专利名称：防治心脏疾病的方法和试剂的制作方法
防治心脏疾病的方法和试剂技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及防治心脏疾病的方法和试 剂。
背景技术：
心脏病是心脏疾病的总称，包括风湿性心脏病、先天性心脏病、高血压性心脏 病、冠心病、心肌疾病等各种心脏病。心脏病是目前危害人类健康的主要疾病之一。
心脏在受到各种生理刺激，组织损伤或者内分泌失调的情况下会产生肥厚性生 长以维持心脏血输出量。心肌肥厚在功能上是一个初始的适应性反应，但是持续的心肌 肥厚会导致心衰和猝死。心肌肥厚是一个复杂的病理过程，伴随着心肌细胞蛋白含量增 加，胎儿期基因重新表达，心肌细胞骨架重排。微丝骨架在心肌病的发病过程中发挥了 重要的功能，不仅参与维持细胞形态完整性和机械阻力，而且参与了胞外信号向胞内的 传导以调节心肌基因的表达和功能。
微丝骨架的动态变化受到多种微丝结合蛋白的调控。TwinfiKn是一个在进化上 很保守的微丝结合蛋白，在从酵母到哺乳动物的有机体中参与细胞骨架结构及其动态变 化。TwinfiKn与微丝单体高亲和力结合，抑制其结合到微丝增长端。它也可以与另一个 保守的骨架调控子帽子蛋白结合于微丝末端。在细胞内，twinfiKn呈现胞浆弥散定位，并 且聚集于微丝骨架动态区。在出芽酵母中敲除twinfiKn导致皮质微丝斑增多以及双极出芽 方式异常。果蝇twinfiKn基因突变导致依赖于微丝骨架的发育过程缺陷。哺乳动物中有 两个twinfiKn基因。Twinfilin-I (TWF-I)主要表达于非肌肉细胞；而twinfilin-2 (TWF-2) 主要表达于骨骼肌和心肌。在小鼠非肌细胞系中，过表达TWF-I引起应力纤维减少和蠕 虫状异常纤维的出现。在培养的大鼠原代心肌细胞中，TWF-I呈点状胞浆定位，并沿肌 纤维分布。然而，TWF-I在心肌疾病中的调控和功能尚不清楚。
最近，一种新的基因调控子，microRNACmiRNA)被报道在心肌肥厚中发挥重要 功能。MiRNA是一类长18 22碱基的保守的单链非编码RNA。它们通过剪接mRNA 或者抑制mRNA翻译参与基因表达负调控。Dicer是miRNA成熟过程中的一个关键RNase III内切酶。在新生小鼠心肌中特异敲除Dicer导致猝死和轻微的心肌重构，在成年小鼠 心肌中敲除则导致心肌功能失调及肥厚相关基因的表达。最近研究表明一些miRNA，包 括miR-133，miR-208, miR-195，和miR-1主动参与心肌细胞肥厚。其中，miR-1是 一个肌组织特异的miRNA，在心脏的发育和分化过程中发挥重要功能。MiR-I也可通过 调控心肌生长，电传导，钙离子依赖的信号通路参与心肌肥厚。然而，在心肌肥厚过程 中miRNA是否参与心肌细胞骨架调控仍未证实。
因此，本领域还有必要研究心肌肥厚等心肌疾病的发生发展机制，进一步找到 心肌疾病相关的药物靶点，从而为这类疾病的预防或治疗提供行之有效的途径。发明内容
本发明的目的在于提供防治心脏疾病的方法和试剂。
在本发明的第一方面，提供一种TWF-I抑制剂的用途，用于制备预防或治疗心 脏疾病的组合物。
在一个优选例中，所述的TWF-I抑制剂选自特异性干扰twf-Ι基因表达的小 干扰RNA分子或反义核苷酸；或特异性与TWF-I结合的抗体或配体。
在另一优选例中，所述的TWF-I抑制剂是miR-1。
在另一优选例中，所述的TWF-I抑制剂是特异性干扰twf-Ι基因表达的小干扰 RNA分子，其序列如seq ID NO 15所示。
在另一优选例中，所述的组合物用于降低骨骼肌α-肌动蛋白基因(actal)， β-肌球蛋白重链基因(myh7)或心房钠尿肽基因(nppa)的表达。
在另一优选例中，所述的组合物用于减小心肌细胞的大小。
在另一优选例中，所述的心脏疾病是心肌疾病。
在另一优选例中，所述的心脏疾病选自心肌肥厚或心衰。
在本发明的另一方面，提供一种TWF-I的抑制剂，其是一种小干扰RNA分子， 序列如seq ID NO 15所示。
在本发明的另一方面，提供一种miR-1的用途，用于制备抑制twf-Ι基因表达的 组合物。
在一个优选例中，所述的miR-1的序列如下式所示
N1Ugn2AauguaaagaaguauguN3N4N5N6 ；
其中，n1为a或无；n2为g或a ； n3为a或无；n4为u或无；n5为c或u或无；N6为U或无。
在另一优选例中，所述的miR-1的序列如seq ID no 1所示。
在本发明的另一方面，提供一种筛选预防或治疗心脏疾病的潜在物质的方法， 所述方法包括
(1)用候选物质处理表达TWF-I蛋白的体系；和
(2)检测所述体系中TWF-I蛋白的表达或活性；
其中，若所述候选物质可降低TWF-I蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是 预防或治疗心脏疾病的潜在物质。
在一个优选例中，步骤(1)包括在测试组中，将候选物质加入到表达TWF-I 蛋白的体系中；和/或
步骤(2)包括检测测试组的体系中TWF-I蛋白的表达或活性，并与对照组比 较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达TWF-I蛋白的体系；
如果测试组中TWF-I蛋白的表达或活性在统计学上低于(优选显著低于，如低 20%以上，较佳的低50%以上；更佳的低80%以上)对照组，就表明该候选物是预防或 治疗心脏疾病的潜在物质。
在另一优选例中，所述的体系选自细胞体系(如表达TWF-I蛋白的NIH3T3细 胞)(或细胞培养物体系)、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于预防或治疗心脏疾病有用的 物质。
在本发明的另一方面，提供一种预防或治疗哺乳动物心脏疾病的方法，所述方 法包括下调所述哺乳动物体内TWF-I蛋白的表达或活性。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
图1.芯片分析人心脏miRNA表达谱。信号值代表芯片上五次重复的平均值。 图中显示为23个信号值高于4000的miRNA。
图2.MiR_l在骨骼肌和心脏中高表达，并且特异表达在心肌细胞中，而在非肌 肉细胞中几乎没有表达。A，Northern blot检测小鼠各组织中miR-1的表达水平。B， Real-time PCR检测大鼠的各组织中miR-1的表达水平。C，Northernblot检测miR-1在 图中所示各种细胞类型中的表达。ECs，人冠状动脉内皮细胞。SMCs，人冠状动脉平滑 肌细胞。心肌细胞和和成纤维细胞从成年大鼠的心脏中分离得到。D，Real-time PCR分 析miR-1在大鼠心脏心肌细胞和成纤维细胞中的表达。
图3.使用生物信息学预测靶基因。A，miR-1与位于twf_l 3UTR的结合位点 的互补性及结合位点在人、小鼠和大鼠间的保守性分析。MBS，miR-1结合位点。B， Real-time PCR分析在小鼠(左)和大鼠(右)如图所示组织中twf_l和twf_2的表达水平。
图4.TWF-1是miR-1的一个靶基因。A，将包含twf_l或twf_2 3 UTR的荧光素 酶报告质粒与所示miRNA表达质粒共同转染293T细胞进行荧光素酶报告基因实验。转 染M小时后测定荧光素酶活性。B，将twf-1 3 UTR的miR-1互补位点进行点突变，突 变的核苷酸用下划线表示。C，荧光素酶报告基因实验操作同A，报告质粒分别包含野生 型(WT)或突变型twf-1 3 UTR。MBS1+2-MT，两个miR-1结合位点的同时突变。相 对于空载体(vector)，< 0.05, **P<0.01。D，过表达miR-1可降低TWF-1的蛋白 水平，过表达miR-126对TWF-I的蛋白水平没有影响。用表达miR-1 (Lenti-miR-1)或 miR-U6(Lenti-miR_126)的慢病毒感染NIH3T3细胞，挑选稳定表达的克隆。Mock表示 没有感染慢病毒的NIH3T3细胞对照。通过Western blot检测TWF-1，TWF-2及GAPDH 的蛋白水平。
图5.与miR-1的下调相反，TWF_1在肥厚的大鼠心脏中表达升高。对大鼠进 行腹主动脉缩窄(AAC)或假手术6ham) 7天后，分离心脏进行分析。A，Sham及AAC 大鼠心脏的H&E染色。标尺为2mm。B，Real-time PCR分析miR-1在Sham及AAC 大鼠心脏的表达(Sham组η = 8，AAC组η = 9)。与sham组相比，**P < 0.01。C， Northern blot分析miR-1在Sham及AAC大鼠心脏的表达，5.8srRNA为上样量对照。D， Western blot检测TWF-1在AAC大鼠心脏中表达上调。
图6.与miR-1的降低相反，TWF_1在肥大的心肌细胞中表达上调。A，α -actinin染色显示用100 μ mol/L苯肾上腺素(PE)处理48小时后，新生大鼠心肌细胞 肥大。图示为confocal照片。标尺为10 μ m。B，细胞大小的定量分析。从各组中随机选择约200个用anti- α -actinin抗体标记的细胞进行细胞表面积计算。C，Real-time PCR检测PE处理的心肌细胞中miR-1表达水平降低。与对照(Control，未用PE处理的 细胞)相比，*P<0.05，**P<0.01。D，Western blot 检测 TWF-I 在 PE 处理的心肌细胞中表达上调。
图7.过表达miR-1或TWF_1对心肌细胞的影响。用表达miR_l的重组腺病毒 (Ad-miR-1)或对照腺病毒(Ad-vector)感染心肌细胞12小时后用20 μ mol/LPE再处理 36小时，收获细胞进行分析(A-C)。A，在PE处理的新生大鼠心肌细胞中过表达miR-1 减小细胞大小。图示为α -actinin免疫荧光染色的confocal图片，标尺为10 μ m。B， 细胞表面积定量分析。C，定量PCR结果显示miR-1抑制PE处理的心肌细胞中肥厚标 志分子的表达。D，用表达twf-Ι的重组腺病毒(Ad-twf-Ι)或病毒载体对照(Ad-vector) 感染新生大鼠心肌细胞48小时。α -actinin染色表明过表达TWF-I可增大心肌细胞大 小。图示为confocal照片。标尺为10μ m。E，细胞表面积定量分析。F，定量PCR 分析感染Ad-twf-Ι或Ad-vector 48小时后心肌细胞肥厚标志分子的表达。与Ad空载体 相比(Ad-vector)，*P < 0.05，**P < 0.01。
图8.AAC—周后大鼠心脏明显肥厚。A，与sham组相比，AAC组大鼠心重/ 体重(HW/BW)升高。B，定量PCR检测心肌肥厚标志分子表达水平。Gapdh做内参。 结果表示为与sham对照相比的倍数变化值(sham组η = 8，AAC组η = 9)。与Sham 组对比，*Ρ<0.05，*叩<0.01。
图9.在培养的原代心肌细胞中过表达miR-1减小细胞大小。A，ad_miR-l感染 的心肌细胞中miR-1的表达水平约为ad-vector感染的心肌细胞的10倍。B，α -actinin染 色显示在心肌细胞中过表达miR-1减小细胞大小。图示为共聚焦照片。标尺为ΙΟμιη。 C，定量分析心肌细胞表面积。从各组中随机选择约200个用抗α -actinin抗体标记的细 胞进行细胞表面积计算。与Ad空载体相比(Ad-vector)，**P < 0.01。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次揭示了 miR-1可特异性地抑制twf_l基因表达， 并且首次揭示了 TWF-I蛋白的表达与心脏疾病密切相关，其高表达促进心肌肥厚，从而 可诱发心衰等疾病。本发明为心脏疾病的防治提供了新的靶点。
MiR-I
microRNA-l(miR-l)为一种本领域已知的microRNA(miRNA)小分子，其对于调控RNA是有用的。然而，现有技术中对于miR-1结合的靶点目前并不清楚，对其功 能也没有完整的阐述。
miR-i 具有如 N1Ugn2AauguaaagaaguauguN3N4N5N6 (其中，N1 为 α 或无；N2 SG或A; N3为A或无；N4为U或无；N5为C或U或无；N6为U或无)所示 的序列。其可以被分离自细胞，或者可通过人工合成的方式获得。在得知了 miR-1的序 列后，本领域人员可以方便地制备获得miR-1。
TWF-I
Twinfilin-I (简写为TWF-1)是一种现有技术中已知的蛋白，保守地存在于许 多哺乳动物中，属于TwinfiKn家族的成员，主要表达于非肌细胞中。现有技术中对于TWF-I在心肌疾病中的调控和功能尚没有报导。
TWF-I蛋白的序列可以与GenBank登录号NP_03^97.3所示的序列基本上相 同，其编码分子可以与GenBank登录号GeneID 19230所示的序列基本上相同。TWF-I 蛋白或基因可以被分离自细胞，或者可通过人工合成的方式获得。在得知了 TWF-I蛋白 或编码基因的序列后，本领域人员可以方便地制备获得TWF-I蛋白或基因。
MiR-I 的用途
MiRNA参与心肌肥厚的多个方面包括心肌增殖，电传导和纤维化等。然而， miRNA是否参与心肌肥厚过程中心肌细胞骨架调控仍未见报道。通过miRNA芯片和小 RNA文库测序的方法，本发明人确定了心脏和骨骼肌特异的microRNA-l(miR-l)是心 脏表达丰度最高的miRNA。MiR-I主要表达于心肌细胞，在心脏的其他细胞包括心肌 成纤维细胞仅有微量表达。通过生物信息学靶点预测，本发明人确认了细胞骨架调控蛋 白TWF-I是miR-1的一个靶基因。过表达miR-1不仅可以降低包含TWF-13非翻译区 的荧光素酶活性，并且可以降低内源性TWF-I的表达，说明TWF-I是miR-1的直接靶 基因。在大鼠肥厚的心脏左室和苯肾上腺素诱导的肥大的心肌细胞中，miR-1表达显著 下调，与之相对应，TWF-I的蛋白水平表达升高。此外，在肥大的心肌细胞中过表达 miR-1可减小细胞大小，并降低肥厚特异标志分子的表达水平。相反地，在心肌细胞中 过表达twinfflin-Ι可增大细胞大小，并促进肥厚特异标志分子的表达。因此，本发明证 明了细胞骨架调控蛋白TWF-I是miR-1的一个新的靶基因，心脏在受到肥厚性刺激后， miR-1的降低引起TWF-I的表达上调，从而通过调控心肌细胞骨架导致心肌肥厚。
基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种miR-1的用途，用于制备抑制 twf-Ι基因表达的组合物。TWF-I蛋白的高表达可引起心脏疾病(特别是心肌疾病，如 心肌肥厚、心衰等)的发生。因此，很显然，可通过抑制twf-Ι基因表达来达到预防或 治疗这些疾病的目的。
TWF-I抑制剂及其用途
本发明人在深入研究后发现细胞骨架调控蛋白TWF-I是miR-1的直接靶基因。 在心肌肥厚过程中，伴随miR-1的下调，TWF-I表达上调。在心肌细胞中过表达miR-1 可抑制苯肾上腺素(PE)诱导的肥大表型。本发明人还进一步证明了 TWF-I的上调可促 进心肌细胞肥大。
因此，本发明还提供了 TWF-I抑制剂的用途，用于制备预防或治疗心脏疾病的 组合物。所述的心脏疾病特别是心肌疾病。所述的心脏疾病选自但不限于心肌肥厚或心衰。
如本文所用，所述的TWF-I的抑制剂包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂 等。任何可降低TWF-I蛋白的活性、降低TWF-I蛋白的稳定性、抑制TWF-I蛋白的 表达、减少TWF-I蛋白有效作用时间、抑制TWF-I蛋白的分泌、或抑制TWF-I的转 录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于预防或治疗心脏疾病的有效物质。所述的 TWF-I的抑制剂也可以是经过修饰的形式。
在得知了 TWF-I对于心脏疾病的作用后，本领域人员可以方便地得知TWF-I抑 制剂可以通过抑制TWF-I来防治心脏疾病的发生或发展。因此，任何TWF-I的抑制剂 都可用于本发明。根据TWF-I的特性，本领域人员可以获得多种TWF-I的抑制剂。
所述的TWF-I的抑制剂例如包括但不限于特异性结合TWF-I蛋白的抗体或 配体；特异性干扰twf-Ι基因表达的小干扰分子，如siRNA分子、miRNA分子、反义核苷酸等。
作为本发明的优选方式，所述的TWF-I的抑制剂是miR-1 ；或是序列与miR_l 的序列具有80%以上的相同性(较佳地具有85%以上的相同性，更佳地具有90%以上的 相同性，最佳地具有95%以上的相同性，如具有96%、97%, 98%或99%以上的相同 性)的miRNA;或是序列与miR-1序列在严格条件下杂交的miRNA;它们均具有miR-1 相同的功能。如本文所用，所述的“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度 下的杂交和洗脱，如0.2XSSC，0.1% SDS, 600C ；或⑵杂交时加有变性剂，如50% (ν/ν)甲酰胺，0.1%小牛血清/0.1% Ficoll，42°C等;或⑶仅在两条序列之间的相同性 至少在90%以上，更好是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽 与SEQ ID NO 1所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
所述的TWF-I的抑制剂可以是twf-Ι的反义核苷酸。如本文所用，“反义核苷 酸”又称为“反义核酸”或“反义寡核苷酸(AS-ONs，antisense-oligonucleotides) ”或“反义药物”，是指长度约为15-M个碱基的DNA分子、RNA分子它们的经修饰的形式 或它们的类似物，可与mRNA互补。从理论上来讲，根据反义技术获得的反义分子可用 于治疗任何由基因表达或者基因缺失引起的疾病。所述的“反义核苷酸”还包括经修饰 的反义核苷酸，所述的修饰基本不改变反义核苷酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反 义核苷酸的活性、稳定性或治疗效果。对反义核苷酸的修饰包括但不限于甲氧基化修 饰、锁核酸修饰、肽核酸修饰、硫代修饰、磷酸骨架由磷脂连接骨架代替。
作为本发明的优选方式，所述的TWF-I的抑制剂是特异性针对于TWF-I的 mRNA的小干扰RNA (siRNA)。 如本文所用，术语“ RNA干扰(RNAtaterference， RNAi) ”是指一些小的双链RNA可以高效、特异地阻断体内特定基因表达，促使mRNA 降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，也被称为RNA干预或者RNA干扰。RNA 干扰是高度特异的在mRNA水平上的基因沉默，它是体内抵御外在感染的重要保护机制 之一。简要地说，RNA干扰包含一个由小型干扰RNA(SiRNA)所激发的机制，造成靶 mRNA的降解。如本文所用，术语“小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA) ”是指 一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA， 这个过程就是RNA干扰途径(RNA interference pathway)。
作为本发明的特别优选的方式，提供了一种效果良好的twf-Ι的小干扰RNA分 子，所述的小干扰RNA分子具有SEQ ID NO 15 (GGGAAAUACCGACUUCUAA)所示的序列。可特异性的干扰twf-Ι基因的表达，干扰效果良好。
本发明对小干扰RNA的制备方法没有特别的限制，包括但不限于化学合成 法，体外转录法等。应理解，本领域技术人员在得知了本发明所提供的siRNA的序列以 后，可以以各种途径方便地制备或表达所述的小干扰RNA。例如，在本发明的一种优选 例中，所述的小干扰RNA是化学合成的。
小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这 两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反 义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。
所述的小干扰RNA可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本 领域已知的多种技术被输送到细胞内。
此外，小干扰RNA包含的正义链和反义链可通过一个或多个编码正义链和反义 链的表达盒来制备。当正义链和反义链由一个单独的表达盒编码时，它们可以从生成的 转录物中断裂形成分离的正义链和反义链，其后杂交生成双链小干扰RNA。
筛选方法
在得知了所述的TWF-I与心脏疾病的相关性后，可以基于该特征来筛选调节 TWF-I的表达或活性，进而可预防或治疗心脏疾病的物质。
因此，本发明提供一种筛选可用于预防或治疗心脏疾病的潜在物质的方法，所 述的方法包括将候选物质与表达TWF-I的体系接触；和检测候选物质对TWF-I的影 响；若所述候选物质可降低TWF-I的表达或活性，就表明该候选物是预防或治疗心脏疾 病的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到TWF-I的 表达或活性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达 TWF-I的体系。
本发明还提供一种筛选预防或治疗心脏疾病的潜在物质的方法，所述方法 包括将候选物质与包含miR-1和TWF-ImRNA的体系接触，并检测miR-1与 TWF-ImRNA的结合情况；如果miR-1与TWF-ImRNA的结合在统计学上低于对照组， 就表明该候选物是预防或治疗心脏疾病的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛 选时，为了更易于观察到miR-1与TWF-ImRNA的结合的改变，还可设置对照组，所述 的对照组可以是不添加所述候选物质的包含miR-1与TWF-ImRNA的体系。
所述的体系包括(但不限于)溶液体系、亚细胞体系、细胞体系、组织体系、 器官体系、或动物体系。
作为本发明的优选方式，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的 细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于预防或治疗心脏疾病真正有用的物 质。
另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于预防或治疗心脏疾 病的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛 选出真正有用的物质。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有有效量的所述的 TWF-I抑制剂，以及药学上可接受的载体。
所述“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如 毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。
所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物 所接受的量。
所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀 释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过 分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’ s PharmaceuticalSciences (Mack Pub.Co., N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体 中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
本发明的TWF-I抑制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度 等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例 如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于TWF-I抑制剂的药代动力学参数例如 生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病、患者的体重、患者的免疫状况、 给药的途径等。通常，当本发明的TWF-I抑制剂每天以约O.OOl-lOOmg/kg(优选的为 0.01-20mg/kg)动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以2-4次 分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为 0.005-100mg,较佳地约为0.008-50mg。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如， 由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
任何适用的给药途径都是可以的，包括但不限于口服、静脉内注射、皮下注 射、肌肉给予、局部给予、植入、缓释给予、心脏内给予等；优选的，所述给药方式是 非肠道给予的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按 照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的 意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文 中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
I.材料和方法
RNA 制备
人心脏总RNA购于Ambion，Inc.,小鼠、大鼠组织以及培养细胞的总RNA用 TRIzol (Invitrogen)抽提。
MiRNA 芯片
MiRNA 表达谱通过人 miRNA 芯片(LC Sciences，Houston，TX)测定。该芯片 包括 718 个人的成熟 miRNA 探针 Manger miRBase, release 10.1)。
小RNA文库构建
小RNA克隆文库构建用15%的变性聚丙烯酰胺胶电泳分离人心脏总 RNA,回收长度在18-到25-nt范围内的RNA。 将回收产物连接一个5末端磷酸 化的 3 接头(5pUUUaaccgcgaattcoigx 大写，RNA;小写，DNA ； p，磷酸；x， 3_ 氨基-修饰 C-7)和一个 5 接头(5ac^ggaattcctcactAAA 大写，RNA ；小写， DNA)。用 3 引物(5-GACTAGCTGGAATTCGCGGTTAAA6EQ ID NO 3))和 5 引物 (5-CAGCCAACGGAATTCCTCACTAAA(SEQ ID NO 4))进行 RT-PCR。回收后，PCR 产物的3端用Taq酶在72°C处理15分钟加A，缓冲液为标准PCR反应液。将产物稀释3倍后直接连入T载体(购自Takara)。随机挑选克隆通过PCR验证有插入片段，并送公 司测序。
Northern Blot 检测 miRNA
取40 μ g总RNA进行15 %的聚丙烯酰胺胶电泳，转至Hybond_N+ (Amersham ^osciences)尼龙膜。紫外交联后预杂交30分钟，继而用Y-32P标记的特异探针杂交12 小时。洗去探针，洗两次，每次10分钟，然后在-80°C X-ray胶片曝光。
定量 PCR (RT-PCR)
组织及细胞的总RNA用Super Script II反转录为cDNA，以oligo-dT为引物反转 录mRNA，用特异茎环结构引物反转录miRNA。用SYBR Green(TOYOBO Co)的方法进 行实时定量PCR。
生物信息学分析
MiR-I潜在靶基因预测用miRanda算法(参见John B等，Human MicroRNAtargets.PLoS Biol.2004 ； 2(11) e363.分析。mRNA3 非翻译区(UTR)的 miR-1 结合位点通过 RNA-hybrid (参见 Rehmsmeier M 等，Fast and effective prediction oftnicroRNA/target duplexes.Rna.2004 ； 10(10) 1507-1517.程序预测。
质粒构建及特异位点突变
以人基因组DNA为模板，通过PCR扩增miR_l (上游弓丨物 GCAGATCTCTTCTCTACATCGCAGTG(SEQ ID NO 5)；下游弓 | 物GAGATC TTTTTGTCCACCAACGCCCAGGC^SEQ ID NO 6))或 miR_U6 (上游弓 | 物 GCAGATCTTTGCCCGGAGCCTCATATC (SEQ ID NO 7)；下游引物CGAAGCTTTTT CAGAGGTCTCAGGGCTATGC (SEQ ID NO 8))的前体序列，将 PCR 产物分别以 BglII/ BglII和Bglll/Hindlll酶切后装入psuper载体(购自Ambion)，构建过表达质粒。
荧光素酶报告基因质粒构建如下以小鼠基因组为模板，通过PCR扩增 twf-Ι (上游引物GCCCTAGGTGAGCTGACTGCGGATT 6EQ ID NO 9)；下游引物 GCCCTAGGTCGTTAGTAGGGTTACAGGATC (SEQ ID NO 10))或 twf_2 (上游引物 TTGGGTACCGCCACAAGCGCCTCATCC (SEQ ID NO 11)；下游弓丨物GCCGAGAT CTAATACAGCATTCAACCATCCCTTC (SEQ ID NO 12))的全长 3UTR，分别以 AvrII/ AvrII和KpnI/Bglll酶切后，装入PGL3载体(购自Promega)荧光素酶基因的3UTR。
Twf-I 3 UTR中miR_l结合位点突变的荧光素酶报告基因质粒采用QuikChange site-directed mutagenesis 试齐Ll盒(Stratagene)定点突变。
细胞培养
人原代冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)，内皮细胞(HCAEC)，人脐静脉内皮 细胞(HUVEC)购于Cascade Biologies :tnc.Oregon，USA。细胞培养用由生产厂商提供的 添加生长因子的特殊培养液。293T，293A，293FT和NIH3T3 (分别购自ATCC)用添加 10%胎牛血清的 Dubecco，s modified Eagle，s medium(DMEM)培养。
荧光素酶报告基因试验
将荧光素酶报告质粒和miRNA表达质粒共同转染细胞，转染M小时后收 获细胞，用双荧光素酶检测试剂盒(Promega)检测荧光素酶活性。荧光素酶检测仪型号 为 Lumat LB9507
Western Blot
Western blotting具体操作流程按照常规方法。Anti-TWF-I和anti-TWF_2的抗体 制备见参考文献(Vartiainen MK 等，Mammals have two twinfilinisoforms whose subcellular localizations and tissue distributions are differentiallyregulated.J Biol Chem.2003 ； 278 (36) 34347-34355.)。Anti-GAPDH 抗体购于 GenScript。
大鼠心肌肥厚模型
以体重为150-180克雄性Sprague-Dawley大鼠为实验动物，采用腹主动脉缩窄 (AAC)制作大鼠心肌肥厚模型(参见 Ruetten H 等，Concentric leftventricular remodeling in endothelial nitric oxide synthase knockout mice bychronic pressure overload.Cardiovasc Res.2005 ； 66(3) 444-453.。简言之，用水合氯醛(0.2mg/g)麻醉大鼠，开胸后分离腹 主动脉，用4-0尼龙绳将之束缚于M号枕头。取出针头后缝合切口。假手术组⑴虹！!!) 对照包括除了动脉缩窄的其他手术操作。手术后给大鼠连续注射3天青霉素，每天2次。 手术1周后处死大鼠。
组织学分析
取sham和AAC组大鼠心脏，用4%多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋。石蜡切片 (4ym)后用苏木精&伊红染色(Η&Ε)，观察分析。
腺病毒和慢病毒构建
重组腺病毒的构建，扩增和滴度测定如文献所述(参见He TC等，Asimplified system for generating recombinant adenoviruses.Proc Natl Acad Sci U SA. 1998 ； 95(5) 2509-2514.)。 以 GCCTCGAGAGCAGAGTGGCATTGATGG (SEQID NO : 13)和 AAGCTTGAAGGTCACCCTCCTGGAA (SEQ ID NO : 14)为引物，从大鼠基因组 DNA 扩增miR-1的前体序列，以Xhol/Hindlll酶切后装入pAcffl"ack-CMV载体(Qbiogene， USA)构建 ρAcffl^ack-CMV-miR-1 质粒。从质粒 pPL144(参见 Vartiataen MK 等， Mammals have two twinfilin isoforms whosesubcellular localizations and tissue distributions are differentially regulated.J BiolChem.2003 ； 278 (36) 34347-34355.)上酶切下小鼠 twf-1 cDNA 片段装入 pAcffl"ack-CMV 载体 Kpnl/Hindlll 酶切位点构建 pAdTrack-CMV-twf-1。 将 ρAcWrack-CMV-miR-1 或 pAdTrack-CMV-twf-l 与 ρAdEasy (购自 Qbiogene，USA)同 时转化BJ5183菌株重组产生ad-miR-1和ad_twf-l病毒载体。用Pac I线性化后，转染 293A细胞包装重组腺病毒。病毒滴度用病斑形成实验测定。
慢病毒构建以改造过的pLentiLox 3.7载体(参见Sun C等，SIRTl improvesinsulin sensitivity under insulin-resistant conditions by repressing PTPlB.CellMetab.2007 ； 6 (4) 307-319)为骨架，将miR-1或miR-126的前体序列克隆入该载体的BamHI/XhoI位 点，与包装质粒 VSVG 和 Δ 8.9 (参见 Sun C 等，SIRTlimproves insulin sensitivity under insulin-resistant conditions by repressing PTPlB.Cell Metab.2007 ； 6(4) 307-319)共转染 入细胞包装过表达miR-1或miR-126的病毒。
原代心肌细胞培养及腺病毒感染
新生大鼠心肌细胞分离于1-3天的Sprague-Dawley大鼠。分离心脏，用0.2%的 胰酶在37°C摇床上(IOOrpm)消化。细胞分散后首先通过离心富集心肌细胞，然后通过差 速贴壁进一步去除非肌细胞。用添加BrdU的含20%胎牛血清的DMEM，以3_5X IO5/ml的密度将心肌细胞铺入培养板。铺板48小时后，改为无血清培养，用感染复数(MOI) 为100的腺病毒感染心肌细胞。48小时后，收获细胞，进行形态学观察，RNA或蛋白表 达分析。
成年Sprague-Dawley大鼠的心肌细胞和成纤维细胞用Langendorff方法分离。大鼠麻醉后迅速取出心脏，在含Ca2+的Krebs-Henseleit(KH)溶液中洗5分钟，再用没有 Ca2+的KH溶液终止心脏自发收缩。用含0.05%胶原酶的KH溶液灌流20分钟，然后分 离心室，在KH溶液中剪碎。孵育20分钟后，用尼龙筛过滤细胞上清。而后在含6%牛 血清白蛋白的199培养液中沉淀，将心肌细胞从其它细胞中分离出来。心脏呈纤维细胞 分离。
细胞免疫荧光及细胞表面积分析
4%多聚甲醛细胞固定15分钟后用0.1% Triton X-100通透15分钟，5%山羊血清 室温封闭1小时，以1 500稀释度加入anti-α -actinin抗体6igma) 4°C孵育过夜。用 PBS洗三遍后加入Alexa-555 (Molecular Probes)标记的二抗，室温孵育1小时。细胞核 用 4，6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)标记，最后封片。细胞表面积用软件 AxioVision 4.7.1 (Carl Zeiss, Inc)进行计算。Confocal 照片用 Olympus confocal microscope(FVlOOO) 拍摄。
统计学分析
所有的试验重复了至少三次。数据以平均值士标准误表示。对于相对基因表达 分析，对照组的平均值定义为1。用非配对Student’ st test进行数据统计分析。^igma plot程序用于数据分析。P <0.05为显著差异。
II.实施例
实施例1、人心脏miRNA表达谱分析
关于哪个miRNA在心脏表达丰度最高，以往不同实验室的研究结果有所不同。 因此，本发明人用小RNA芯片的方法进行了人心脏总RNA中miRNA的表达谱分析。在 检测的718个人miRNA中，只有236个miRNA被检测到。在检测到的miRNA中，信 号值在1000以上的41个为心脏表达丰度较高的miRNA。图1显示了信号值高于4000的 23个miRNA。其中，miR-1信号值最高，说明miR-1为心脏中表达量最高的miRNA。 几个miRNA家族包括let-7，miR-26, miR_U6和miR-133表达丰度也较高。
实施例2、心脏富集的miRNA鉴定及心脏miRNA序列末端异质性
为验证心脏富集的miRNA，本发明人用人心脏总RNA构建了一个小RNA文 库，并测序所得到的小RNA克隆。在测序的251个克隆中，113个为已知miRNA 序列，其余小RNA克隆为rRNA，tRNA，mRNA以及人基因组重复序列片段(数据未显 示)。在miRNA克隆中，本发明人确定了 27个不同的miRNA，其中15个克隆到多次， 其余12个仅克隆到一次。克隆所得的大多数miRNA(22/27)都在上文的芯片数据结果的 高丰度miRNA列表中，说明通过两种方法所得结果的一致性。重要的是，miR-1的克隆 数占总miRNA克隆数的对％ (27/113),说明至少在本发明人的研究中miR-1确实是心 脏丰度最高的miRNA。
进一步分析表明，与miRBase(release 13.0)中miRNA的成熟序列相比，本发明人克隆到的miRNA具有丰富的序列多态性，包括3和5末端碱基删除或延长。部分序列变异见表1。例如，27个miR-1克隆的5个在3末端AU缺失，2个在5末端多一个A。 MiR-126最普遍的变异体是5末端的U缺失。总体上，3末端变异06.9% )远远高于5 末端变异(21.2%)；当A或U为最末端碱基时3末端碱基缺失更为突出。
表 1MiRNA序列5’至3’克隆数SEQ ID NO:
权利要求
1.一种TWF-I抑制剂的用途，用于制备预防或治疗心脏疾病的组合物。
2.如权利要求1的用途，其特征在于，所述的TWF-I抑制剂是miR-1。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的TWF-I抑制剂是特异性干扰twf-1 基因表达的小干扰RNA分子，其序列如SEQ ID NO: 15所示。
4.如权利要求1的用途，其特征在于，所述的心脏疾病是心肌疾病。
5.如权利要求1的用途，其特征在于，所述的心脏疾病选自心肌肥厚或心衰。
6.—种TWF-I的抑制剂，其是一种小干扰RNA分子，序列如SEQID NO: 15所示。
7.一种miR-1的用途，用于制备抑制twf-Ι基因表达的组合物。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的miR-1的序列如下式所示 N1Ugn2AauguaaagaaguauguN3N4N5N6 ；其中，N1SA或无；N2 SG或A ； N3SA或无；N4为U或无；N5为C或U或 无；N6SU或无。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的miR-1的序列如SEQIDNO : 1所示
10.一种筛选预防或治疗心脏疾病的潜在物质的方法，所述方法包括(1)用候选物质处理表达TWF-I蛋白的体系；和(2)检测所述体系中TWF-I蛋白的表达或活性；其中，若所述候选物质可降低TWF-I蛋白的表达或活性，则表明该候选物质是预防 或治疗心脏疾病的潜在物质。
全文摘要
本发明涉及防治心脏疾病的方法和试剂。公开了一种TWF-1抑制剂的用途，用于制备预防或治疗心脏疾病的组合物；还公开了miR-1的用途，用于制备抑制twf-1基因表达的组合物；还公开了筛选预防或治疗心脏疾病的潜在物质的方法。本发明首次揭示了miR-1可特异性地抑制twf-1基因表达，并且首次揭示了TWF-1蛋白的表达与心脏疾病密切相关，从而为心脏疾病的防治提供了新的靶点。
文档编号A61P9/00GK102018959SQ20091019539
公开日2011年4月20日 申请日期2009年9月9日 优先权日2009年9月9日
发明者宋晓伟, 李青, 荆清, 邹俊 申请人:中国科学院上海生命科学研究院