酸序列的方法。本发明的方法可特别地用于通过与线形DNA序列同源重组来修饰细菌人工染色体。
文档编号A61K48/00GK1331748SQ99814800
公开日2002年1月16日 申请日期1999年9月29日 优先权日1998年10月30日
发明者P·艾欧安诺, K·纳拉亚南 申请人:默多克研究所